锦鲤(Cyprinus carpio L.)是世界上最重要的观赏鱼类之一，体色鲜艳多姿，泳姿优美，有“水中活宝石”和“会游泳的艺术品”之称，丰满的体态和艳丽的体色是决定锦鲤观赏价值和经济价值的主要因素。锦鲤自身并不能合成类胡萝卜素，其主要依靠摄取食物中的类胡萝卜素转化为虾青素，或者直接投喂含有虾青素的着色饲料，从而达到增色的目的，投喂着色饲料是最直接有效改善观赏鱼体色的途径(孙刘娟等, 2016)，所以开发锦鲤饲料要兼顾营养和体色的需求。

鱼粉是水产饲料中重要的蛋白源，近年来随着水产养殖业的发展以及全球鱼粉产量的减少，鱼粉价格持续攀升，寻找新型优质蛋白源替代鱼粉成为研究热点。植物蛋白原料替代鱼粉是研究突破口之一，目前已见大豆蛋白、菜籽蛋白、花生蛋白和玉米蛋白等在水产动物中的研究，但是植物蛋白原料普遍存在适口性差、消化率低和含有抗营养因子等缺点，导致饲料利用率低、资源浪费(彭凯等, 2022)。南极磷虾(Euphausia superba)资源储备量巨大且营养丰富，南极磷虾粉(以下简称磷虾粉)是由南极磷虾干燥加工而成的一种优质蛋白源，富含虾青素、磷脂和不饱和脂肪酸，适口性强且不含抗营养因子，在水产饲料领域应用前景广阔(李福后等, 2023)。本课题组前期研究证实了磷虾粉替代部分鱼粉可提高锦鲤的生长性能、改善体色、优化血清生化指标，推荐在鱼粉含量为500 g/kg的锦鲤饲料中添加20%的脱脂磷虾粉(梁艺馨等, 2021)。脱脂磷虾粉是提取磷虾油后的产物，包括磷虾的肌肉和外骨骼成分，含有较多的几丁质和氟，过量摄入会对鱼体产生不利影响(Kousoulaki et al, 2013)，如何进一步提高磷虾粉在水产饲料中的高效利用值得深入探索。

微生物发酵工艺可以将大分子蛋白质转化为更容易吸收的小分子蛋白多肽和氨基酸等，还能产生有机酸和风味物质，提高适口性和营养价值，有机酸可以激活消化酶，提高饲料的利用率，有益菌在肠道内的定植可以维持宿主肠道菌群稳定，抵御病原微生物，保护肠道健康，此外，微生物发酵还可以提高磷虾粉的抗氧化活性(李雪萍等, 2022; 丁亚伟等, 2022)。目前，饲料发酵中常用的益生菌有乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、芽孢杆菌(Bacillus)和酵母菌(Saccharomyces)，相较单一菌种，复合菌种可以实现多菌种间的互补从而弥补单一菌种的不足，实用性更强(闫星月等, 2022)。本研究拟使用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)以及三者复合菌(1:1:1)对磷虾粉进行发酵，比较益生菌发酵的磷虾粉与未发酵磷虾粉、不同益生菌发酵磷虾粉、单一和复合益生菌发酵磷虾粉对锦鲤的生长、体色、血清生化指标以及相关基因表达的影响，以期为磷虾粉在锦鲤饲料中更加科学高效地利用提供参考依据。

1 材料与方法

益生菌菌粉由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供，粪肠球菌活菌数≥10⁸ CFU/g、植物乳杆菌活菌数≥10⁸ CFU/g、丁酸梭菌活菌数≥10⁸ CFU/g、复合菌活菌数≥10⁸ CFU/g。

1.1 发酵南极磷虾粉制备

以脱脂南极磷虾粉为发酵底物，将益生菌粉溶于1 L温水中，并将益生菌粉2倍质量的葡萄糖加入发酵液中混匀，将稀释好的菌液加入到发酵底物中搅拌，磷虾粉含水量为30%，之后，将混合好的磷虾粉密封，发酵温度为30 ℃，发酵时间为14 d，开封后在室温放置14 d后保存备用。对照组、粪肠球菌组、植物乳杆菌组、丁酸梭菌组和复合菌组，分别记为ES、EF、LP、CB和MIX。发酵前后的南极磷虾粉营养水平见表 1。

1.2 实验饲料

以鱼粉、小麦粉和豆粕为主要蛋白源(购自广州市某饲料公司)，大豆油为主要脂肪源配制基础饲料，原料组成及营养成分见表 2。所有原料粉碎过80目筛，根据饲料配方，采用逐级扩大法混匀后，加入大豆油及适量蒸馏水再次混合均匀，经螺旋挤压机加工成直径为2.5 mm的硬颗粒饲料，自然风干后置于–20 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验鱼与养殖管理

养殖实验在中国水产科学研究院珠江水产研究所观赏鱼基地内进行。正式养殖实验开始前，将锦鲤放置于5.0 m×2.0 m×1.5 m的水泥池中暂养14 d，暂养期间投喂基础饲料。暂养结束后，选取平均体质量为(4.92±0.22) g、健康活泼的锦鲤450尾，将实验鱼随机分为5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，分别养殖在15个100 cm×60 cm×30 cm的水族缸中。实验期间，每日饱食投喂2次(08:00和14:00)，水温为(27±1) ℃，pH为7.6~7.8，溶解氧含量≥7 mg/L，每周换曝气水3次，换水量为全部水量的1/3，养殖周期为70 d，保持不间断充气。

1.4 样品采集

养殖实验开始前和结束后，实验鱼均禁食24 h，测量体长和体重，并于实验的第1、35、70天在每个重复组随机取6尾鱼，使用色差计测量实验鱼背鳍下方及侧线上方之间的体表红色区域的色度值，实验期间持续记录死亡数量。养殖实验结束后，每个重复组随机取6尾鱼放入浓度为120 mg/L的MS-222溶液中进行麻醉，使用一次性无菌注射器从尾静脉取血，4 ℃静置6 h后离心(4 000 r/min，15 min，4 ℃)，取上清液，–80 ℃保存用于血清生化指标的测定；之后，分别取约0.05 g鳞片和皮肤用于类胡萝卜素含量的测定；解剖取肝脏与内脏团称重用于测定肝体比和脏体比。每个重复随机取2尾鱼，取其鳞片和皮肤少许置于RNAlater溶液中，保存于–80 ℃，后续用于RNA提取，另取肝脏组织少许，放入有4%多聚甲醛的离心管内，用于切片制备，常温保存。

1.5 指标测定 1.5.1 生长性能测定

根据下列公式，计算实验鱼特定生长率、增重率、成活率、肥满度、肝体比和脏体比，计算公式如下：

特定生长率(specific growth rate, SGR, %/d) =100× (lnW_t–lnW₀)/t；

增重率(weight gain rate, WGR, %)=100×(W_t– W₀)/W₀；

成活率(survival rate, SR, %)=100×成活尾数/总尾数；

肥满度(condition factor, CF)=100×W_t/L³；

肝体比(hepatosomatic ratio, HSI, %)=100×肝脏总重(g)/实验鱼体重(g)；

脏体比(viscerosomatic ratio, VSI, %)=100×内脏团重(g)/实验鱼体重(g)。

式中，W₀为实验鱼初始体质量(g)，W_t为实验鱼终末体质量(g)，t为实验天数(d)，L为实验鱼的体长(cm)。

1.5.2 色度值的测定

采用国际照明委员会CIE规定的L^*、a^*、b^*表示体色状态，L^* (luminnance，表示亮度)、a^* (redness，+a^*表示偏红色，–a表示偏绿色)、b^* (yellowness，+b^*表示偏黄色，–b^*表示偏蓝色) (崔培等, 2011)。每个重复组随机取6尾鱼，使用CR-400型色彩色差计(柯尼卡-美能达, 日本)测定实验鱼体表的L^*、a^*和b^*值，使用前用白板校准，用吸水纸吸干鱼体表面的水分，再将色差计的探头紧贴鱼体背鳍下方及侧线上方的红色区域，扫描并记录读数。

1.5.3 类胡萝卜素含量的测定

类胡萝卜素的提取和测定方法参考崔培等(2011)的方法，计算公式如下：S=(A×K×V)/(E×G)

式中，S为类胡萝卜素含量(mg/kg)；A为吸光度值；K为常数(10 000)；V为提取液体积(mL)；E为吸光系数(2 500)；G为样品质量(g)。

1.5.4 血清生化指标测定

血清甘油三酯(triglyceride, TG)和总胆固醇(total cholesterol, TC)含量、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase, AST)和谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, ALT)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.5.5 肝脏切片制备与观察

肝脏组织样品经4%多聚甲醛固定后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，组织切片(厚度为5 μm)，HE染色，中性树胶封片等步骤后，置于光学显微镜下观察并拍照。

1.5.6 基因表达

总RNA提取及反转录：鳞片和皮肤样品RNA的提取均参照Omega试剂盒说明书进行，琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白仪鉴定RNA完整性和纯度，反转录使用艾科瑞生物公司生产的Evo M-MLV反转录试剂盒进行，获得的cDNA样品置于–20 ℃保存，用于PCR扩增。

实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测酪氨酸酶(tyrosinase, tyr)基因的相对表达量，根据GenBank中现有的锦鲤基因保守序列，使用Primer Premier 5软件设计引物(表 3)，所有引物由广州艾基生物技术有限公司合成。取各组cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，以β-actin内参，采用2^–ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.6 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS Statistics 21.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异显著，则采用Tukey进行多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果 2.1 发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤生长性能的影响

从表 4可知，与对照组相比，各实验组的终末体质量、特定生长率和增重率显著提高(P<0.05)，其中，MIX组的终末体质量、特定生长率和增重率显著高于EF、LP和CB组(P<0.05)；各组存活率无显著差异(P>0.05)，实验组锦鲤肥满度、肝体比和脏体比高于对照组，未达到显著差异(P>0.05)。

2.2 发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤体色的影响

由表 5可以看出，第1天时，各组间L^*、a^*和b^*值无显著差异(P>0.05)；第35天时，各组间L^*值无显著差异(P>0.05)，实验组a^*值和b^*值显著高于对照组(P<0.05)，各实验组间无显著差异(P>0.05)；第70天时，各组间L^*值无显著差异(P>0.05)，实验组a^*值和b^*值均显著高于对照组(P<0.05)，其中，MIX组的a^*值和b^*值显著高于其他组(P<0.05)。

由图 1可知，实验组锦鲤皮肤和鳞片的类胡萝卜素含量均显著高于对照组(P<0.05)，MIX组锦鲤皮肤和鳞片的类胡萝卜素含量均显著高于其他组(P<0.05)，除MIX组外，各实验组间无显著差异(P>0.05)。

2.3 发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤血清生化指标的影响

由表 6可知，相比对照组，实验组血清TG和TC含量显著提高(P<0.05)；血清AST/ALT比值显著降低(P<0.05)；血清MDA含量显著降低(P<0.05)。以上指标各实验组间均无显著差异(P>0.05)。

2.4 发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤肝脏组织的影响

由图 2的肝脏切片可见，各组肝脏组织肝小叶轮廓清晰，肝细胞排列整齐，对照组锦鲤部分肝细胞胞浆内出现脂滴，细胞核被脂滴挤压，导致细胞核偏移，部分肝细胞的细胞核已消失，呈现出空泡化状态，但肝细胞轮廓结构仍然完整。

2.5 发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤相关基因表达量的影响

由图 3可以看出，与对照组相比，tyr在实验组锦鲤皮肤和鳞片中相对表达量显著提高(P<0.05)，其中MIX组相对表达量显著高于其他组(P<0.05)。

3 讨论 3.1 益生菌发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤生长性能的影响

本研究中，实验组锦鲤的终末体质量、特定生长率、增重率相比对照组显著提高，该结果与云龙石斑鱼(Epinephelus moara♀ × E. lanceolatus♂)(李忠琴等, 2022)、吉富罗非鱼(GIFT O. niloticus)(黄旺等, 2017)和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)(王海瑞等, 2022)的研究结果一致。发酵工艺可以降解大分子营养物质，便于吸收；发酵过程产生的有机酸和风味物质可以抑制饲料中有害菌的滋生、增加饲料的适口性；益生菌进入肠道内定植有助于维护肠道菌群稳定、保护肠道健康，益生菌同时也能产生维生素、氨基酸和促生长因子等，益生菌自身具有的蛋白质和矿物质等对机体生长都有促进作用(暴宁, 2017)。肥满度、肝体比和脏体比是重要的鱼类形体指标参数，肥满度指标常用来表示鱼类生长情况和质量优劣，各实验组肥满度均高于对照组，表明实验组锦鲤生长状况更好(李正民, 2022)。

3.2 益生菌发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤体色的影响

鱼类摄取食物中的类胡萝卜素吸收沉淀转化，最终合成虾青素，可以直接贮存在鱼体中，虾青素具有较强的色素沉积能力，从而使鱼类的皮肤和鳞片等组织呈现出鲜艳健康的颜色(王月等, 2015)。相较于其他类胡萝卜素，虾青素更容易被吸收和沉积，磷虾粉中含有丰富的虾青素，发酵工艺可以激发虾青素的活性，提高虾青素的利用率(王裕玉等, 2021)。在衡量锦鲤体色的色度值中，L^*值代表物体表面颜色的鲜亮程度，a^*值和b^*值分别表示红色和黄色的量化程度。本研究中，实验组锦鲤皮肤a^*值和b^*值以及皮肤鳞片中类胡萝卜素的含量均显著提高，表明益生菌发酵磷虾粉比普通磷虾粉对锦鲤体色的提升作用更强。目前关于益生菌发酵饲料对水产动物体色的研究较少，使用酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料投喂草金鱼(Carassius auratus red var)后，草金鱼的L^*和a^*以及鳍条中类胡萝卜素含量均显著提高(葛玲瑞等, 2021)，表明益生菌发酵饲料可以改善草金鱼的体色。

鱼类色素细胞由神经嵴细胞分化形成，大量基因参与神经嵴细胞向色素细胞的迁移与分化。tyr是黑色素合成通路中的关键基因，在锦鲤体色发育各个阶段均存在，其表达量影响黑色素生成的速度和种类，在各组织中均有表达(田雪等, 2017)。研究发现，tyr在橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)胚胎发育的整个阶段都有表达，且在黑色素细胞形成的初始时期表达量迅速增至最高(蒋燕玲, 2016)。王巍等(2012)在锦鲤的研究中发现，tyr基因在眼睛和黑色皮肤中表达量最高，其次是大脑、红色皮肤和黄色皮肤，表达量最低的是肝脏和心脏。本研究结果显示，tyr在皮肤中的表达量高于鳞片中，且实验组表达量均显著高于对照组。在本研究中，单一和复合益生菌发酵磷虾粉均对锦鲤的体色起到一定的改善作用，其中复合菌效果最好。

3.3 益生菌发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤血清生化指标的影响

血清生化指标与鱼体代谢、健康和疾病密切相关，因此常用来衡量鱼体健康和营养状况。ALT和AST分别存在于肝脏细胞和肝脏线粒体中，在肝脏健康的状态下这2种酶的活性很低，当肝脏组织受损时，细胞膜通透性发生变化，ALT和AST就会进入到进入血液，从而导致血清中酶活性提高(何娇娇等, 2017)，所以，ALT/AST升高暗示着肝脏受损，对照组血清ALT/AST比值显著高于实验组，表明对照组锦鲤肝脏细胞出现了一定程度的损伤，本课题组在前期实验中也得到了相同的结论。TG和TC均与脂质代谢有关，血液是维持脂质在机体内正常运转的主要途径，TG和TC是血脂的主要组成部分，其含量与鱼体脂质代谢能力成正比(李宜芳等, 2022)，胆固醇主要在肝脏中形成，当肝脏受损时，血清中TG和TC含量会减少(逯冠政等, 2022)，本研究中，对照组TG和TC含量显著低于实验组，表明对照组锦鲤肝脏可能出现了损伤，脂质代谢率下降，而对照组锦鲤肝脏切片也证实了肝脏损伤的存在。

鱼类在日常的生理活动中会产生氧自由基，正常情况下，氧自由基处于稳定状态，如果产生过多则对机体造成损伤，抗氧化酶可以清除过多氧自由基，抵御氧化给机体带来的损伤(孙全贵等, 2016)。MDA则是脂质过氧化的产物，可以用来判断细胞受损的程度(何娇娇等, 2017)。本研究实验组锦鲤血清MDA含量显著下降，说明益生菌发酵的磷虾粉替代鱼粉对锦鲤抗氧化能力有所提高。磷虾粉中丰富的虾青素具有较强的抗氧化能力，配合发酵工艺使虾青素释放出更多活性物质，进一步增强抗氧化能力(李雪萍等, 2022)。

3.4 益生菌发酵南极磷虾粉替代鱼粉对锦鲤肝脏组织的影响

肝脏是鱼类重要的消化代谢器官，还兼有解毒和免疫等多重功能，其显微结构可以直观的反映肝脏的健康状况(谭晓晨等, 2021)。本研究中，对照组锦鲤肝脏出现少量脂滴以及部分肝细胞空泡变性，推测原因是对照组锦鲤脂质代谢能力不足，导致肝脏中脂肪积累，肝脏的生理机能下降，脂蛋白合成减少，肝脏内多余的脂肪不能及时运出，肝脏的脂肪含量升高从而导致肝脏受损。此外，脱脂磷虾粉中包括磷虾的肌肉和外骨骼，其中氟和几丁质的含量较高，长期摄食后在鱼体积累导致肝损伤，使用磷虾粉梯度替代鱼粉喂养圆斑星鲽(Verasper variegatus)对其肝脏无不良影响(严俊丽等, 2016)，研究结果的差异可能和鱼的种类有关。实验组锦鲤肝脏尚未发现上述情况，可能是受到益生菌以及发酵工艺的双重影响，从而提高了肝脏的脂质代谢能力，肝脏脂肪压力减小，生理机能正常运转。

4 结论

本研究表明，使用单一和复合益生菌发酵磷虾粉均能提高锦鲤的生长性能，改善体色，优化血清生化指标，提高抗氧化能力，保护肝脏健康。与对照组相比，锦鲤皮肤和鳞片中的tyr相对表达量显著提高。3个单一益生菌组之间各项指标无显著性差异，复合菌组锦鲤的生长性能和体色最佳。综上所述，在脱脂南极磷虾粉添加水平为20%的锦鲤配合饲料中，建议使用复合菌发酵磷虾粉。