凡纳对虾(Penaeus vannamei)具有生长速度快、环境适应能力强的特点，是我国养殖产量最高的对虾品种，产量占所有养殖对虾总量的90%以上(农业农村部渔业渔政管理局等, 2020)。近年来，在对虾养殖业快速发展的同时，许多制约养殖产业发展的病害、种质及饲料问题也逐渐显现(邓伟等, 2013; Watanabe, 2010; 农业农村部渔业渔政管理局等, 2020)。在对虾饲料方面，因国际鱼粉价格连续多年居高，导致养殖成本急剧增加。受饲料蛋白原料来源及成本的限制，对虾人工饲料中通常添加大量的植物蛋白，对虾食用后易导致生长受限、消化免疫功能受损(杨奇慧, 2010; 孟阳, 2019)。为了从增强营养、提高免疫及减少病原感染等途径系统地提高水产养殖动物的健康水平，应用发酵饲料的技术逐渐受到了研究者的关注(付豪等, 2023; 杨耐德等, 2008; 袁春营等, 2018)。但关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)用于发酵饲料的应用效果差异研究尚未见报道，产业中缺少相关技术的支撑。

益生菌可以抑制病原微生物的增殖，饲料中添加益生菌能够提高养殖动物免疫能力，维持肠道微生物菌群平衡，促进养殖动物生长(杜文勇等, 2023; 张盛静等, 2016; Balcazar et al, 2006)。研究表明，饲料中含有巨大芽孢杆菌(B. megeterium)、植物乳杆菌(L. plantarum)和酿酒酵母能够显著提高对虾存活率及非特异性免疫力，增强对虾抗病力(孙博超等, 2019; Vieira et al, 2010; Afsharnasab et al, 2016)。在我国允许用于水产养殖的益生菌主要为芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌及光合细菌中的部分菌类。

对虾养殖用的益生菌种类较多、效果各异，本研究选取对虾养殖中常用的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌3种益生菌进行单一及联合菌种的饲料发酵及应用，通过养殖实验比较不同发酵饲料投喂凡纳对虾的养殖效果，同时分析对虾体内外的弧菌含量，以期为益生菌发酵饲料在对虾养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用凡纳对虾来源于海南省某育苗场，虾体长为(3.14±0.33) cm，平均体重为(0.26±0.02) g。实验用枯草芽孢杆菌(编号20130720002)分离自健康对虾体内，酿酒酵母(编号20211027001)和嗜酸乳杆菌(编号20211027002)分离自市场销售的水产养殖用益生菌产品，3株菌均为实验室保存。

1.2 饲料制备

枯草芽孢杆菌及酿酒酵母分别接种于溶菌肉汤(lysogeny broth, LB)、酵母膏胨葡萄糖培养基(yeast peptone dextrose medium, YPD)中，并置于摇床中28 ℃、180 r/min震荡培养24 h；在MRS肉汤培养基(de Man, Rogosa and Sharp broth)中接种嗜酸乳杆菌，在无氧条件下37 ℃、180 r/min震荡培养24 h。平板涂布发酵液确定枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌的浓度分别为7.5×10⁸、7.8×10⁸和6.4×10⁸ CFU/mL。将3种菌分别离心后弃上清液，PBS稀释菌体，使3种菌的浓度均为1×10⁹ CFU/mL，同时，将浓度均为1×10⁹ CFU/mL的3种菌液等体积混合作为复合菌液。取商用对虾饲料(广东深圳市澳华集团股份有限公司生产，主要成分：粗蛋白质≥42.0%、粗纤维≤5.0%、粗灰分≤15.0%、粗脂肪≥5.0%、总磷≥1.0%、赖氨酸≥2.5%、水分≤12.0%) 4份，分别添加制备的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌及复合菌液，添加量为1% (W/W)，为保证菌液分散均匀且保持一定的湿度，菌液用25倍(W/W)的水稀释后，边喷洒边搅拌，于室温密封发酵24 h后4 ℃保存，每3天制备1次，对照组饲料不进行任何处理。

1.3 实验分组及养殖管理

实验分别设置枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、复合益生菌发酵饲料组及空白对照组，每个处理组分别设置4个重复，其中1个组用于补齐其他3组采样后的对虾数量。各平行组的对虾养殖于体积为60 L的水族箱中，有效水体40 L，每箱内随机放养30尾健康虾。各处理组每日投喂3次，日投喂量为对虾体重的3%，并记录每日饲料投喂量。日换水30%，养殖期间水温为(25.6±1.5) ℃，盐度为31.6±0.7，连续充气，养殖实验共进行28 d。

1.4 发酵饲料中目标菌的总菌数

取1 g各组益生菌发酵饲料，加入10倍体积PBS缓冲液，充分研磨后，以10倍浓度梯度稀释至合适倍数，分别涂布于酵母培养基YPD及嗜酸乳杆菌MRS平板中，取部分稀释液于80 ℃水浴15 min后涂布于LB平板中(用于枯草芽孢杆菌的计数)(Roy et al, 2013)，每组3个平行。YPD、LB平板于28 ℃培养箱中培养24 h后计数，MRS平板于37 ℃培养24 h后计数。

1.5 水质指标的测定

养殖第7、14、21、28天时，用无菌瓶采集每组中层水样100 mL，每组取3个平行，低温带回实验室，测定养殖水体中氨氮、亚硝氮浓度，测定方法参考海洋监测规范第4部分：海水分析中的靛酚蓝分光光度法和萘乙二胺分光光度法。

1.6 生长指标的测定

养殖结束时记录各处理组的对虾存活数、体长、体重，并记录实验过程中的投喂量，计算存活率、特定生长率及饵料系数。

存活率=存活对虾尾数/初始对虾尾数×100%；

存活提高率=(各实验组存活率–对照组存活率)/对照组存活率×100%；

体长增长率=(对虾末体长–对虾初体长)/对虾初体长×100%；

特定生长率=[ln(对虾末体重)–ln(对虾初体重)]/实验周期×100%；

饵料系数=饲料投喂量/(对虾末体重–对虾初体重)。

1.7 对虾肝胰腺中可培养细菌及弧菌定量

在养殖第7、14、21天，随机取各处理组的对虾3尾(取出后，从备用组中取规格一致的对虾补齐实验组)，无菌操作分离对虾肝胰腺并精确称重，加入10倍质量的PBS缓冲液研磨，以10倍梯度稀释至合适倍数，各梯度取0.1 mL涂布于2216E海水细菌培养基(zobell marine broth 2216)和硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium, TCBS)平板中，每组3个平行，28 ℃培养24 h，观察记录可培养细菌数及弧菌数。

1.8 养殖水体中可培养细菌及弧菌定量

在养殖第7、14、21天，取各处理组的水样，以10倍梯度稀释至合适倍数，涂布于2216E和TCBS平板中，每组3个平行，28 ℃培养24 h，观察记录可培养细菌数及弧菌数。

1.9 免疫相关酶活测定

实验至第28天时，在各处理组的每个平行组中随机挑选5尾对虾采集血清，测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)活性以及总蛋白(TP)浓度，相关试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定方法参考说明书。

1.10 数据处理及统计分析

实验数据用Excel和SPSS软件进行统计分析，数据取平均值±标准差(Mean±SD)，差异显著性检验使用SPSS分析软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，当P < 0.05时为差异显著。

2 结果 2.1 饲料发酵完成后目标菌的数量

各实验组饲料发酵完成后，目标菌的数量如表 1所示，枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌及复合益生菌发酵饲料中的各目标菌均达到10⁷ CFU/g数量级，酿酒酵母发酵饲料中酿酒酵母的含量为10⁶ CFU/g数量级。表明，枯草芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌的活菌数量经24 h发酵，提高3倍左右，而酿酒酵母组活菌数量较添加数量降低50%左右。复合益生菌发酵组中枯草芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌的活菌增殖数量与单菌发酵相似，提高2倍左右，而酿酒酵母增殖数量最高，达到添加剂量的6倍左右。

2.2 投喂不同益生菌发酵饲料后各组对虾存活率

投喂不同益生菌发酵后，各组对虾存活率如表 2所示，实验组中对虾存活率最高的组为复合益生菌组，存活率为100%；枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌组的存活率相同，均为(98.89±0.02)%；酿酒酵母组较低，仅为(95.56±0.05)%；与对照组存活率(91.11±0.02)%相比，实验组中除了酿酒酵母组与其他各组无差异外(P > 0.05)，其他各组的存活率均显著高于对照组(P < 0.05)，其中，复合益生菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌及酿酒酵母组的存活提高率分别达到9.76%、8.54%、8.54%和4.88%。

2.3 投喂不同发酵饲料的对虾体长体重及饵料系数

养殖实验结束后，测量对虾体长、体重，计算饵料系数，结果见表 3，对虾体长增长率最高的2组为嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌组，2组差异不显著(P > 0.05)，但均显著高于对照组(P < 0.05)，其他各组间差异不显著(P > 0.05)；各实验组对虾特定生长率高于对照组，但差异不显著(P > 0.05)，嗜酸乳杆菌组饵料系数显著低于对照组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P > 0.05)。研究表明，在提高对虾饲料利用率及促生长方面，嗜酸乳杆菌组最佳。

2.4 投喂不同发酵饲料后对虾肝胰腺可培养细菌总数及弧菌数量

在投喂发酵饲料的第7、14、21天，检测各组对虾肝胰腺组织中可培养细菌总数及弧菌数量，结果如表 4所示，在养殖第7天，枯草芽孢杆菌发酵饲料组中，对虾肝胰腺细菌总数显著高于其他各组(P < 0.05)，而弧菌数量最低组为枯草芽孢杆菌组与酿酒酵母组，这2组差异不显著，但均显著低于嗜酸乳杆菌组、复合益生菌组及空白组(P < 0.05)，对照组中弧菌数量分别是枯草芽孢杆菌和酿酒酵母发酵饲料组的20.0和27.3倍，枯草芽孢杆菌组弧菌占比最低仅为0.01%；养殖至第14天，各实验组对虾肝胰腺细菌总数及弧菌数量均显著低于对照组(P < 0.05)，复合益生菌组弧菌数量最低为(2.3±1.5)×10³ CFU/g；养殖至第21天，复合益生菌组对虾肝胰腺细菌总数显著高于对照组(P < 0.05)，但该组中肝胰腺中的弧菌占比最低，仅为0.06%，其余各组对虾肝胰腺细菌总数显著低于对照组(P < 0.05)，各实验组弧菌数量均显著低于对照组(P < 0.05)。

2.5 发酵饲料对养殖水体中可培养细菌及弧菌数量的影响

检测养殖期间各组养殖水体中的细菌及弧菌数量如表 5所示，在养殖第7天，枯草芽孢杆菌组水体细菌总数与对照组无显著差异，其余各组水体细菌总数显著低于对照组(P < 0.05)，枯草芽孢杆菌组和嗜酸乳杆菌组水体中弧菌数量与对照组差异不显著，但酿酒酵母及复合益生菌组水体中的弧菌数显著高于对照组(P < 0.05)，弧菌占比最低组为枯草芽孢杆菌组；养殖第14天，各组水体细菌总数显著低于对照组(P < 0.05)，除了复合益生菌组水体中的弧菌数显著高于其他各组外，其他各组间差异不显著(P > 0.05)，弧菌占比最低组为枯草芽孢杆菌及空白对照组；养殖至第21天，各实验组水体细菌总数显著高于对照组(P < 0.05)，枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌组水体弧菌数量显著低于对照组(P < 0.05)，而弧菌占比最高组为空白对照组。

2.6 发酵饲料对对虾血清中免疫相关指标的影响

投喂发酵饲料后，各实验组对虾血清中免疫相关酶活性的检测结果如图 1所示，血清LZM活性在各实验组中，仅有复合菌组显著高于对照组(P < 0.05)，其他各组间差异不显著(P > 0.05) (图 1A)；POD活性最高组为嗜酸乳杆菌组，显著高于其他各组(P < 0.05)，次高组为酿酒酵母组，显著高于对照组、枯草芽孢杆菌组和复合益生菌组(P < 0.05)，复合益生菌组与枯草芽孢杆菌组差异不显著(P > 0.05)，但高于空白对照组(P < 0.05) (图 1B)。SOD活性最高组为嗜酸乳杆菌组，显著高于其他各组(P < 0.05)，最低组为复合益生菌组，显著低于其他各组(P < 0.05)，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及空白组差别不显著(P > 0.05) (图 1C)；PO活性最高组为嗜酸乳杆菌，次高组为复合益生菌组，2组差异显著，但均显著高于酿酒酵母组(P < 0.05)，枯草芽孢杆菌组与对照组差异不显著(P > 0.05)，但均显著低于其他各组(P < 0.05) (图 1D)；血清总蛋白含量各实验组均高于对照组，但嗜酸乳杆菌组显著高于其他实验组(P < 0.05) (图 1E)。可以看出，在所有的实验组中，嗜酸乳杆菌增强对虾非特异性免疫力的效果最为突出。

2.7 益生菌发酵饲料对养殖水体中NH₄⁺-N和NO₂^–-N的影响

养殖期间各组养殖水体中NH₄⁺-N浓度如图 2A所示，在养殖的第7和14天，各实验组养殖水体中的NH₄⁺-N浓度均高于对照组(P < 0.05)，第7和14天的最高浓度组分别为复合益生菌组和酿酒酵母组；养殖第21和28天，各实验组养殖水体NH₄⁺-N浓度均显著低于对照组(P < 0.05)，最低组为酿酒酵母组；养殖期间各组养殖水体中NO₂^–-N浓度如图 2B所示，养殖至第7和14天时，各组养殖水体NO₂^–-N浓度均较低，在第7天时，各实验组均低于对照组，而到第14天时，最高组为酿酒酵母组，显著高于对照组、枯草芽孢杆菌组和嗜酸乳杆菌组(P < 0.05)；养殖至第21和28天时，各组的NO₂^–-N浓度普遍上升，2个时间点的最低浓度组均为嗜酸乳杆菌组，显著低于其他各组(P < 0.05)，最高浓度组分别为酿酒酵母组和空白对照组，均显著高于其他各组(P < 0.05)。至28 d时，各实验组NO₂^–-N浓度均低于对照组(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 益生菌发酵饲料对饲料营养效果的改善作用

益生菌种类较多，水产养殖中应用广泛的有光合细菌、乳酸菌及芽孢杆菌类等，使用方式多为水体泼洒及口服。近年来，由于对虾易暴发消化道疾病，如急性肝胰腺坏死病和虾肝肠胞虫病等，导致对虾消化系统的组织结构受损。为改善对虾消化系统功能、减少饲料中植物性蛋白抗营养因子对机体产生危害，采用发酵饲料进行对虾养殖的技术逐渐被认可。研究表明，用乳酸菌发酵饲料能够将饲料蛋白分解为小分子的活性肽和氨基酸，提高饲料的营养水平和利用率(Missotten et al, 2016)。将对虾饲料用植物乳杆菌、酿酒酵母和沙福芽孢杆菌(B. safensis) 3个菌株按照1∶3∶3混合发酵，能够显著提高饲料中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸等12种氨基酸的含量，投喂对虾后表现出显著的促生长效果(Zhang et al, 2021)。用酿酒酵母发酵豆粕替代50%鱼粉制备虾饲料投喂印度对虾(Penaeus indicus)可获得与非替代组相似的对虾产量及生长速度(Sharawy et al, 2016)。本研究发现，投喂枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、复合益生菌发酵饲料的3个组对虾的存活率显著提高，而乳酸杆菌发酵饲料组的饵料系数最低，表明不同益生菌发酵饲料的应用效果不同。综合分析各组饲料的营养效果，嗜酸乳杆菌促生长及降低饵料系数的效果最佳。

3.2 益生菌发酵饲料对对虾肝胰腺弧菌抑制效果

对虾的肝胰腺与消化道相通，环境中病原菌易通过摄食进入肝胰腺的管腔中，控制肝胰腺中病原菌的数量能降低对虾的发病率。本研究发现，酿酒酵母发酵饲料在应用前期即可显著降低对虾肝胰腺中弧菌的数量，效果与枯草芽孢杆菌相近，均优于嗜酸乳杆菌，而在养殖后期，枯草芽孢杆菌组对降低肝胰腺弧菌载量的效果减弱，嗜酸乳杆菌组降低肝胰腺弧菌载量的效果增强。枯草芽孢杆菌可分泌细菌素、酶类、抗菌肽和脂肽类等化合物(卢昱茜等, 2022; Chakraborty et al, 2018)，对病原菌具有抑制效果。同时，摄食枯草芽孢杆菌发酵的饲料能提高对虾脂多糖和β-1, 3-葡聚糖结合蛋白及血蓝蛋白等的表达水平，有助于提高对虾对弧菌的抵抗力(Vogeley et al, 2019)。酵母菌发酵饲料的应用在家畜及鱼类养殖中有较多报道，饲料经过发酵后，能够提高其利用率，促进养殖动物的生长(Maamouri et al, 2022; 崔正贺等, 2022)。水产中，应用酿酒酵母联合植物乳杆菌和沙福芽孢杆菌发酵对虾饲料，能够改善对虾肠道微生态环境，进而改善对虾健康状况(Zhang et al, 2021)，但应用于养殖对虾抗弧菌效果的研究报道较少，对虾摄食后其降低对虾肝胰腺弧菌载量的作用机制尚不清楚。在发酵底物的过程中，乳酸菌能够产生抗菌肽、大量乳酸和其他多种酸性化合物，在杀菌、调节肠道菌群方面具有显著效果(Karthik et al, 2014; 刘迪等, 2016)。

3.3 益生菌发酵饲料对对虾血清免疫相关酶活的影响

血清中LZM、过氧化氢酶(CAT)、SOD和PO等非特异性免疫相关酶活性是衡量对虾免疫水平的重要指标(Mai et al, 2010; Wang et al, 2018)。Lee等(2021)研究发现，在饲料中添加枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌(B. pumilus)可提高对虾PO和SOD活性。李军亮等(2018)研究表明，饲料中适量添加嗜酸乳杆菌，能够提高凡纳对虾CAT、LZM和SOD活性，增强其非特异免疫力。在饲料中添加1%的酵母水解物或酿酒酵母，能够提高凡纳对虾的免疫力(Jin et al, 2018)。酵母菌细胞壁含有对虾非特异免疫增强剂葡聚糖，饲料中添加0.1% (W/W)分子量为15 kDa的低聚β-葡聚糖，能够显著提高斑节对虾(P. monodon)血细胞的吞噬活性，增强POD和PO活性(Luan et al, 2021)。本研究发现，将枯草芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌添加到对虾饲料中进行单一菌株发酵后，菌体的浓度得到明显的提高，而经过复合菌发酵后，3种菌的浓度均得到提高。且不同益生菌发酵饲料后，对提高对虾免疫相关酶活性的效果不同。研究表明，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌促进免疫力的途径不同。枯草芽孢杆菌可促进对虾饲料中谷氨酰胺的消化率，而谷氨酰胺可作为免疫细胞的燃料或通过己糖胺生物合成途径(HBP)调节免疫分子表达和O-糖基化，从而改善对虾的健康状况(Chine et al, 2020)。酿酒酵母细胞壁中的β-葡聚糖能够通过下调细胞因子的表达来减轻炎症反应，也可与白细胞上的几种受体结合并激活先天免疫机制，从而增强免疫反应(侯冬强等, 2022)。乳杆菌是良好的免疫激活剂和非特异性免疫调节因子，能够增加抗病相关基因的表达量，从而提高机体非特异性免疫力(张家国等, 2014)。

3.4 发酵饲料对养殖水体的脱氮作用

残饵和粪便会导致养殖水体中氨氮和亚硝氮等有害物质的累积，影响动物的生长、代谢及免疫等功能，降低养殖动物的存活率和生长(Zhao et al, 2020; 肖威等, 2020)。益生菌能够调节水质，降低养殖水体中的氨氮等有害物质的浓度(Zhou et al, 2009)。Mirbakhsh等(2021)将不同浓度的枯草芽孢杆菌喷洒在凡纳对虾基础饲料中，发现对养殖后期水体中的氨氮、亚硝氮具有去除效果，枯草芽孢杆菌的脱氮机制源于其含有moaA、moaD、moaE、mobB和moeA等多个脱氮基因参与氮的去除(Yang et al, 2021)，同时，该菌可分泌多种降解有机物的酶类，促进养殖系统中有机质的分解，利于降低水体系统中的快速氨氮移除(Wang et al, 2022)。目前，尚未见对乳酸及酿酒酵母脱氮机制的报道，但有研究表明，将乳酸菌及酿酒酵母随着饲料释放到养殖水体，也可对环境中的氨氮和亚硝氮具有一定的降解作用(李咏梅等, 2021; 崔正贺等, 2022)。本研究也发现，在养殖后期投喂各种益生菌发酵饲料均可使水体氨氮(21 d后)和亚硝氮浓度(28 d)降低，推测可能与饲料经过益生菌发酵后，其中的大分子植物蛋白会随着发酵被降解为易于吸收的小分子物质，提高了饲料蛋白的吸收利用率，间接减少了对虾粪便中含氮物质的排放，进而达到降低养殖水体氨氮和亚硝氮的效果(Madani et al, 2018)。另外，菌体自身也可能存在一定的脱氮机能，在养殖持续一段过程后，益生菌定植在养殖系统中发挥脱氮作用。

4 结论

在各实验组中，嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌和复合菌发酵饲料均能显著提高养殖对虾存活率，而嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌对提高对虾体长增长率也具有显著效果，且嗜酸乳杆菌组的饵料系数最低。实验中后期(14 d和21 d)，各实验组发酵饲料对降低对虾肝胰腺弧菌数量均有显著效果，但在提高对虾血清POD、SOD和PO活性及总蛋白含量方面，嗜酸乳杆菌组效果最佳。综合分析，采用嗜酸乳杆菌发酵饲料投喂对虾效果最佳。