α-生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein, α-TTP)是一种可以结合维生素E的蛋白，在机体转运和吸收维生素E方面起到关键的调控作用(Arai et al, 2021)。α-TTP促进α-生育酚从细胞向外周介质转运的现象最早在鼠肝癌细胞中发现(Arita et al, 1997)，随后，Qian (2005)在人肝癌细胞中也发现了同样的现象。α-TTP在哺乳动物中主要分布在肝脏组织，除此之外，在中枢神经系统、脾脏、肺、肾、子宫以及胎盘中也均检测到了α-TTP (刘昆, 2014)。α-TTP对于小鼠胎盘滋养层的发育是必需的(Jishage et al, 2001)，而且在抵抗药物毒性方面也起到非常重要的作用(Shichiri et al, 2012)，α-TTP的缺失或变异会导致维生素E缺乏性共济失调症(Gohil et al, 2008)。α-TTP在维持机体维生素E水平、提高繁殖性能等方面起到重要作用。在斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育过程中，α-TTP可以将维生素E从蛋黄转移到发育中的胚胎，同时促进维生素E从胎盘到胚胎的运输，并调节胚胎发育中的神经系统细胞内的维生素E运输(Head et al, 2021)。目前，关于维生素E对α-TTP表达的影响成为研究热点，但仍没有明确一致的结论。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属于近海大型底栖暖温性动物，其味道鲜美、肉质嫩滑、营养丰富，广受群众喜爱，是我国重要的名贵海水养殖鱼类。目前，关于维生素E对半滑舌鳎的生长、繁殖性能方面的研究已有相关报道(肖登元等, 2015; 王蔚芳等, 2020)，且相关研究已证实维生素E能够影响鱼类垂体中生长激素和促性腺激素的基因表达(Huang et al, 2019; 王蔚芳等, 2020)，这是否与α-TTP有关？目前未见维生素E对鱼类垂体中α-TTP的影响研究。因此，本研究拟通过养殖和细胞培养实验，在克隆α-TTP基因的基础上，探究α-TTP基因在半滑舌鳎各组织分布情况以及维生素E浓度与垂体α-TTP基因表达量之间的关联性，初步探讨α-TTP在介导维生素E影响鱼类生长与繁殖方面的潜在机制。

实验用鱼购自莱州明波水产有限公司(山东)，为当年的同一批孵化培育的成鱼，大小为(464.0±2.6) g。

养殖实验饲料中维生素E (DL-α-生育酚乙酸酯, Sigma)添加量分别为0、200、400、800和1 600 mg/kg，设置5组，每组3个重复。在基础饲料中，以鱼粉、酪蛋白为主要蛋白源，以鱼油、豆油为主要脂肪源，维生素E以逐级混匀方式添加到高筋粉中。饲料配方及营养组成见表 1。所有原料过60目筛后充分混合均匀，并经机械挤压形成颗粒饲料，直径为4 mm，在60 ℃的烘箱中干燥至湿度为10%，然后密封于塑料袋内并保存在–20 ℃的冰柜中以待使用。

表 1(Tab.1)

表 1 实验基础饲料配方及营养组成 Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diet 组成成分 Ingredient 成分配比(干重) Percent in diet (dry weight)/% 鱼粉Fish meal 60.00 酪蛋白Casein 10.00 高筋粉Wheat meal 14.95 磷脂Phospholipid 2.00 鱼油Fish oil 7.00 大豆油Soybean oil 1.00 胆碱Choline chloride 0.50 磷酸二氢钙${\text{Ca}}{({{\text{H}}_2}{\text{P}}{{\text{O}}_4})_2}$ 1.00 维生素C Vitamin C 0.50 维生素混合物1Vitamin premix 1.00 矿物质混合物2Mineral premix 1.00 乙氧喹Ethoxyquin 0.05 海藻酸钠Alginate sodium 1.00 营养成分分析Proximate composition     粗蛋白Crude protein 56.00     脂肪Crude lipid 14.10     灰分Ash 10.20     维生素E Vitamin E/(mg/kg) 8.00 注：1维生素混合物(mg/kg或g/kg饲料)：硫胺素，25 mg；核黄素，45 mg；盐酸吡哆醇，20 mg；维生素B12，0.1 mg；维生素K3，10 mg；肌醇，800 mg；泛酸，60 mg；烟酸，200 mg；叶酸，20 mg；生物素，1.20 mg；维生素A，32 mg；维生素D，5 mg；维生素E，0 mg；次粉，13.67 g； 2矿物质混合物(mg/kg或g/kg饲料)：硫酸镁，1 200 mg；硫酸铜，10 mg；硫酸锌，50 mg；硫酸铁，80 mg；硫酸锰，45 mg；氟化钠，2 mg；氯化钴(1%)，50 mg；硒代硫酸钠(1%)，20 mg；碘酸钙(1%)，60 mg；沸石，13.485 g。 Note: 1 Vitamin premix (mg or g/kg diet): Thiamin 25 mg; Riboflavin, 45 mg; Pyridoxine HCl, 20 mg; Vitamin B12, 0.1 mg; Vitamin K3, 10 mg; Inositol, 800 mg; Pantothenic acid, 60 mg; Niacin, 200 mg; Folic acid, 20 mg; Biotin, 1.20 mg; Retinol acetate, 32 mg; Cholecalciferol, 5 mg; Vitamin E, 0 mg; Wheat middling, 13.67 g. 2 Mineral premix (mg or g/kg diet): MgSO4·7H2O, 1 200 mg; CuSO4·5H2O, 10 mg; ZnSO4·H2O, 50 mg; FeSO4·H2O, 80 mg; MnSO4·H2O, 45 mg; NaF, 2 mg, CoCl2·6H2O (1%), 50 mg; NaSeSO3·5H2O (1%), 20 mg; Ca(IO3)2·6H2O (1%), 60 mg; Zoelite, 13.485 g.

表 1 实验基础饲料配方及营养组成 Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diet

养殖实验在山东莱州明波水产有限公司养殖场进行。正式实验开始前，对所有鱼投喂7 d的基础饲料(表 1)，以适应实验条件。在测量鱼体长和称重后随机分成15组，在15个15 m³的圆形聚乙烯养殖桶中(直径为150 cm，高度为60 cm)进行流水养殖实验，每个桶里放养10尾半滑舌鳎，养殖用水为过滤海水，流速为50 L/min。每3个养殖桶随机分成一组，每天早晚2次投喂相同的饲料，投喂率为鱼体质量的2%，进行为期60 d的养殖实验。实验期间，水温为24~ 27 ℃，盐度为30~31，pH为7.8~8.1。溶解氧 > 5.65 mg/L。每天早上清除粪便和多余的饲料以保持良好的水质条件。

养殖结束后，所有鱼饥饿24 h，丁香油(10 mg/L)麻醉后准确称重，记录终末体重；每个养殖桶随机取3尾鱼，无菌取出垂体用于后续实验。

称取4.76 g HEPES和9.6 g L-15培养基，充分混溶于水，4 h后用NaOH将pH调至7.4，抽滤(除菌)，分装，即制成L-15基础培养基。在L-15基础培养中加入胎牛血清(终体积为5%)、青霉素(终浓度为100 U/mL)、链霉素(终质量浓度为100 μg/mL)，即制成完全培养基，4 ℃保存。所有操作在细胞培养室进行，有专用橱柜和冰箱放置物品，所有解剖工具、器皿等均经高压消毒后使用，实验用水、磷酸缓冲液(PBS)等为无菌型商品。

在细胞培养室的准备室内，用75%酒精浸泡鱼头后，无菌条件下，取20条成鱼垂体组织，移入超净工作台内后更换培养液和培养皿，保证无菌操作。随后垂体组织剪成1 mm³小块，用PBS冲洗，加入0.25%的胰蛋白酶，用量约为组织块的10倍，放入18 ℃水浴锅中45 min。水浴后用2 mL PBS吹打组织块，倒入200目的尼龙网过滤，取滤液以100 ×g速度离心10 min，除去上清液，并重悬沉淀，分装至六孔板，1 mL/孔，置于24 ℃培养箱中进行培养。参考王蔚芳等(2020)的方法进行操作。

细胞培养液中维生素E (DL-α-生育酚乙酸酯, Sigma)浓度参照大菱鲆(Scophthalmus maximus)的相关研究设置(Huang et al, 2019)，实验分为3组，每组3个重复，维生素E添加量分别为0、18和54 μmol/L。将维生素E预先溶解在无水乙醇中，然后加入到L-15完全培养基中(无水乙醇的终浓度为0.1%，v/v)，于24 ℃培养箱中培养3 d (黄滨等, 2017)。

养殖实验结束后，分别在每个养殖桶随机取3尾鱼，无菌取出垂体组织并置于无菌1.5 mL离心管中；细胞实验结束后，将每孔垂体细胞转移至15 mL离心管中，以100 ×g转速离心10 min之后取细胞沉淀，并置于1.5 mL无菌离心管中。加入1 mL TRIzol (Invitrogen, 美国)，按照程序提取总RNA，使用NanoDrop 2000定量并调整至相同浓度备用，并取适量RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA完整度，取质量较好的RNA作为cDNA文库构建的模板。以总RNA模板构建cDNA文库，选用PrimeScript RT regent kit with gDNA eraser (TaKaRa, 日本)进行反转录实验，操作流程参照该使用说明书进行，制成的cDNA文库保存于–20 ℃冰柜中。

根据GenBank半滑舌鳎α-TTP预测基因(XM_008335042.3)编码序列(Coding sequence, CDS)信息设计引物(表 2)，使用cDNA末端快速扩增法(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)进行扩增，具体步骤如下：

表 2(Tab.2)

表 2 本研究所用引物的序列 Tab.2 The primer sequence used in the present study 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) 用途Usage 大小Size/bp F1 GCCTTCCAGGTCTTTAGGGTCA 3´端扩增cDNA-3´ terminal qRT-PCR 22 F2 CTTCGACCTGAGTGGGTGGAGC 22 R3 AACTTTATTTTCCCCACAGACTCA 5´端扩增cDNA-5´ terminal qRT-PCR 24 R4 CAGAGACACCAGAGCCGGCCTTCA 24 F TTTTCCATCAGTGGTGTAGCCGGGTC 验证Verification 26 R GTGCCCCCTGATGGACATGACAAG 24 M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 测序Sequencing 24 RV-M AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24 α-TTP-F GACCAATCACCTGCTCCAGTC 荧光定量PCR qRT-PCR 21 α-TTP-R CTTCCTGTGTCCCGTCCAA 19 18S-F GGTCTGTGATGCCCTTAGATGTC 内参Reference gene 23 18S-R AGTGGGGTTCAGCGGGTTAC 20

表 2 本研究所用引物的序列 Tab.2 The primer sequence used in the present study

α-TTP基因的3´端序列的获得利用两步法，先利用F1和3´Outer Primer进行首轮扩增，然后使用首轮扩增的PCR产物为模板，F2和3´Inner Primer为引物进行第2轮扩增。反应体系为50 μL，反应条件：94 ℃ 1 min预热，然后98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、68 ℃ 1 min，30个循环。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Mini BEST agarose gel DNA extraction kit V4.0切胶回收纯化；将纯化产物使用DNA A-Tailing kit处理后，使用TaKaRa DNA ligation kit V2.1中的连接酶，将产物与T-Vector pMD^TM 20连接后，热转化至E. coli感受态细胞JM109中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性单克隆，使用通用引物M13-47、RV-M进行测序。

α-TTP基因的5´端序列的获得同样利用两步法，先用R3和5´Outer Primer进行首轮扩增，然后利用首轮扩增的PCR产物为模板，以R4和5´Inner Primer为引物进行第2轮扩增。反应体系为50 μL，反应条件：94 ℃ 2 min预热，然后98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化，连接转化，挑选阳性单克隆测序。

最后，将扩增的序列组合在一起并设计引物F-TTTTCCATCAGTGGTGTAGCCGGGT C，R-GTGCCCCCTGATGGACATGACAAG对产物进行验证。反应体系为50 μL，反应条件：94 ℃ 1 min预热，然后，98 ℃ 10 s、55 ℃ 15s、68 ℃ 1 min，30个循环，反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳并测序。

根据半滑舌鳎α-TTP基因序列，通过Primer Premier 5软件进行引物设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物浓度为10 µmol/L。应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析不同水平维生素E处理下垂体α-TTP基因的表达情况。以20×cDNA稀释液为模板进行qRT-PCR扩增，参照TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)试剂盒说明书，扩增体系为20 μL，包括10 μL TB Green^®试剂、0.8 μL PCR正向引物、0.8 μL PCR反向引物、1 μL cDNA模板和7.4 μL RNase-free dH₂O。为减小实验误差，每个样品均设置3个重复，18S核糖体RNA基因作为内参引物，与目的基因在相同条件下进行扩增，引物序列见表 2。反应按95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，58.4 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s, 再依次按照95 ℃15 s、60℃ 15 s、95 ℃ 15 s绘制熔解曲线。实验中，PCR产物通过溶解曲线确定扩增准确性及特异性，使用2^–∆∆Ct法计算mRNA相对表达水平。

扩增全长序列在NCBI数据库中进行BLAST比对和同源性分析，利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)推断其开放阅读框和编码氨基酸序列；利用ClastalX结合MEGA 4.0软件构建系统进化树；利用ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析a-TTP蛋白质的基本理化性质。

所有实验均设置3个平行处理，所得数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示，并通过SPSS 19软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)分析及基于LSD最小显著差异法的多重比较。当P < 0.05时，认为具有显著差异。

经过RACE扩增，拼接后获得一个全长为3 964 bp的序列(图 1)，经NCBI比对发现，其与半滑舌鳎α-TTP预测基因(XM_008335042.3)有99%的相似性。半滑舌鳎α-TTP基因编码293个氨基酸，大小约为33 kDa，等电点为6.21，为不稳定蛋白(稳定系数为63.56)，具有亲水性(总平均亲水性为–0.263)。进一步进化树比对显示，所扩基因(标记为sequence)与半滑舌鳎聚为一支，与其他鱼类相距较远，再次说明所扩基因为半滑舌鳎α-TTP基因(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 1 半滑舌鳎α-TTP基因序列 Fig.1 The sequence of C. semilaevis α-TTP gene 划横线部分为CDS区，大写字母为对应的编码氨基酸，*为终止密码子。 The underlined part is the CDS region, the capital letter is the corresponding coded amino acid, and an asterisk represents the termination codon.

图 1(Fig. 1)

图 2 半滑舌鳎α-TTP基因进化树 Fig.2 The α-TTP gene evolutionary tree of C. semilaevis

经qRT-PCR检测发现，α-TTP基因在半滑舌鳎11个不同组织中均有表达，但表达量存在很大差异，在脾脏中相对表达量最高，其次是肾脏，在胃中相对表达量最低，具体表达情况见图 3。

图 1(Fig. 1)

图 3 α-TTP基因在半滑舌鳎各组织中的相对表达情况 Fig.3 Relative expression of α-TTP gene in tissues of C. semilaevis

在养殖实验中，垂体中α-TTP的表达量随饲料中维生素E含量的增加而呈先升高后降低的趋势，并在维生素E达到400 mg/kg时，其表达量显著高于其他4组(P < 0.05)，比对照组高7.11倍，比其他组高3~4倍，而其他4组之间α-TTP表达量无显著差异(图 4)；在体外细胞实验中，α-TTP表达量随维生素E含量的持续升高而升高，并在54 μmol/L组达到最高，显著高于对照组，是对照组的1.37倍(P < 0.05)(图 5)。

图 1(Fig. 1)

图 4 饲料中维生素E含量对半滑舌鳎垂体组织α-TTP基因表达的影响 Fig.4 Effects of dietary vitamin E content on α-TTP expression in pituitary tissue of C. semilaevis 不同字母表示差异显著(P < 0.05), 下同 Different letters indicate significant difference (P < 0.05), the same below.

图 1(Fig. 1)

图 5 维生素E浓度对半滑舌鳎垂体原代细胞α-TTP基因表达的影响 Fig.5 Effects of vitamin E concentration on α-TTP expression in pituitary cells of C. semilaevis

经过60 d的养殖实验，生长数据表明饲料中维生素E含量对半滑舌鳎的生长影响不显著(P > 0.05)，但其终末体重随着维生素E的添加呈先升高后降低的趋势，并在维生素E添加400 mg/kg时最高(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 6 饲料中维生素E含量对半滑舌鳎生长的影响 Fig.6 Effects of dietary vitamin E content on growth of C. semilaevis

维生素E是具有保护细胞膜免受过氧化损害的抗氧化剂，α-生育酚转移蛋白(α-TTP)是调控机体维生素E含量的重要因子。目前，关于α-TTP的研究主要集中在哺乳动物上，有关鱼类α-TTP的研究还较少。本研究通过RACE法克隆了半滑舌鳎的α-TTP基因，其编码293个氨基酸，分子质量约为33 kDa，这与哺乳动物中α-生育酚转移蛋白的大小几乎相一致，但其3 964 bp的基因全长远大于绵羊的1 098 bp (左兆云, 2014)。半滑舌鳎α-TTP基因在全身各组织广泛表达，这与哺乳动物α-TTP表达情况类似(Hosomi et al, 1998; Kaempf-Rotzoll et al, 2002; Shichiri et al, 2012)，但哺乳动物α-TTP主要在肝脏组织中表达(Yoshida et al, 1992; Sato et al, 1993; Arita et al, 1995)，而半滑舌鳎α-TTP在脾脏和肾脏中表达量最高，这可能是由种属差异导致的。

α-TTP能够特异识别α-生育酚(维生素E)侧链结构(Chow et al, 2015)，因此，α-TTP的突变也会相应引发维生素E缺乏症，但α-TTP的表达量是否受维生素E摄入水平的影响尚不明确。近年来，研究人员针对维生素E对α-TTP表达水平的影响进行了广泛的研究，但研究结果并不尽一致，有的甚至相互矛盾。Thakur等(2010)在人肝癌细胞的研究中发现，添加维生素E后显著提高了α-TTP的表达水平；刘昆等(2014)在滩羊饲料中添加高水平的维生素E显著提高了滩羊肝脏中α-TTP的蛋白含量。本研究中，无论是养殖实验还是体外细胞实验，添加维生素E均可以显著提高垂体α-TTP基因的表达水平。然而，在小鼠(Chen et al, 2012)、猪(Lauridsen et al, 2013)和斑马鱼(Watt et al, 2021)的研究中发现，饲料中添加维生素E对其肝脏α-TTP基因表达水平均未产生显著影响。据此，有学者认为，由于肝脏中α-TTP的含量充足，因此，不会随着维生素E含量的变化而发生明显的改变(Bella et al, 2006)。但Thakur等(2010)研究发现，维生素E可以同α-TTP结合并改变其构象，然后降低其降解速率，提高α-TTP的表达水平。维生素E对α-TTP表达的调节机制十分复杂，研究结果存在差异，其分子机制尚有待进一步的研究。

垂体在鱼类的生长和繁殖过程中发挥重要的作用(林浩然, 2011)。垂体在接收脑部传来的信号后合成生长激素、促性腺激素等，并通过轴突将激素释放到血液中，进而通过血液运送到靶细胞(组织或器官)，发挥激素的生理功能。由于垂体组织很小，其大小接近半个米粒，因此，很难检测组织中营养素(如维生素E)的含量，限制了营养素对垂体影响的评估，因此，有必要寻找一个可替代评价的敏感指标。鉴于α-TTP与维生素E的密切关系，以及维生素E与生长激素、促性腺激素等之间的关联已被证实(Huang et al, 2019; 王蔚芳等, 2020)，本研究也试图探讨α-TTP成为评价维生素E影响鱼类生长和繁殖的一个潜在指标的可行性。本研究结果表明，维生素E参与了垂体α-TTP基因的表达，其表达量受维生素E剂量影响。在养殖实验中，垂体α-TTP基因表达量随着饲料中维生素E添加量的增加呈先升高后下降的趋势，并在添加量为400 mg/kg时表达量最高，且显著高于其他各组(P < 0.05)，其结果也与本研究中半滑舌鳎的生长趋势吻合，生长指标也在添加400 mg/kg维生素E时表现最优异。张志强等(2017)和覃希等(2014)的研究也指出，饲料中维生素E的缺乏或过量能够影响鱼的生长，其影响模式与本研究中α-TTP基因变化趋势相符。然而，高剂量的维生素E (1 200 mg/kg)却有效提升了半滑舌鳎亲鱼的繁殖性能(肖登元等, 2015)。在亲鱼垂体中α-TTP基因表达量是如何响应饲料中维生素E含量的变化，值得进一步探索。另一方面，体外细胞实验结果显示，没有出现α-TTP基因表达量下调的现象，今后可进一步增加其浓度梯度开展实验；但体外实验进一步证实了垂体中α-TTP基因受到维生素E浓度的影响。本研究结果表明，垂体α-TTP基因的表达响应了饲料中维生素E含量的变化，可成为指示垂体中评价维生素E影响鱼类生长和繁殖的潜在评价指标，在日后的相关研究中可以进一步考虑二者之间的关联性并加以验证。

本研究克隆了半滑舌鳎α-生育酚转移蛋白基因α-TTP，其在半滑舌鳎各组织均有表达，并在脾脏中表达最高，其次是肾脏，在胃中表达量最低。饲料中添加400 mg/kg的维生素E时，其垂体中α-TTP基因表达量最高，饲料中维生素E含量不足或过量都会降低其表达。