先天性免疫系统是鱼类抵御病原体入侵的第一道防线，由能够识别病原相关的分子模式(pathogen- associated molecular patterns, PAMPs)的模式识别受体介导(pattern recognition receptors, PPRs)(MacLeod et al, 2017)。根据PRRs结构、位置和分泌等特征，PRRs可分为膜结合受体[如Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)、C型凝集素等]、胞内受体(如NOD样受体、RIG样受体等)及分泌型受体(如甘露糖结合凝集素、脂多糖结合蛋白) 3种类型(Lee et al, 2007)。其中，TLRs可识别多种病原体表达的脂类、碳水化合物、肽和核酸结构，是最早且研究最为广泛的受体之一(Rebl et al, 2010)。

TLR家族成员在进化过程中保守，由3个经典结构域组成：跨膜(transmembrane, TM)结构域、富含亮氨酸(leucine-rich repeat, LRR)结构域和Toll/白介素-1受体(toll/IL-1 receptor, TIR)结构域。LRR结构域参与配体识别和结合，TIR结构域与衔接蛋白[如诱导干扰素-β适配器(toll/IL-1 receptor domain-containing- adaptor inducing IFN-β, TRIF)、髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)衔接样蛋白]相互作用触发信号级联反应，以诱导机体产生免疫反应(Wang et al, 2018; Shan et al, 2018)。根据Roach等(2005)的分类，TLRs被分为TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11六个亚家族。目前，在哺乳动物中共发现13种TLRs成员(TLR1~13)，而在鱼类中已发现20多种，其中TLR5s、TLR18~20和TLR22~27是鱼类所特有的(Zhang et al, 2014)。鱼类TLRs种类增加的原因尚未可知，可能是其为适应水生养殖环境中存在的复杂的多种病原体(Liang et al, 2018)以及不同类型的TLR家族具有识别不同PAMPs的特点(Chaturvedi et al, 2009; Baoprasertkul et al, 2007)。例如，TLR2和TLR4识别革兰氏阴性菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)；TLR5识别细菌鞭毛蛋白(Baoprasertkul et al, 2007; Voogdt et al, 2018)。TLR13属于TLR11家族，小鼠(Mus musculus) TLR13能够识别细菌23S核糖体RNA (rRNA)中保守的核苷酸序列(5´-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3´)，并激活MyD88依赖的信号通路，诱导炎性细胞因子消除病原体(Valenzuela-Muñoz et al, 2016; Vidya et al, 2018)。鱼类TLR13的相关报道主要围绕TLR13保护机体免受细菌或病毒侵袭相关功能进行研究，例如，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)脾细胞(grouper spleen cells, GS)受到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的23S rRNA刺激后，其TLR13表达量均呈上调趋势(Liang et al, 2018; Yu X et al, 2021)；小黄鱼(Larimichthys polyactis)在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激36 h后，其TLR13在脾脏的表达水平显著上调，且其白细胞受到聚肌胞苷酸[Polyinosinic: polycytidylic acid, Poly(I: C)]刺激后也表现出了表达上调(Wang et al, 2016)。

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是重要的海水经济鱼类之一，主要分布在印度洋、太平洋和大西洋等海域，因其生长速度快、肉质细嫩肥美、肌间无刺、经济效益高等优点受到大众的喜爱(李远友等, 2019)。近年来，卵形鲳鲹海水养殖规模不断扩大，在高密度养殖过程中易受到病原微生物感染[如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)]，造成严重的经济损失(Cai et al, 2017; Zhou et al, 2020)。作为宿主抵御病原体入侵的第一道防线，了解鱼类先天性免疫的作用机制将有助于制定绿色高效措施，防控细菌性疾病暴发。本研究克隆了卵形鲳鲹TLR13的开放阅读框(open reading frame, ORF) (命名为ToTLR13)，利用生物信息学分析其序列特征，采用实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)检测其在细菌感染后免疫相关组织中的表达谱变化规律，并观察其在细胞中的亚定位。研究结果将为鱼类TLR13功能的研究奠定基础。

RNA提取试剂(Trizol、氯仿、无水乙醇、75%乙醇和RNase-free水)、cDNA合成试剂盒和荧光定量试剂盒购自苏州近岸蛋白科技股份有限公司。无乳链球菌和溶藻弧菌菌种由本实验室保种。所用的大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、pMD18-T载体、DNA Marker、Premix Taq酶、Quick限制性内切酶购自TaKaRa公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。Lipofectamine^TM 3000 Reagent试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。1×PBS缓冲液(pH 7.2)、4%多聚甲醛、0.1% Triton-100、抗荧光衰减封片剂、DAPI溶液购自索莱宝科技(北京)有限公司。人非小细胞肺癌细胞(human non-small-cell lung cancer cells, A549)和pEGFP-N1绿色荧光质粒载体由本实验室保存。

130尾健康卵形鲳鲹购自广西钦州市三娘湾鸿钰水产科技有限公司，平均体质量为(50±5) g。实验前，将健康卵形鲳鲹于室内2 000 L水箱中暂养15 d，水温保持在(25±1) ℃，每日监测鱼体健康状况。随机取3条健康卵形鲳鲹，用MS-222麻醉后，各取8个不同组织(心脏、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉)装入1.5 mL无酶管中，立即投入液氮暂存后转入–80 ℃冰箱保存，用于后续基因克隆和表达分析。

将无乳链球菌和溶藻弧菌分别接种于10 mL Luria-Bertani肉汤(LB)培养基中，放置于37 ℃和28 ℃摇床200 r/min震荡培养。培养后离心收集细菌，PBS洗涤3次，并用PBS调整浓度备用。将120尾健康卵形鲳鲹分为对照组、无乳链球菌实验组和溶藻弧菌实验组，每组40尾。3组鱼分别腹腔注射100 μL的PBS、3.4×10⁷ CFU/mL无乳链球菌和2.75×10⁷ CFU/mL溶藻弧菌。每组分别于注射后0、6、12、24、48、72和96 h取3尾鱼，取鳃、脾、肝和肾4个组织置于1.5 mL无酶管中，立即投入液氮暂存后转入–80 ℃冰箱保存，用于后续的表达分析。

使用ORF finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测本实验室卵形鲳鲹脾脏转录组测序结果中TLR13基因ORF，并设计特异性引物ToTLR13-F和ToTLR13-R (表 1)扩增该基因ORF序列。按照TransZol Up说明书从鳃中提取总RNA，用1%琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000 (Thermo)检测总RNA的质量和浓度。按照cDNA合成说明书将总RNA反转录成第一链cDNA，并储存在–80℃冰箱以备后续使用。

表 1(Tab.1)

表 1 实验所用引物 Tab.1 Primers used in the study 引物Primer 引物序列Primer sequences(5′~3′) 目的Purpose ToTLR13-F ccaagcttATGCATCATCTTCCCTCTCTCTT ORF扩增 ORF amplification ToTLR13-R cgggatccTTAGTCTTCAGGCTGATCGTCCT M13-F GTAAAACGACGGCCAG 菌落鉴定 Colony PCR M13-R CAGGAAACAGCTATGAC RT-ToTLR13-F CTGCCCCTTATCCT CGGAAT 荧光定量 RT-qPCR RT-ToTLR13-R TCTTCAGGCTGATCGTCCTC β-actin-F GAGACAGTAATGTTTTTGGCTAGGT β-actin-R CATACAAGCGATACTACAACCATGT

表 1 实验所用引物 Tab.1 Primers used in the study

以鳃cDNA为模板，利用ToTLR13-F和ToTLR13-R引物(表 1)扩增ToTLR13基因ORF序列。扩增体系：cDNA 4 μL，引物ToTLR13-F/R各2 μL，Premix Taq酶24 μL，H₂O 14 μL，反应条件：94 ℃ 4 min；35次循环(94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)；72 ℃ 10 min；16 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收纯化PCR产物。将PCR产物连接至pMD18-T载体构建pMD18-ToTLR13重组质粒，并转化至E. coli DH5α。使用M13-F和M13-R引物(表 1)进行菌落PCR鉴定，将阳性菌落送至江苏东玄基因科技有限公司进行测序验证。

根据所测得的序列用下列方法进行生物信息学分析。ExPASy Proteomics Server (http://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质理论等电点、分子量和亲水性等信息的推测；蛋白质的跨膜结构域预测利用TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对分析；使用SignalP-5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽序列预测；运用Softberry-Psite进行氨基酸基本功能位点布预测；NCBI Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白保守结构域；利用SWISSM-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模分析。结合Clustal X和GeneDoc软件，对氨基酸序列进行多重比对分析；利用MEGA7.0软件构建系统进化树。

按照1.3.1提取总RNA和反转录第一链cDNA的方法，提取心脏、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉组织的cDNA模板。利用RT-qPCR技术分析健康卵形鲳鲹和病原菌刺激后各组织ToTLR13 mRNA的表达情况，每个反应重复3次，以β-actin作为内参。引物RT-ToTLR13-F/RT-ToTLR13-R和β-actin-F/β-actin-R序列见表 1。扩增体系为10 μL：cDNA 1 μL、2×NovoStrat^® SYBR qPCR SuperMix Plus 5 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、RT-ToTLR13-F/RT-ToTLR13-R或β-actin-F/β-actin-R各0.4 μL、RNase free水3 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；(95 ℃ 5 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 10 s) 40个循环；95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后用QuantStudio^TM 6 Flex Real-Time PCR System软件进行检测，选用3个重复熔解曲线相似单峰的C_t值。

将pMD18-ToTLR13和pEGFP-N1质粒分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ限制性内切酶进行酶切纯化后，用T4连接酶将ToTLR13连接至pEGFP-N1质粒，构建重组质粒pEGFP- ToTLR13。利用无内毒素质粒提取试剂盒(天根)分别提取pEGFP-ToTLR13和pEGFP-N1质粒，使用NanoDrop 2000 (Thermo)检测浓度后，放置–20 ℃冰箱备用。

取200 μL浓度为1×10⁶个/μL的生长状况良好的A549细胞，平铺在放置有细胞爬片的24孔细胞培养板中，5% CO₂培养箱中37 ℃培养24 h，细胞铺满70%~80%时进行转染。按照Lipofectamine^TM 3000 Reagent试剂盒(赛默飞世尔, 中国)说明书进行转染，设置pEGFP-N1作为空载对照，pEGFP-ToTLR13作为实验组。转染24 h后，弃培养液，使用500 μL 1×PBS清洗3次后，使用4%多聚甲醛固定30 min；弃多聚甲醛后，1×PBS清洗3次，使用0.1% Triton X-100透化细胞7 min；透化后1×PBS清洗3次，0.5 μg/mL DAPI避光染色10 min。最后，用1×PBS漂洗3次后，用镊子将细胞爬片从24孔板中取出，倒扣在滴有玻片固定液的载玻片上。使用激光共聚焦显微镜(Olympus, FV10i, 日本)检测并拍照。

采用SPSS软件的ANOVA和Tukey’s分析RT-qPCR结果。利用t检验对数据进行比较，差异显著性的判断标准为P < 0.05，差异极显著的判断标准为P < 0.01。

利用PCR方法成功扩增得到ToTLR13的ORF序列(GenBank登录号：ON365560)。结果显示，ToTLR13 ORF序列为1 269 bp，编码422个氨基酸，分子量为48.09 kDa，等电点为8.13(图 1)。蛋白质结构域预测结果显示，ToTLR13含有1个TM结构域、5个LRR结构域和1个C端TIR结构域(图 1)。通过SignalP-5.0 Server预测该序列1~15为信号肽区域，信号肽剪切位点在第15~16个氨基酸之间(图 1)。运用Softberry预测得到该基因基序包括5个LRR结构域(78VDM-LDI148)，4个微体C-末端定位信号序列(54SIK56、264SSR266、314SSR316和340SLR342)，3个N-肉豆蔻酰化位点(29GQGIGN34、145CTLPNG150和408GGGRGG413)，3个络蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(16ILE18、200SYEE203和213SVMD215)，1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点(375RKKT378)。

图 1(Fig. 1)

图 1 卵形鲳鲹ToTLR13核苷酸序列及推测的氨基酸序列 Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of ToTLR13 in T. ovatus 黄色为信号肽；红色为LRR结构域；蓝色为跨膜结构域；绿色为TIR结构域。 Signal peptide is marked in yellow; The LRR domains are marked in red; The transmembrane domain is marked with blue; The TIR domain is marked in green.

ToTLR13蛋白半衰期为30 h，不稳定系数为42.83，将该蛋白质归类为不稳定蛋白质。经过亲水性预测得到，第405位氨基酸的指数是–2.85，为最大亲水性；而第225位氨基酸达到最大疏水性，指数为3.35，总平均亲水性系数为–0.021，归类为亲水性蛋白(图 2)。通过SWISS-MODEL和PyMOL软件对卵形鲳鲹和小鼠、大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13的LRR结构域和TIR结构域进行三级结构模拟和叠加。结果显示，卵形鲳鲹和大黄鱼TLR13的LRR结构域分别具有3个和2个β折叠，TIR结构域都具有5个α螺旋和4个β折叠，而小鼠TLR13的LRR结构域有3个β折叠，TIR结构域具有10个α螺旋和8个β折叠(图 3和图 4)。卵形鲳鲹与小鼠、大黄鱼TLR13的功能结构域三级结构高度重合，表明不同物种的TLR13的结构和功能具有一定的相似性。

图 1(Fig. 1)

图 2 ToTLR13疏水性预测 Fig.2 Hydrophobicity prediction of ToTLR13

图 1(Fig. 1)

图 3 卵形鲳鲹、小鼠和大黄鱼TLR13的LRR结构域三级结构预测 Fig.3 Predicted 3D structure of LRR domain of TLR13 in T. ovatus, M. musculus, and L. crocea

图 1(Fig. 1)

图 4 卵形鲳鲹、小鼠和大黄鱼TLR13的TIR结构域三级结构预测 Fig.4 Predicted 3D structure of TIR domain of TLR13 in T. ovatus, M. musculus, and L. crocea

通过与NCBI数据库中的其他物种的TLR13氨基酸序列进行比对，发现ToTLR13与其他硬骨鱼的TLR13具有高度的相似性，与杜氏(Seriola dumerili)、许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和射水鱼(Toxotes jaculatrix)相似性分别为84.58%、82.53%和82.52%(图 5)。而与哺乳动物、两栖类和贝类TLR13序列相似性较低，与小鼠、家兔(Oryctolagus cuniculus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)和青蛤(Cyclina sinensis)相似性分别为33.30%、33.51%、34.35%和46.11%。运用Clustal X 2.0和MEGA7.0软件，采用N-J法构建系统进化树发现，ToTLR13和其他硬骨鱼的TLR13亲缘关系较为相近，聚为一支，与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近，而与其他哺乳类、两栖类和双壳类各自聚为一支(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 5 卵形鲳鲹ToTLR13与其他物种TLR13氨基酸序列比对 Fig.5 Multiple alignments of ToTLR13 amino acid sequence of T. ovatus with other species 深蓝色标记的序列高度一致，粉色标记的序列较为相似，蓝绿色标记的序列相似度较低；红色方框为LRR结构域，蓝色方框为TM结构域，绿色方框为TIR结构域。 The same sequences are marked with dark blue, the similar sequence are marked with pink, and the sequences with relatively low similarity are marked with blue-green; the LRR domains are marked with red box, the TM domains are marked with blue box, and the TIR domains are marked with green box.

图 1(Fig. 1)

图 6 N-J法构建TLR13氨基酸系统进化树 Fig.6 Phylogenetic tree of TLR13 constructed by neighbour-joining method 氨基酸序列GenBank号：杜氏(XP_022598134.1)；射水鱼(XP_040922374.1)；花鲈(QDE10488.1)；大黄鱼(KAE8284326.1)；许氏平(QXJ40778.1)；鞍带石斑鱼(XP_0033467894.1)；卵形鲳鲹(ON365560)；热带爪蟾(XP_002935047.2)；小鼠(EDL14060.1)；穴兔(XP_002720271.2)；西印度海牛(XP_012411715.1)；虎鲸(XP_012392423.1)；青蛤(AIZ97750.1)。 Amino acid sequence GenBank number: S. dumerili (XP_022598134.1); T. jaculatrix (XP_040922374.1); Lateolabrax maculatus (QDE10488.1); L. crocea (KAE8284326.1); S. schlegelii (QXJ40778.1); E. lanceolatus (XP_0033467894.1); T. ovatus (ON365560); Xenopus tropicalis (XP_002935047.2); M. musculus (EDL14060.1); O. cuniculus (XP_002720271.2); Trichechus manatus (XP_012411715.1); Orcinus orca (XP_012392423.1); C. sinensis (AIZ97750.1).

ToTLR13在健康卵形鲳鲹各组织中的表达情况见图 7。结果显示，ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心脏、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉组织中均有表达，其中，在鳃组织中表达量最高，是肌肉的64.1倍(P < 0.01)。其次，在脾、脑、肝和肾中的表达量呈逐渐降低的趋势，而在心脏和头肾中的表达量相对较低，肌肉的表达水平最低。

图 1(Fig. 1)

图 7 卵形鲳鲹ToTLR13基因在不同组织中的表达情况 Fig.7 Expression pattern of ToTLR13 gene in different tissues of T. ovatus ToTLR13在各组织相对表达量以肌肉表达水平(设定为1)作为参照进行计算；不同字母表示差异显著(P < 0.05)。 The relative expression of ToTLR13 in each tissue was calculated based on the muscle expression level (set as 1) as a reference; Different letters on the column represent significant differences (P < 0.05).

为检测ToTLR13是否参与机体先天性免疫防御，本研究进一步分析了无乳链球菌和溶藻弧菌刺激(0、6、12、24、48、72和96 h)后ToTLR13在免疫相关组织鳃、脾、肝和肾中的表达情况。结果显示，无乳链球菌和溶藻弧菌刺激后，ToTLR13在免疫相关组织中的表达水平均呈现显著性上调，但其在不同时间和不同组织中的表达水平差异较大。由图 8可知，在鳃中，ToTLR13表达水平在无乳链球菌刺激0~48 h时呈低水平的升高趋势，感染72 h时表达水平突然达到高峰(是攻毒前的23倍)，96 h又降回到原始水平。感染溶藻弧菌时，ToTLR13表达水平则呈先上升后下降再上升的趋势，在感染12 h和96 h均表现出显著差异，且96 h达到峰值。脾ToTLR13 mRNA表达水平在2种细菌刺激后均呈现出时间依赖性上升，无乳链球菌实验组在24 h时表达水平达到峰值，而溶藻弧菌实验组在96 h时表达水平达到峰值。肝ToTLR13 mRNA表达水平在感染无乳链球菌的0~48 h时呈规律性先上升后下降趋势，在72 h时表达量达到峰值。在溶藻弧菌实验组，肝ToTLR13 mRNA表达水平则呈先下降至原始水平以下后上升的趋势，并在48 h达到峰值。在肾中，ToTLR13 mRNA表达水平在无乳链球菌感染后分别在12 h和72 h时达到峰值；而在溶藻弧菌感染后6 h时便迅速达到了峰值，随后降低至攻毒前水平。

图 1(Fig. 1)

图 8 无乳链球菌和溶藻弧菌刺激后ToTLR13在卵形鲳鲹免疫相关组织中的表达模式 Fig.8 The relative expression of ToTLR13 mRNA in immune-related tissue of T. ovatus by S. agalactiae and V. alginolyticus 柱上不同字母(大写字母：实验组；小写字母：对照组)表示表达差异显著。 Different letters on the column (Upper-case letter: Experimental group; Lower-case letter: Control group) represent significant differences.

为更好地理解ToTLR13在细胞中的功能，本研究通过构建pEGFP-ToTLR13重组表达荧光质粒进行其在A549细胞中的亚细胞定位研究。激光共聚焦显微镜观察发现，对照组pEGFP-N1空载质粒绿色荧光均匀地分布于整个细胞中，而实验组的绿色荧光主要分布于细胞质，说明pEGFP-ToTLR13质粒主要定位于细胞质(图 9)。

图 1(Fig. 1)

图 9 ToTLR13在A549细胞中的亚细胞定位 Fig.9 Subcellular localization of ToTLR13 in A549 cells A：DAPI染色，示细胞核；B：EGFP染色，示pEGFP-ToTLR13或pEGFP-N1；C：合并后的图像 A: DAPI staining, showing the nucleus; B: EGFP staining, showing pEGFP-ToTLR13 or PEGFP-N1; C: Merged images

TLRs在宿主免疫识别各种PAMPs并触发级联免疫反应中发挥重要的作用(Qi et al, 2020a、b; Zhou et al, 2021)。本研究克隆了卵形鲳鲹ToTLR13基因的ORF序列，该序列为1 269 bp，编码422个氨基酸，具有用于配体识别的1个TM结构域、1个C端TIR结构域和5个LRR结构域。其中，TIR结构域几乎存在于所有的跨膜TLR中且序列高度保守，参与TLR的信号传递和定位(Shan et al, 2018; Dinarello, 2018)。LRR结构域参与PAMPs识别，并通过MyD88依赖性途径或非依赖性途径触发细胞内信号的激活(St Paul et al, 2011)。研究显示，哺乳动物和鱼类的LRR的内含子存在差异(Matsushima et al, 2007)，并且不同物种间的TLR13的LRR结构域数量不同。例如，在哺乳动物中，小鼠和大鼠(Rattus norvegicus) TLR13有18个LRR结构域；在硬骨鱼中，斜带石斑鱼和大黄鱼TLR13有11个(Liang et al, 2018)，而与其他物种TLR13相比，ToTLR13含有的LRR结构域较少，仅5个。TLRs的LRR结构域是用于识别PAMPs的结构域，不同物种间TLRs的LRR结构域差异可能在其识别不同配体方面具有重要作用(Matsushima et al, 2007)。吴羽媛等(2018)研究表明，马氏珠母贝(Pinctada martensi)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的TLR13蛋白结构高度相似。本研究通过构建和比对TLR13保守结构域的三级结构发现，硬骨鱼类的LRR结构域和TIR结构域具有高度的相似性，并与哺乳动物小鼠的空间结构重合率也较高，暗示其结构和功能在物种间具有一定的保守性。

通过同源序列比对发现，ToTLR13与其他硬骨鱼的TLR13具有较高的相似性(82.52%~84.58%)，而与其他纲物种的序列相似性较低(33.30%~46.11%)；构建的系统进化树发现，ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13聚为一支，与其他物种TLR13相分离，说明ToTLR13与鱼类亲缘关系较近，与哺乳类、两栖类和贝类等亲缘关系较远。以上结果表明，ToTLR13在进化过程中具有较高保守性，可能具有与其他物种的TLR13相似的功能。

卵形鲳鲹ToTLR13 mRNA在所检测的组织中具有表达，这与其他鱼类TLR13的表达谱结果相似(Liang et al, 2018; Yu J X et al, 2021; Qi et al, 2020b; Gao et al, 2021; Tang et al, 2020)。RT-qPCR结果显示，健康卵形鲳鲹ToTLR13 mRNA在所检测的组织中均有表达，其中鳃、脾表达量较高，其次脑、肝、肾表达量中等，表达量较低的组织为心、头肾和肌肉。但是，不同鱼类TLR13在各组织中表达水平略有差异。例如，小黄鱼TLR13 mRNA在肝、头肾和脾中表达水平较高，而在脑、血液、鳃和眼睛中表达较低(Wang et al, 2016)；而斜带石斑鱼TLR13 mRNA则在大脑中表达最高，其次是胸腺，在肠、头肾、鳃和肾中表达相对较低(Liang et al, 2018)；另外，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中鉴定出2种TLR13 (OnTLR13a和OnTLR13b)，OnTLR13a在脾和大脑中呈高表达，而OnTLR13b主要在血液、脾和肝中表达(Gao et al, 2021)。这些研究表明，鱼类TLR13在正常组织中具有种属特异性和组织特异性，同时，当宿主鱼受到免疫刺激后，TLR13在免疫相关组织中普遍会呈现高表达的现象，暗示其可能在宿主免疫应答的过程中起到重要的作用。

TLRs大量存在于脾、肝和肾等免疫相关组织中，可在先天免疫细胞和绝大多数非造血细胞上表达，如树突状细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞(St Paul et al, 2011)。当受到病原微生物、病毒及寄生虫的刺激后，不同鱼类TLR13在各免疫相关组织中表达谱变化不同。如小黄鱼受到鳗弧菌和poly(I: C)刺激后，脾的TLR13 mRNA表达呈上升趋势，并且在小黄鱼白细胞受到poly(I: C)刺激后12 h时，TLR13 mRNA表达量显著增加(Wang et al, 2016)。达氏鲟(Acipenser dabryanus)头肾白细胞分别在LPS和poly(I: C)的刺激下，TLR13 mRNA表达均呈现显著上调(Tang et al, 2020)，并且在斜带石斑鱼GS细胞受到病原菌23S rRNA刺激后，得到相似的结果，TLR13 mRNA的表达显著增加(Liang et al, 2018)。罗非鱼受到无乳链球菌的刺激后，OnTLR13a在肠道、鳃、脾、肾和血液中的表达有不同程度的上调，OnTLR13b在肠道、鳃、脾和肾中亦是如此(Gao et al, 2021)。褐鳟(Salmo trutta)肾脏在粘液虫感染后的4~12周内，TLR13 mRNA的表达显著上升(Sudhagar et al, 2020)。本研究发现，无乳链球菌和溶藻弧菌刺激后，ToTLR13 mRNA表达水平在鳃、脾、肝和头肾中均呈现出显著性上调，但总体上，溶藻弧菌诱导的ToTLR13 mRNA表达水平高于无乳链球菌(图 7)。值得注意的是，无乳链球菌和溶藻弧菌刺激后，ToTLR13 mRNA在鳃中呈现较高的表达上升(23和68倍)，并且分别在72、12和96 h时表达量突增，该现象与小黄鱼、斜带石斑鱼和尼罗罗非鱼TLR13的结果相似(Liang et al, 2018; Wang et al, 2016; Gao et al, 2021)。由皮肤、肠道和鳃等黏膜相关组织构成的黏膜免疫系统，可作为鱼类抵御外源病原菌重要的免疫屏障(李坤明等, 2020; 胡伟等, 2022; Ángels et al, 2012; Yu J X et al, 2021)。上述研究结果提示，ToTLR13可能参与了病原菌入侵宿主时的免疫防御，但TLR13在配体识别过程中具体的免疫机制尚不清楚，需要后续开展实验进一步探究。

根据细胞定位，TLRs可分为两大类：一类位于细胞膜表面(如TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11)，另一类定位于细胞质(内质体或溶酶体)中(如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10) (Qian et al, 2013)。研究证实，细胞内的TLRs可识别细菌、病毒、真菌或寄生虫等所释放的核酸(Shi et al, 2011)。Lee等(2013)发现，小鼠TLR13定位于核内体，并且能够识别保守的细菌23S rRNA。而在硬骨鱼中，斜带石斑鱼和小黄鱼的TLR13均定位于细胞质中(Liang et al, 2018; Wang et al, 2016)。硬骨鱼TLR13在内质体中的细胞定位可能表明了一种调节机制，通过内质体的微环境来调节配体的结合(Lee et al, 2013)。本研究亚细胞定位结果显示，在A549细胞的细胞质中绿色荧光信号较强，说明pEGFP-ToTLR13主要在细胞质上表达。以上结果表明，ToTLR13在进化过程中具有较高保守性，说明ToTLR13可能与其他鱼类的TLR13具有相似的生物学功能。

本研究利用PCR技术成功克隆了卵形鲳鲹ToTLR13基因的ORF序列，保守结构域分析显示其含有1个TM结构域、1个C端TIR结构域和5个LRR结构域。同源性比对、系统进化分析和三级结构比对结果表明，ToTLR13与其他鱼类TLR13同源性较高且具有较近的进化关系。RT-qPCR结果显示，ToTLR13 mRNA在卵形鲳鲹各组织中呈广谱型表达，其中鳃的表达量最高。而在病原菌刺激后，ToTLR13在一些免疫相关组织表达显著上调，表明ToTLR13基因卵形鲳鲹病原菌免疫过程中发挥了重要作用。亚细胞定位结果显示，ToTLR13定位于A549细胞的细胞质中。以上结果为进一步研究硬骨鱼TLR13的免疫调节作用提供了一定的科学参考价值。