2. 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食品产出过程功能实验室 山东 青岛 266071
2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266071, China
对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)流行面广、致病性强、死亡率高，在全球对虾养殖地区肆虐，一旦暴发难以治疗，造成大批对虾发病死亡，给中国乃至全球对虾养殖业带来了数百亿元的经济损失(贾丹等, 2018; Soto-Rodriguez et al, 2015; 韩琳等, 2018)。从AHPND流行特点和防控实践来看，该病传播速度快、治愈难度大，一直是国内对虾养殖业面临的严峻考验(陈蒙蒙等, 2018)。随着AHPND病理病因的深入研究，人们逐步认识到及时预警和预防能够有效地规避或减少因该疾病发生导致的经济损失，并有利于防控操作和健康养殖生产。
病害预测以病原生态学为基础，定量调查与动植物病害发生发展和传播密切相关的影响因素，运用数理分析方法，依据若干关键的主效因素建立疾病流行发展的数学模型，进而实现预报疾病的发生。符合客观规律的疾病预测的准确度和精确度在很大程度上取决于所选择的数学分类方法。目前常用的有近40种之多(高争光, 2020; Ha et al, 2017)。近30年来，人工智能被广泛地应用到许多学科领域，取得的成果也较为丰富多样(Underwood et al, 2021; 万强等, 2016; Hamer et al, 2020)。
预警预报是目前病害防控研究的热点和焦点。近年来，国内外研究人员在农作物灾害风险预警方面取得了丰硕的研究成果，并将该技术广泛应用于农作物生产实践中的病害防控领域，对于农业病害的防控和维持农业经济稳定有较强的指示作用(Huang et al, 2019; Rumpf et al, 2010; 毕春光等, 2021)。我国水产动物病害预警预报的相关研究比较薄弱，主要是依据采集分析养殖水质来对鱼类疾病发生趋势进行预测预报研究(马真, 2013; 徐云娟, 2017)。水产动物疾病的发生是病原、宿主与环境因素相互作用的结果，确定与疾病发生相关的主效因子，再结合合适的数学分类算法进行疾病的预报，能保证预警模型的精确性和可靠性(Beaz-Hidalgo et al, 2010; Paillard et al, 2004)。而关于对虾AHPND预测方面的预报模型尚未有报道，研究建立对虾AHPND预警预报模型，不仅能为对虾疾病的预警预报体系构建提供人工智能算法，也可为对虾养殖业的健康发展提供技术支撑。
本研究通过采集关于对虾AHPND发生相关的环境理化因子、微生物因子和机体自身免疫因子等18个候选预警因子参数，通过归一化处理和Pearson相关性分析，逐一剔除不相关因子，基于Python语言编程结合Deep Forest算法进行数据建模，仿真环境为Python2.7，同时采用不同的基于决策树的优化方法进行预测准确率和性能比较，初步构建基于Deep Forest算法的池塘养殖凡纳对虾(Penaeus vannamei)急性肝胰腺坏死病的预警模型。
1 数据采集从2020年7月开始，对于河北省沧州市某对虾养殖区域内4口池塘的养殖参数、发病情况进行监测。池塘面积为2.4~3.3 hm2，投放密度约为22.5万尾/hm2，检测起始期凡纳对虾平均体重约为(7.0±1.0) g/只；每次采样记录凡纳对虾的体色、活力、摄食强度、健康程度和生产管理情况以及理化因子和生物因子。根据“环境–病原–宿主”三者间的辩证关系，结合AHPND发生相关因子的定性分析，本研究选取18个可能影响对虾AHPND发生的环境、病原及免疫因子进行监测(表 1)，包括环境因子(气温、水温、盐度、pH、DO、氨氮、亚硝态氮)，病原因子[水体内可培养细菌和弧菌(Vibrio)总数及弧菌占比、虾体内(肝胰腺内)可培养细菌和弧菌总数及弧菌占比]，宿主免疫因子[碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)]，相关样品采集方法及数据信息参考于永翔等(2023)。
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表 1 数据分析所用参数列表 Tab.1 List of parameters used in data analysis |
气温根据采样时的天气预报显示值记录，水温、盐度、DO和pH采用YSI便携式水质测定仪(美国)测定，氨氮和亚硝态氮采用WTW 6600分光光度仪(德国)结合氨氮和亚硝态氮检测试剂盒测定，可培养细菌和弧菌数量根据TSB和TCBS平板培养计数推算测定，虾体和水体弧菌占比通过计算获得，对虾肌肉免疫酶活性使用南京建成生物技术有限公司的免疫酶活试剂盒测定(于永翔等, 2023)。
2 数据预处理 2.1 剔除无效数据同一模式条件下共采集到相关数据140组，对养殖过程中采集到的额外泼洒外源投入品的组别进行剔除，保证数据具有一定的自然客观性和科学性。通过删除无效数据，已分类监测数据有100组，包括发病数据25组，健康数据75组。
2.2 数据标准化处理由于不同影响因子之间存在的量纲和数量大小差异会对构建模型造成影响，为提高后续实验训练的速度和预测的精度，对处理好的100组训练测试数据采用mapminmax函数对其进行归一化处理，使处理后的数据分布在[0，1]之间。用X表示第1个变量，用Y表示第2个变量，它们分别是X=(x1, x2, ……, xi)；Y=(y1, y2, ……, yi），其中，max(x)和min(x)分别表示X变量的最大值和最小值。函数公式如下：
| $ {y_i} = \frac{{{x_i} - \min (x)}}{{\max (x) - \min (x)}} $ | (1) |
对虾病害发生与环境因子、微生物因子以及对虾机体自身免疫因子密切相关，而这些因子之间又存在错综复杂的联系，其中一个变量的变动会引起另一些变量的联动。使用SPSS 21软件进行Pearson相关分析，分析各个影响因子与疾病发生情况以及相互之间的相关性，并进行假设检验计算P值。如果用X表示第1个变量，用Y表示第2个变量，它们分别是X= (x1, x2, …, xn)；Y= (y1, y2, …, yn)，那么Pearson相关系数由下式定义：
| $ r = \frac{{\sum\limits_{i = 1}^n {\left( {{x_i} - \bar x} \right)} \sum\limits_{i = 1}^n {\left( {{y_i} - \bar y} \right)} }}{{\sqrt {\sum\limits_{i = 1}^n {{{\left( {{x_i} - \bar x} \right)}^2}} \sum\limits_{i = 1}^n {{{\left( {{y_i} - \bar y} \right)}^2}} } }} $ | (2) |
式中，
Deep Forest算法的预测过程分为2个阶段：多粒度扫描阶段(multi-grained scanning)和级联森林阶段(cascade forest)。Deep Forest算法流程具体实现步骤主要是对原始数据序列进行算法的预处理，利用Deep Forest算法对训练样本集进行训练，最后利用预测样本的特征序列进行预测(林鹏程等, 2019)。
4 结果与分析 4.1 确定训练集和测试集通过预处理的100组数据，随机挑选70%的样本数据作为训练集，另外的30%样本数据作为测试集。
4.2 对虾发病与参数因子的相关性分析Pearson相关分析表明(表 2)，对虾发病与虾体细菌总数、虾体弧菌总数、LZM、虾体弧菌占比、水体细菌总数、盐度、ACP、水体弧菌和PO等9个参数具有显著正相关性(P < 0.05)，相关系数分别为0.574 1、0.521 1、0.438 2、0.391 1、0.374 7、0.350 1、0.257 1、0.238 3和0.228 9，表明在一定范围内这些参数值升高，该病害更易发生、更严重；与高温期水温呈显著负相关性(P < 0.05)，其相关系数为–0.227 9，表明在高温期，水温降低病害更容易发生。而气温、pH、DO、氨氮、亚硝态氮、水体弧菌占比、AKP和SOD等8个参数与对虾发病相关性不大(P > 0.05)。
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表 2 各参数因子与病害发生的相关性分析结果 Tab.2 Correlation analysis results of each parameter factor and disease occurrence |
一般界定变量相关系数的绝对值处于0.8~1.0之间为极强相关关系，0.6~0.8之间为强相关关系，0.4~0.6为中等程度相关关系，0.2~0.4为弱相关关系，0~0.2为极弱相关或不相关(Schober et al, 2018)。其中，病害发生与虾体细菌总数、虾体弧菌总数和LZM的相关系数的绝对值均介于0.4~0.6之间，为中等程度相关关系；虾体弧菌占比、水体细菌总数、盐度、ACP、水体弧菌、PO和水温等参数的相关系数绝对值均介于0.2~0.4之间，为弱相关性关系，说明各种影响发病显著的参数因子影响程度也存在差异，进一步说明各参数与病害发生的关系较为复杂。
4.3 预报因子的删选相关性分析表明(图 1)，虾体细菌总数、虾体弧菌总数、LZM、虾体弧菌占比、水体细菌总数、盐度、ACP、水体弧菌、PO和水温等10个参数与对虾AHPND发生都存在显著相关性，是最相关的前10个特征值，可以作为预报模型构建的预选指标。
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图 1 对虾AHPND发生最相关的10个特征值相关性热力图 Fig.1 Heatmap of the correlation between the 10 most relevant eigenvalues for the incidence of AHPND |
考虑到这些参数因子之间可能相互影响，即一个参数的变动会引起另一些参数的变动，因此，通过Pearson分析进一步探究各因子之间的相关性关系，逐一剔除对因变量影响不显著或间接作用的因子，因子间相关系数见表 3。
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表 3 参数因子之间的相关性分析结果 Tab.3 Correlation analysis results between parameter factors |
(1) 监测高温期水温与虾体细菌、虾体弧菌、虾体弧菌占比、水体细菌和LZM等因子呈一定的负相关性关系，且相关系数绝对值均介于0.2~0.4之间，为弱相关性关系，说明随着高温期水温降低这些因子会呈一定程度的升高。与盐度、水体弧菌、PO和ACP等因子相关系数绝对值均低于0.2，说明监测期内水温与这些因子之间为极弱相关关系。
(2) 盐度与虾体弧菌占比、PO、ACP和LZM等因子呈一定的正相关性关系，且与PO、ACP和LZM相关系数的绝对值均大于0.4，为中等程度相关，与虾体弧菌占比相关系数的绝对值为0.37，呈弱相关，说明盐度升高会引起这些因子不同程度的升高；与其他因子相关系数绝对值均低于0.2，为极弱相关。
(3) 虾体细菌与虾体弧菌、虾体弧菌占比、水体细菌、水体弧菌、PO、ACP和LZM均呈正相关性关系，因为虾体弧菌数量也包含在细菌总数中，所以虾体弧菌直接影响虾体细菌的数量，其相关系数绝对值为0.91，为极强相关，与水体细菌、虾体弧菌占比和LZM相关系数绝对值介于0.4~0.6之间，为中等程度相关，与水体弧菌和ACP相关系数绝对值介于0.2~0.4之间，为弱相关。与PO相关系数绝对值为0.17，为极弱相关。
(4) 虾体弧菌与虾体弧菌占比、水体细菌、水体弧菌、PO、ACP和LZM均呈正相关性关系，其中虾体弧菌占比是虾体弧菌与细菌的比值，受虾体弧菌数量的直接影响，相关系数绝对值为0.69，为强相关；与水体细菌和LZM相关系数绝对值介于0.4~0.6之间，为中等程度相关；与水体弧菌和ACP相关系数绝对值介于0.2~0.4之间，为弱相关；与PO相关系数绝对值为0.19，为极弱相关。
(5) 虾体弧菌占比与水体细菌、水体弧菌、PO、ACP和LZM均呈正相关性关系，与LZM相关系数绝对值为0.49，为中等程度相关；与PO和ACP相关系数绝对值介于0.2~0.4之间，为弱相关；与水体细菌和水体弧菌相关系数绝对值介于0~0.2之间，为极弱相关。
(6) 水体细菌与水体弧菌、PO、ACP和LZM均呈一定程度的正相关性关系，其中，与水体弧菌和LZM相关系数绝对值介于0.2~0.4之间，为弱相关；与PO和ACP相关系数绝对值介于0~0.2之间，为极弱相关。
(7) 水体弧菌与PO、ACP和LZM相关系数的绝对值均介于0~0.2之间，为极弱相关；
(8) PO与ACP、LZM相关系数的绝对值分别为0.96和0.66，均为强相关；与ACP和LZM相关系数的绝对值为0.66，为强相关。
综上所述，在与对虾发病特征排序前10的因子中，虾体细菌与虾体弧菌高度相关，与虾体弧菌占比、水体细菌和LZM中等程度相关，虾体弧菌占比直接受虾体弧菌和虾体细菌的共同调控，水体细菌与虾体弧菌也呈中等程度相关，说明在对虾整个养殖系统中，可培养微生物在水体和动物机体中的关联度较高；LZM与盐度、PO和ACP强相关，与虾体细菌和虾体弧菌等中等程度相关，盐度与PO和ACP中等程度相关，说明环境因子和病原微生物的外界刺激可能会激发宿主免疫应激反应，且LZM、PO和ACP可能存在一定的协同作用。在参数进行降维处理构建模型的过程中，根据参数因子之间的相关性关系对参数进行剔除，优先可以采用虾体细菌总数、虾体弧菌总数或虾体弧菌占比、LZM、水体细菌总数、盐度和水体弧菌作为预报模型构建的预选指标。
4.4 预报模型的构建利用Deep Forest算法进行模型构建的同时，选取了LightGBM (LGB)和XGBoost (XGB)等2种基于决策树的集成学习方法算法对相同预报因子参数构建模型，并将预测效果与Deep Forest预测效果进行比较分析，评判不同维度参数和不同算法构建模型的预测效果和可行性，进而选择最适于对虾AHPND发生的预报模型。本章预测算法程序均基于Python语言编程，主要程序运行代码如下：
Deep Forest算法：
from sklearn.datasets import load_digits
from sklearn.model_selection import train_test_split
from sklearn.metrics import accuracy_score
from sklearn.model_selection import KFold
from deepforest import CascadeForestClassifier
import pandas as pd
LightGBM算法：
import lightgbm as lgb
import pandas as pd
from sklearn.metrics import mean_squared_error
from sklearn.metrics import accuracy_score
from sklearn.model_selection import train_test_split
from sklearn.model_selection import GridSearchCV
from sklearn.model_selection import
KFoldXGBoost算法：
from sklearn.datasets import load_iris
from sklearn.model_selection
import train_test_splitimport xgboost as xgb
import pandas as pd
from sklearn.model_selection import KFold
4.5 预报模型的准确度评判将与发病影响显著的特征排序前10的因子，即：虾体细菌总数、虾体弧菌总数、LZM、虾体弧菌占比、水体细菌总数、盐度、ACP、水体弧菌、PO和水温，按照相关性从大到小排列，从低维度到高维度依次进行组合，建立1~10参数的对虾AHPND预测模型，并通过模型预测准确率来评判。
模型预测结果如表 4所示，不同维度参数组合基于不同算法构建的模型的预测准确率不同，最高可达89.00%。基于Deep Forest算法，参数维度由l~8的模型准确率随着维度增加逐步提高，同时，随着维度增加，其准确率降低但幅度较小，其中，只有8维模型的预测准确率最高(89.00%)，其次是6维和9维模型(88.00%)，5维和10维模型准确率为87.00%，2~4维模型准确率为85.00%，1维模型准确率最低(73.00%)，说明维度过高或过低参数组合的模型都会影响模型的准确率。
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表 4 不同维度参数组合、不同算法分类结果比较 Tab.4 Comparison of classification results of different dimension parameter combinations and different algorithms |
基于XGBoost算法，参数维度l~10的模型准确率范围随着维度增加存在较大幅度波动，预测模型的稳定性还需进一步研究，只有5维模型准确率最高(89.00%)，其次是6维模型(85.00%)。1维模型比基于Deep Forest算法的模型准确率高出10.00%，为83.00%，10维模型比基于Deep Forest算法的模型准确率低9.00%，为78.00%，其精确度和可适用性还需要后续进一步验证。基于LightGBM算法，参数维度l~10的模型准确率不随维度的变化而变化，一直保持在75.00%，预测效果稳定、准确率较低，缺乏针对性和特异性，推测该算法可能不适用本研究数据的模型构建。3种算法对比结果显示，Deep Forest算法针对对虾AHPND发生构建的模型性能要优于XGBoost和LightGBM两种算法。
4.6 模型的进一步构建根据参数因子之间的相关性分析结果进一步筛选剔除后，将与发病影响显著的特征排序前7的因子，即：虾体细菌总数、虾体弧菌总数、LZM、虾体弧菌占比、水体细菌总数、盐度和水体弧菌，按照相关性从大到小排列，从低维度到高维度依次进行组合，建立2~7维参数的对虾AHPND预测模型，并通过模型预测准确率来评判。
模型预测结果如表 5所示，不同维度参数组合基于不同算法构建模型的预测准确率也各有不同。其中基于Deep Forest算法，整体比参数因子筛除之前的同维度模型的准确率有了一定程度的提高。准确率最高(89.00%)的模型为4、5、7维参数组合，分别比之前提高了4.00%、2.00%、3.00%；其次为88.00%的4维(序号4)和6维模型(序号8)，4维模型比之前提高了3.00%，6维模型准确率与之前相同；5维模型的准确率保持不变(87.00%)(序号6)；3维和4维模型的准确率均提高了1.00%，为86.00% (序号2、3)。
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表 5 筛选因子的不同维度组合、不同算法分类结果比较 Tab.5 Comparison of classification results of different dimension combinations and different algorithms of screening factors |
基于XGBoost算法，模型准确率随着参数维度的增加依然存在较小范围内的波动，整体比基于Deep Forest算法模型的准确率偏低。其中，准确率最高(89.00%)的模型依然为4维参数组合模型(序号5)，相比之前提高了6.00%；其次为准确率为86.00%的4维模型(序号3)，准确率提高了3.00%；准确率为85.00%的4维模型比之前提高了2% (序号4)、5维模型比之前降低了4.00% (序号6、7)，预测效果不稳定。基于LightGBM算法，所有参数维度的模型准确率一直保持在75.00%不变，且远远低于另外2种算法，可能对于对虾AHPND模型预警没有指导意义。
综合看来，Deep Forest、XGBoost、LightGBM三种算法对于不同维度参数组合构建模型的预测效果各不相同，其中，基于Deep Forest算法的模型准确率较高，随着参数组合维度变化，构建的模型准确率变化也较稳定，在一定程度上认为对于对虾AHPND发生具有积极的指导意义，所以本研究优先选择Deep Forest算法来构建对虾AHPND发生的预警模型。
其中，基于Deep Forest算法准确率最高(89.00%)的有4、5、7维模型，因为高维度的预测模型参数数量较多，较为复杂，在实际操作过程中的工作量较大，采集数据难以及时完成，因此，基于实践应用优先选择低维度、准确率高的参数组合来建立对虾AHPND的预测模型。本研究选择由X1、X4、X5和X6参数所构建的4维模型，即虾体细菌总数、虾体弧菌占比、水体细菌和盐度4个参数来构建对虾AHPND发生预警预测模型。
5 讨论Deep Forest的深度学习将传统机器学习模型中的随机森林作为基础模型，是基于集成模型的深度模型，它也可以在除了大规模图像数据之外的任务中获得和深度神经网络相似的表现，通过在现有模型基础上改进能够比较快进入应用。目前，在保险购买预测场景领域(林鹏程等, 2019)、电力系统短期负荷预测领域(陈吕鹏等, 2018)已实现广泛应用。本研究构建了基于Deep Forest算法的4维预警模型即虾体细菌总数、虾体弧菌占比、水体细菌和盐度4个参数来对对虾AHPND发生进行预测预报，准确率为89.00%。Deep Forest算法构建的模型准确率高、预测效果稳定，对于预测对虾AHPND发生具有积极的实践性应用价值。其中，虾体内病原微生物含量扩增是影响对虾AHPND暴发的主要因素，与水体中病原微生物存在一定相互影响，和盐度共同影响导致机体的免疫力下降。有研究表明，随着盐度等环境因子的变化，引起水生动物因渗透压不适而抗病力下降，病原微生物大量扩增会在短时间内引起发病和死亡，这与本研究结果一致(Schofield et al, 2021)。盐度高也代表着池水有机物大量积累、病原微生物增殖的状态，意味着疾病发生的风险增大。因此，本研究在预警模型中保留盐度参数具有重要含义和意义。温度变化会导致水质变化加快，水质的不稳定容易引起疾病暴发(Karvonen et al, 2010; 张健龙, 2016)。池塘养殖过程中，水温受气温和降雨的影响，其改变会引起水体中DO、pH、氨氮和亚硝态氮的联动变化(于永翔等, 2023)。但水温变化短期波动较慢，并且在适宜范围内的水温变化对微生物增殖和对虾机体免疫的影响较低且具有滞后性，Pearson相关分析也表明，当日检测的水温与病原微生物丰度和对虾免疫酶活性的相关性较低。而虾体细菌总数、虾体弧菌占比、水体细菌和盐度4个参数的权重高于温度。
目前，国内外许多学者已报道了较多水产动物病害预警模型，大量研究在水质预警方面积累了良好的经验。其中，Silva等(2016)构建了基于潮汐、水温和盐度等环境因子的有害藻华预警系统，预测准确性高达85%。周瑞娟(2011)利用多元线性回归、灰色系统理论和BP神经网络等构建了基于水温、透明度和风力等环境因子的大黄鱼(Larimichthys crocea)主要细菌性疾病预警模型，其中BP神经网络模型准确率最高达到81.53%。蔡晓鹏(2013)利用多元线性回归、随机森林算法构建了基于水温、溶解氧和化学耗氧量等环境因子的大黄鱼刺激隐核虫病(cryptocaryoniosis)预警预报模型，其中随机森林模型准确率最高达到83.60%。
水产养殖动物的病原主要以病毒、细菌和寄生虫3类为主，目前国内外关于病原相关指标应用于水产病害预警方面的研究报道还较少，其中，冯振飞等(2009)利用多元线性统计方法构建了基于盐度、降雨量和弧菌数的养殖锯缘青蟹(Scylla serrata)黄水病预报模型，其准确率达84.90%，可以较好地用于测报黄水病发病率。宋林生(2020)利用BP神经网络构建了基于海水温度、叶绿素含量、弧菌丰度、养殖动物总抗氧化能力和闭壳肌糖原含量的虾夷扇贝病害预警预报体系，其预测效果较好。传统的水产疾病学理论认为，疾病的发生是病原、宿主和环境三者相互影响和作用的结果。笔者认为，病原的存在是疾病发生的重要前提，疾病预警模型体系中包含病原这一指标是有必要的。本研究构建的基于Deep Forest算法的4维预警模型的准确率为89.00%，高于上述没有病原指标的几种预警模型的准确度。
本研究通过对凡纳对虾AHPND发生前后的水质因子、健康指标、病原结构三者的协同属性进行分析，建立量化评判指标，解析其变化情况与疾病发生的相关性，并运用多元统计理论和数学演算模型，建立不同参数的相关性方程，确定各个参数在疾病发生过程中的权重大小，进而构建不同疾病的预警数学模型。其中，基于Deep Forest算法构建的AHPND预警模型准确率较高，并依据因子之间的相关性关系逐步分析筛除，选择以虾体细菌总数、虾体弧菌占比、水体细菌和盐度4个参数构建对虾AHPND发生预警预测模型。本研究突破了水产养殖系统环境因子、病原数量和宿主健康程度在疾病预警模型中的相关性分析技术，创新水产动物疾病预警的理论体系，为我国水产病害的科学预警和有效防控奠定了技术基础。
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