病害问题是制约对虾养殖业绿色发展的瓶颈问题，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失，对相关病原的定期监测是解决该问题的有效途径之一。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)和造成对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)的副溶血弧菌(Vibrio parahemolvticus, VP)是对虾养殖业中常见的2种致病微生物。其中，EHP是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫(段健诚等, 2022)，主要寄生在对虾肝胰腺组织中，导致对虾肝胰腺病变萎缩，生长缓慢(侯子豪, 2022; 段健诚等, 2019; 李英瑕等, 2022)。EHP宿主广泛，包括凡纳对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)和脊尾白虾(Palaemon carincauda)等；AHPND是由携带毒力基因质粒PirA/B的弧菌导致的病害，此类疫病于2010年首次在我国和越南发现，曾在我国南方地区的对虾养殖场大面积暴发。随后相继出现于马来西亚、泰国、墨西哥和菲律宾等国(孙卫芳等, 2019)。已有报道表明，斑节对虾、凡纳对虾、中国对虾(Penaeus chinensis)、日本对虾(Penaeus japonicus)均为AHPND的易感宿主(陈平亚等, 2022)，患病对虾肝胰腺组织中可检测到致病弧菌，并造成肝胰腺萎缩(Han et al, 2015)。除此之外，已知的多数对虾病原，诸如甲壳类虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)等对对虾肝胰腺组织均具有亲嗜性。DIV1感染后会造成肝胰腺苍白萎缩(Qiu et al, 2021; 许昊川等, 2021)，组织病理学检查显示，感染DIV1的对虾肝胰腺中可见嗜酸性粒细胞和胞浆内的深色嗜酸性包涵体，部分包被或含有微小的嗜碱性染色，血细胞固缩；WSSV和TSV等也可以造成肝胰腺苍白萎缩的症状(绳秀珍等, 2022)，IHHNV可以造成凡纳对虾的肝胰腺肿大(任春华等, 2002)。因此，以对虾肝胰腺组织样品制备待检测核酸样本，可广泛应用于已知的大多数对虾病原的检测。

核酸等温扩增技术摆脱了常规核酸变温扩增过程对PCR扩增仪器的依赖，广泛应用于现场快速检测过程中。目前，等温扩增技术涵盖了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)以及重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)等。其中，RPA是近年发展起来的一类利用重组酶促进寡核苷酸引物在DNA双链互补序列中的插入和结合，在Bsu DNA聚合酶的作用下实现对DNA的特定区域进行指数扩增的技术(Deng et al, 2015)。具有反应时间短、特异性强、灵敏度高、可以在37~42 ℃恒温工作等特点，适用于室外的检测与分析(Lobato et al, 2018)，结合侧向流层析试纸条技术(lateral flow dipstick, LFD)读取检测结果，操作简单，耗时短，且具有较高的特异性和灵敏度，是一种新兴的适用于现场快速检测的方法。RPA-LFD技术与简化的核酸提取方式相结合，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

核酸提取过程是核酸检测的限速条件之一。首次报道的核酸提取方法是Meselson等(1957)用密度梯度离心法提取DNA，后续又出现了通过胍盐裂解法(Bowtell, 1987)、碱裂解法(迟原龙等, 2018)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)裂解法(Murray et al, 1980)、酚抽提法、煮沸法(孙嘉峰等, 2015)、超声波法(麦重伟, 2016)、基于二氧化硅和磁珠的固相提取法、基于纸片的核酸提取方法(Zou et al, 2017)等相关报道。目前的试剂盒核酸提取纯化法，包括裂解、结合、清洗和洗脱等步骤，能提取出高质量、高纯度的核酸，多被科研院所和大型企业实验室所采用，还可结合磁珠法实现全自动提取。然而，其过程繁琐、耗时长，不适用于快速检测的需求。目前，尚未见核酸释放剂与RPA-LFD技术相结合检测对虾组织病原微生物的相关报道。因此，简化对虾病原检测过程中的核酸提取过程，研制一种适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺中DNA样品的快速制备试剂，具有广泛的应用前景。本研究旨在针对对虾肝胰腺组织研制一种核酸样品快速制备试剂，进一步实现EHP和AHPND的现场快速检测。

1 材料与方法 1.1 实验材料

Tris-HCl、KCl、乙二胺四乙酸二钠(EGTA₂Na)、十二烷基硫酸锂(LDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、牛血清白蛋白(BSA)、明胶、海藻糖和甜菜碱购自北京索莱宝科技有限公司；试纸型核酸扩增试剂盒购自苏州先达基因科技有限公司。实验样本为对虾肝胰腺组织，由中国水产科学研究院黄海水产研究所保存，阳性样本经实验室检测确定为EHP阳性和AHPND阳性，阴性样本经实验室检测确定为EHP阴性和AHPND阴性。

1.2 引物合成及探针制备

EHP和AHPND检测引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。检测EHP引物序列(马超等, 2022)和AHPND的引物序列(董井泉等, 2020)见表 1。

1.3 核酸释放剂配制及EHP和AHPND检测模板制备

核酸样品快速制备试剂(核酸释放剂)组分配比使用方法见表 2。按照表 2配制核酸释放剂，分别取30 mg (绿豆大小)经实验室检测确定为EHP阳性和EHP阴性、AHPND阳性和AHPND阴性的对虾肝胰腺组织加入100 μL不同配比的核酸释放剂，100 ℃加热3 min，离心后取上清液，作为检测模板待用；同时分别取EHP阳性和EHP阴性、AHPND阳性和AHPND阴性的对虾肝胰腺组织，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取核酸，作为检测模板待用。

1.4 EHP的RPA-LFD检测的反应体系及反应条件

用试纸型核酸扩增试剂盒进行RPA-LFD检测。每个干粉反应管中分别加入试剂盒配套的缓冲液、EHP上下游引物各2 μL (10 μmol/μL)，探针1 μL (10 μmol/μL)及经1.3中核酸释放剂处理过的模板2 μL或海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取核酸模板2 μL。37 ℃反应30 min。反应结束后用无菌水稀释20倍，插入试纸条，读取检测结果。比较用2种方法提取的核酸进行RPA-LFD检测的效果。

1.5 AHPND的RPA-LFD检测的反应体系及反应条件

根据1.4的结果，选取最优组合的核酸释放剂处理AHPND阳性和AHPND阴性样本，用试纸型核酸扩增试剂盒进行RPA检测。在每个干粉反应管中加入试剂盒配套的缓冲液、AHPND上下游引物各2 μL (10 μmol/μL)，探针1 μL (10 μmol/μL)及经1.4中筛选出的核酸释放剂处理过的模板2 μL或海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取核酸模板2 μL。37 ℃反应30 min。反应结束后用无菌水稀释20倍，插入试纸条，读取检测结果。比较2种方法提取的核酸进行RPA-LFD检测的效果。

1.6 RPA-LFD检测结果的读取

本研究中，下游引物标记有生物素，探针标记有荧光素(FAM)，试纸条结合垫有胶体金标记的鼠抗FAM抗体(金标鼠抗FAM抗体)，检测线(T)喷涂抗生物素抗体，质控线(C)喷涂羊抗鼠IgG抗体，因此，模板中含有目标基因时，RPA的扩增产物在试纸条层析可以结合金标鼠抗FAM抗体，并被检测线上的抗生物素抗体捕获，使检测线显色。当试纸条的检测线(T)和质控线(C)同时显色时，检测结果为阳性；当试纸条的质控线(C)显色而检测线(T)不显色时，检测结果为阴性；当试纸条的检测线(T)和质控线(C)都不显色时，检测结果无效。

2 结果 2.1 核酸释放剂配比优化

按照表 2配制核酸释放剂，处理相同的EHP阳性样品和EHP阴性样品制备待检测DNA模板，进行RPA-LFD反应，检测EHP，结果显示(图 1)，方案03、05、08、11、14、17、21、25和28处理后的EHP阳性样品作为检测模板的RPA-LFD反应，均可使试纸条的检测线(T)和质控线(C)同时显色，检测结果呈阳性，以其对应的EHP阴性样品作为检测模板的RPA-LFD反应，均只使试纸条的质控线(C)显色，其检测线(T)不显色，检测结果呈阴性；说明其检测特异性良好。以方案03、05、08和11处理后的EHP阳性样品作检测模板时，RPA-LFD检测的灵敏度相对较低。以方案28处理的EHP阳性样品作为模板，RPA-LFD检测的灵敏度最高，与用试剂盒提取纯化的EHP阳性样品作检测模板时，RPA-LFD检测的灵敏度相近，为最优方案，按此配比配制的核酸释放剂效果最好。其余配比方案不能有效检出条带，未再冗余罗列。

2.2 优化后核酸释放剂制备AHPND样品的检测结果

分别以方案28处理的AHPND阳性样品和阴性样品以及试剂盒法提取纯化的AHPND阳性样品和阴性样品作为检测模板，用1.4的RPA反应体系检测AHPND，反应结束后用无菌水稀释20倍，插入试纸条，读取检测结果，结果显示(图 2)，方案28处理后的AHPND阳性样品作为检测模板的RPA-LFD反应，可使试纸条的检测线(T)和质控线(C)同时显色，检测结果呈阳性，以其对应的EHP阴性样品作为检测模板的RPA-LFD反应，均只使试纸条的质控线(C)显色，其检测线(T)不显色，检测结果呈阴性；说明其检测特异性良好。且与用试剂盒提取纯化的AHPND阳性样品作检测模板时，RPA-LFD检测的灵敏度相近。

3 讨论

目前，已有多种核酸提取技术，例如高浓度的胍盐可以解离核蛋白体，同时使细胞内核酸酶失活，保护核酸不被降解，用于分离纯化核酸；Chirgwin等(1979)用异硫氰酸胍和β-巯基乙醇裂解细胞，用氯化铯梯度超速离心或乙醇抽提首次特异性分离出RNA，然而始终无法克服费时费力、危险性大、效率低等缺点；CTAB裂解法适用于产生大量多糖的生物体的核酸提纯，但其实验步骤多，操作较繁琐；酚抽提法提取的DNA可保持天然状态，纯度高，但操作繁琐、费时，且使用毒性有机溶剂苯酚对实验人员有一定的危害(张丽等, 2011)；磁珠法安全无毒，但成本较高。这些方法受实验室条件、检测人员操作水平等因素限制较大(黄维等, 2022)。

随着RPA/RAA技术的发展和其在病原检测中的广泛运用，适用于RPA技术的核酸释放剂也随之出现。目前，商品化的核酸释放剂较多，但其是否适用于对虾组织核酸样品提取以进行RPA-LFD检测有待考证。Tris-HCl可以保持细胞裂解缓冲液的pH值稳定，因此，本研究选用Tris-HCl作为裂解缓冲液的主要成分。选用KCl提供盐离子环境，使DNA充分溶解于液相，使蛋白质和DNA分离；LDS是一种阴离子去垢剂，也是一种表面活性剂，可破坏细胞的脂质双分子层膜结构；Triton X-100可发挥同LDS相同的作用，用于细胞裂解和蛋白质提取等(邹晓蕾等, 2013)，同时还可以提高核酸保存的稳定性，因此，本研究选用LDS作为裂解液的一种组分；利用EGTA作为螯合剂和抑制剂，结合带有2个正电荷的金属离子(例如Mg²⁺和Ca²⁺)，降低蛋白酶活性水平；以BSA维持缓冲液的渗透压和pH稳定；海藻糖的扩散系数低，分子运动和分子变性非常微弱，可以保持DNA分子的分散状态，同时，海藻糖对生物体和生物分子还有独特的非特异性保护作用(张玉华等, 2005)，因此，本研究以明胶和海藻糖作为反应增稠剂，以甜菜碱作为表面活性剂，促进RPA反应过程。因此，本研究对Tris-HCl、KCl、EGTA₂Na、LDS、Triton X-100、BSA、明胶、海藻糖和甜菜碱等常见细胞裂解液组分进行了优化，制备适用于对虾肝胰腺DNA核酸样品提取的核酸释放剂。常宇桐等(2022)基于反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法研制的微量核酸释放剂，使用异硫氰酸胍、非离子型表面活性剂Tween-20和Triton X-100来裂解细胞，释放细胞中的蛋白质和核酸，使蛋白质变性，促进脂质溶解，用异丙醇保护RNA链中的亲水基团，通过乙醇的洗涤作用溶解部分有机杂质和蛋白质。最终能检测出诺如病毒GⅡ型阳性样本，检测结果与商品化荧光定量试剂盒的结果一致。本研究同样选用Triton X-100来裂解细胞，并使蛋白质变性沉淀，同时用阴离子表面活性剂LDS和甜菜碱辅以裂解细胞，但Triton X-100浓度过高时容易造成污染，增加检测时假阳性的概率，本研究使用2% Triton X-100相较于使用1%和0.5% Triton X-100时检测结果为阳性和阴性的区分度更低，也能说明这一问题；此外，本研究利用Tris-HCl和BSA来维持裂解液的pH值和渗透压稳定，用KCl来提供盐离子环境，使DNA充分溶解于液相；以EGTA螯合带有2个正电荷的金属离子，降低蛋白酶的活性水平；本研究不使用异硫氰酸胍，避免胍盐残留影响后续酶活反应；同时以明胶和海藻糖作为反应增稠剂，保持DNA分子的分散状态；使核酸释放剂的功能更为完善。

综上所述，本项研究优化的核酸释放剂适用于对虾肝胰腺DNA样品制备。成功提取了对虾肝胰腺中的EHP和AHPND的DNA样品，可直接用于RPA-LFD对对虾肝胰腺中这2种病原的检测，有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤，极大地提高了核酸水平病原检测效率，与传统试剂盒纯化核酸的方法相比，检测灵敏度相近，具有广泛的应用价值。