橘色海菊蛤(Spondylus aurantius)主要分布于我国广东、海南以及菲律宾等暖水性海域(王晓宁, 2011)。海菊蛤属固着型贝类，常栖息于浅海和潮间带附近的礁石和珊瑚上，其从幼虫变态固着后便终生不再移动(王鹏等, 2014)。海菊蛤闭壳肌肥大，味道鲜美，是一种不可多得的美食，其外壳亦可作为观赏品，因此，是当地渔民重要的采捕贝类之一。

我国是贝类养殖大国，2021年海水贝类养殖产量为1 500多万t，其中，牡蛎(Ostreidae)、扇贝(Pectinidae)、蛤(Veneridae)等是主要养殖品种，占贝类养殖总产量的78.23% (张国范等, 2020; 农业农村部渔业渔政管理局等, 2022)。与之相比，海南省贝类养殖产量仅为2万t，且多以方斑东风螺(Babylonia areolata)等肉食性螺类为主，滤食性双壳贝类种类仅有牡蛎、扇贝及蚶(Arcidae)等少数种类，因此，急需开发新的品种来推动海南贝类养殖产业的发展(潘英等, 2021; Zhang et al, 2021; 农业农村部渔业渔政管理局等, 2022)。

尽管我国已在贝类人工繁育方面取得了巨大成就，且已建立了完善的人工促熟、催产及孵化等技术体系(Zheng et al, 2003; 周丽青等, 2020; 褚洪永等, 2022)。然而，截至目前，未有关于海菊蛤胚胎发育和人工繁育的报道。基于此，本研究以海南岛常见海菊蛤——橘色海菊蛤为研究对象，收集野生亲体，拟开展其人工促熟、胚胎及稚贝发育观察、附着基选择等相关研究，建立橘色海菊蛤人工繁育技术，为后续开展该物种在南海人工规模化养殖提供支撑。

1 材料与方法 1.1 亲本收集及育肥

2022年4月，在海南省三亚市三亚湾采集壳长为(12.00±1.25) cm、体重为(100.00±5.04) g的野生橘色海菊蛤100只，清理外壳上的所有附着物，剪掉棘刺，运输到海南省文昌市某养殖场半封闭遮光养殖池(9 m³)中暂养催熟。暂养期间，采用“持续充气+微流水”形式进行培养，水流量为2 m³/d，每日投喂新鲜培养的微拟球藻(Nannocloropsis sp.)，同时，适当添加螺旋藻粉。观察橘色海菊蛤性腺成熟程度，待性腺发育成熟后，挑选性腺发育饱满个体进行催产(图 1)。亲体育肥期间，所有海水均经过砂滤池过滤，水温为27~29℃，pH为8.0~8.2，盐度为31~33。

1.2 催产受精

催产方法采用“晾干+流水+高温”刺激法，即午后将橘色海菊蛤从养殖池中捞出阴干2 h，再将海菊蛤放入100 L的塑料盆中进行流水刺激3 h，流水温度为28 ℃。待流水刺激后，将雌雄海菊蛤(雄性15只，雌性26只)分别转移至2个海水水温为32 ℃的水槽(1 m³)中(采用加热棒控温)，进行高温刺激。待产卵排精后，将适量含有精子的海水与卵子混合，实时取样并观察是否受精。待受精后0.5 h，将海菊蛤亲本取出，同时，使用350目筛绢收集约一半受精卵，转移至水温为28 ℃水槽中，剩余受精卵养殖于32 ℃海水中，微充气。

1.3 胚胎及幼体培养

受精卵发育到D形幼虫时，使用350目筛绢过滤，将28 ℃和32 ℃组D形虫转移至体积为10 m³的养殖池中，幼虫密度控制在1 ind./mL，微充气。其中，28 ℃组为自然水温，32 ℃组采用电热棒控温。2 d后投喂食用酵母和微拟球藻作开口饵料；发育至壳顶后期时，采用微流水培养，每日08:00关闭流水投喂藻类，3 h后打开流水。养殖水体中，pH为8.0~8.2，盐度为31~33，封闭遮光培养。

1.4 附着基选择

胚胎发育至壳顶后期开始进入附着变态阶段。本研究选用混凝土饼、黑蝶贝壳、海菊蛤壳、牡蛎壳、绿色聚乙烯网片和黑色遮阳网共6种类型附着基。其中，混凝土饼、黑蝶贝壳、海菊蛤壳、牡蛎壳等中央处打小孔，分别使用长为2 m的黑色胶丝绳穿起，在距水面0~0.5、0.5~1、1~1.5 m之间各穿2个；绿色聚乙烯网片、黑色遮阳网等材质直接裁剪为1.5 m²。将附着基用高压水枪清洗干净，放入养殖池等待附着。

1.5 稚贝培养

当幼虫发育为稚贝并固着于附着基上后，再继续培养14 d。待稚贝生长至壳长为(2.25±0.01) mm后，将其转移至海南三亚市蜈支洲海洋牧场海域，进行海上吊养(水面下5 m)。运输前1 d停止投喂藻类，水流量增加至2 m³/d，以增强其环境适应性。蜈支洲海域水温为27.8~29.5 ℃，pH为8.2，盐度为34.3。

1.6 观察方法 1.6.1 胚胎及稚贝发育观察

本研究以精卵混合作为起始时间，自受精至囊胚期每间隔10 min取样观察1次，囊胚期至D形虫期每间隔30 min取样1次，D形虫期至稚贝每天取样1次。每次随机取样3份，每份样本观察超过20个胚胎，当超过半数进入到下一个时期时即定为一个阶段。实验采用江南DN-10B显微镜与江南JSZ5B体视镜观察胚胎及稚贝发育过程，使用ScopeImage 9.0软件拍照记录胚胎尺寸。

1.6.2 不同材质附着基及水深对海菊蛤附着的影响

幼虫发育至稚贝后，取出不同材质的附着基，数出0~0.5、0.5~1、1~1.5 m之间的附着个数，计算附着密度。实验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用Excel和DPS软件进行作图和数据处理，不同材质附着基和采苗深度的显著性分析采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，P < 0.05为显著性水平。

2 结果 2.1 催产受精

橘色海菊蛤为雌雄异体，雄性生殖腺为乳白色，雌性为橘红色。催产初期，其精卵尚未完全充满整个生殖腺，显微观察发现，内部卵子大部分未发育成熟。待室内育肥30 d后，橘色海菊蛤发育成熟，个体性腺饱满，包裹住大部分内脏团，精巢和卵巢内部充满成熟精子和卵子。对雌雄性别的橘色海菊蛤取样解剖性腺，观察发现精子非常活跃，卵子发育成熟度高，呈橘红色(图 1)。

经过“晾干+流水+高温”刺激后，雌性橘色海菊蛤于19:50开始产卵，具体表现为双壳开闭使外套腔内的海水迅速流动，带动卵子喷射而出，肉眼可见颗粒状；10 min后，雄性橘色海菊蛤开始排精，精子颜色呈乳白色，排出时呈烟雾状，随后逐渐扩散开。雌雄橘色海菊蛤产卵排精完成后水体呈乳白色，表面有白色粘稠漂浮物及泡沫，取出亲本，持续通入微小的O₂。

2.2 胚胎及稚贝发育 2.2.1 卵裂发育

橘色海菊蛤的受精卵呈圆球状，橘红色，卵径为(130.1±0.3) µm (图 2a)。在水温为28 ℃时，受精卵经过25 min后出现第1极体(表 1)；此时，卵细胞颜色仍然为橘红色，卵径为(131.2± 0.2) µm (图 2b)。大约经过95 min后，受精卵发生首次分裂，发育成为2细胞(表 1)。胚胎为不均等分裂，颜色由橘红色逐渐变为黑褐色，卵径大小无明显变化(图 2c)。之后，胚胎大约每间隔30 min发生1次分裂，依次为4细胞、8细胞、16细胞、32细胞、多细胞(图 2d~g; 表 1)，均为不均等分裂。受精5 h后，胚胎发育到囊胚期(表 1)。由许多小细胞组成的球状体，此时，胚胎四周生短小密集的纤毛，促使胚胎做旋转运动(图 2h)。在水温为32 ℃时，受精卵经过20 min后出现第1极体，80 min后发生首次分裂，4 h后发育到囊胚期。

2.2.2 幼体发育

在水温为28 ℃时，受精卵经过12 h发育后变为担轮幼虫(图 2i，表 1)。此时，胚胎呈椭圆形，细胞加厚，四周纤毛中有一根粗大的纤毛。28 h后至D形虫阶段(图 2j)。胚胎两侧发育出透明的半圆形幼虫壳，半圆的圆弧部位长有纤毛，应激时纤毛会立即收缩回壳内。2 d后饲喂食用酵母和微拟球藻；发育7 d后，胚胎进入壳顶幼虫期(表 1)，此时，胚胎两侧中央部位明显的隆起形成幼虫的壳顶，在鳃的基部形成一对眼点(图 2k)，壳色透明；11 d后胚胎进入壳顶幼虫后期(表 1)，可明显观察到幼虫的足部开始形成，游动速度缓慢(图 2l)。15 d后胚胎发育成匍匐幼虫(表 1)，此时幼虫的足可自由伸缩，具有匍匐机能，纤毛逐渐退化，壳色素逐步加深，由透明色逐渐变为浅橙色(图 2m)。而水温为32℃时，受精卵经过10 h后发育为担轮幼虫，各个发育阶段均比水温28 ℃时提前。

2.2.3 附着变态发育

胚胎在水温为28 ℃时发育27 d后成为稚贝，而水温为32 ℃时胚胎只需25 d也发育成稚贝(表 1)。此时，幼虫已完成变态过程，从营浮游生活变为固着底栖生活。稚贝的左壳明显比右壳大，左壳分泌胶质固定在物体上，眼点逐渐退化，壳色加深(图 2n)。

2.2.4 稚贝发育

大部分稚贝完成固着后，继续在池中培养2周(受精后41 d)，稚贝的右壳表面生长出明显的棘刺，壳体变厚，壳色变为橘黄色(图 2o)。壳高约为(2.83±0.01) mm，壳长约为(2.25±0.01) mm。受精后71 d，天然海区中海菊蛤右壳上棘刺已生长至1 mm长，贝壳上放射性条纹清晰可见，壳色为橘红色，有明显的色素斑点，此时壳高为(3.92±0.01) mm，壳长为(3.86±0.01) mm (图 2p)。

2.3 不同材质附着基

不同类型附着基及不同水深的附着结果见图 3。从图 3可以看出，幼虫在不同类型附着基上附着密度不同，随着水深的增加，附着密度也增加。黑蝶贝壳的附着密度相对较好，绿色聚乙烯网片的附着效果最不理想，黑蝶贝壳、海菊蛤壳、牡蛎壳的粗糙面和光滑面附着密度相同，但在蜈支洲海域养殖30 d后，附着在光滑面上稚贝有部分脱落。在水深为1~1.5 m处海菊蛤壳的附着密度最大为(0.89±0.09) ind./cm²，水深在0~0.5 m处绿色聚乙烯网片和黑色遮阳网的附着密度最小为(0.02±0) ind./cm²。

3 讨论 3.1 繁殖特点及亲本催熟

贝苗质量的好坏及产量与亲贝的性腺发育程度有着密切的关系，选择性腺发育度好的亲贝能有效地提高育苗的质量。在贝类繁育过程中，亲本的选则及催熟是培养幼苗的关键，而影响性腺发育的因素有温度、饵料、繁育季节等(刘洋等, 2020; 常亚青等, 2002)。本研究在水温为27~29 ℃，采用“持续充气+微流水”条件下，橘色海菊蛤性腺能够发育成熟，且精卵活力强，这与长牡蛎(Crassostrea gigas) (褚洪永等, 2022)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum) (闫喜武, 2005)采用方法类似。在饵料选择方面，本研究以新鲜培养的微拟球藻为主，辅以螺旋藻粉，取得理想效果。亲本能否成功被催熟与繁育季节有很大的关系，柯巧珍等(2010)研究发现，黄河三角洲青蛤(Cyclina sinensis)繁殖季节在6~9月；姜绪等(2017)对莱州湾海域小刀蛏(Cultellus attenuatus)行为学研究发现，其繁殖季节在6~7月。本研究通过观察解剖与催熟排卵发现，橘色海菊蛤性腺发育成熟期大概在4~7月，在该时期本实验同一批橘色海菊蛤共成功催产4次，精卵质量均极高。

3.2 橘色海菊蛤早期发育过程及与温度的相关性

橘色海菊蛤为体外受精，发育过程经历了受精卵、卵裂、囊胚期、单轮幼虫、D形幼虫、附着变态和稚贝等阶段。橘色海菊蛤在胚胎发育阶段与牡蛎、扇贝等双壳贝类类似，但存有一些差异。相似之处是三者的卵裂均是不均等分裂，胚胎发育阶段相同，属于卵生型。不同之处在于它们的受精卵卵径大小不同，长牡蛎受精卵卵径为(51.8±0.6) μm，海湾扇贝(Argopecten irradians)受精卵卵径为(63.4±3.7) μm，而本研究的橘色海菊蛤受精卵卵径为(130.1±0.3) μm，远大于长牡蛎(褚洪永等, 2022)和海湾扇贝(郑怀平等, 2003)；三者的受精卵颜色不同，海菊蛤受精卵颜色为橘红色，牡蛎为乳白色，不同扇贝种类受精卵颜色各异。受精卵颜色的不同与生长遗传、生理特性、生存环境有关。周丽青等(2006)研究发现，栉孔扇贝受精卵颜色的深浅可能与RNA和磷脂的含量有一定的关系。

与其他贝类相比，橘色海菊蛤发育至固着生活的稚贝后，其右壳上很快生长出棘刺，且海上养殖30 d后，其棘刺迅速生长至1 mm。双壳贝类运动能力较弱，如牡蛎及本研究涉及的橘色海菊蛤等固着后终生不再移动，因此其只能依靠坚硬外壳进行防御(王如才等, 2008)。相比于牡蛎，橘色海菊蛤生长的棘刺或许是其应对敌害生物进化出的一种防御机制。

胚胎发育过程中受到许多环境因子的影响，温度是影响胚胎发育速度最重要的因子(Hicks et al, 2002)。温度过高或过低会使胚胎发育缓慢、受精卵裂解、滞育、畸形等现象，在适宜的温度范围内胚胎发育速度会随着温度的升高而加快。本研究中，在水温为28 ℃和32 ℃时，受精卵均可发育到稚贝，且水温为32 ℃时，胚胎发育各个时期的发育速度都要比水温为28 ℃快，这一结果与西施舌(Coelomactra antiquata)等贝类类似(27 ℃下胚胎发育较21 ℃快) (刘德经等, 1998)。进一步比较发现，在高温(32 ℃)条件下，橘色海菊蛤死亡率增高，因此，28 ℃是橘色海菊蛤较适宜的胚胎发育培养温度。

3.3 不同附着基及水深对橘色海菊蛤附着效率的影响

双壳贝类的幼虫变态过程至关重要，也是幼虫从浮游生活到底栖生活的一个重要转变(Yan et al, 2005)。橘色海菊蛤是固着型的海洋贝类，目前，固着型贝类(如牡蛎等)采苗主要选用牡蛎壳、扇贝壳，效果较为理想。本研究所选用的6种不同类型附着基的附着效果有明显的差异，其中，黑蝶贝壳相对最好，牡蛎壳和海菊蛤壳次之，可能是黑蝶贝壳面积较大，且高密度养殖中容易附苗的原因。但在运往三亚蜈支洲海域养殖30 d后发现，黑蝶贝壳与海菊蛤壳、牡蛎壳的光滑面上附着的海菊蛤早已有部分脱落，而牡蛎壳和海菊蛤壳的粗糙面生长良好，无脱落现象发生，可能运输容易引起贝壳上附苗的脱落，加上海域相比养殖池中环境更加复杂，暗流涌动，而橘色海菊蛤尚小，因此更容易造成光滑面附苗的脱落。相比之下，牡蛎壳、海菊蛤壳的粗糙面多不规则，贝苗附着更加稳定，也易于躲避天敌；混凝土饼附着密度相对海菊蛤壳要少，这与Soniat等(1991)研究结果相同。胡新宇(2020)研究表明，在混凝土中参杂一些钙质材料的诱导剂对牡蛎幼虫的附着变态有促进作用，而天然贝壳的主要材质是CaCO₃，表明幼苗更喜欢在天然贝壳上附着。绿色聚乙烯网片和黑色遮阳网附着效率低，是因为这类材质具有网孔，且表面光滑，在水体中水流作用力下使得海菊蛤不易于固定附着。

本研究中，附着基下层幼苗附着密度要好于上层，这可能是幼苗避光引起的，贝苗的培育采用封闭遮光的环境，因此，在养殖池中，池底深部会比上面的幼苗多，另一方面可能是壳顶幼虫不断生长体重慢慢增加，游泳能力减弱而逐渐沉入水底，因此随着水深的增加附着密度增加。

4 结论

本研究开展了橘色海菊蛤亲本催熟、胚胎及稚贝各发育阶段观察、附着基及不同附着水深效果评估，海上幼贝培育等，实现了橘色海菊蛤室内人工繁育和海上养殖，为该物种的规模化人工繁育以及海上养殖奠定了基础。