2. 农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071;
3. 海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071
2. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China;
3. State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins，PSTs)是一类具有神经毒性的生物毒素，海洋中主要由亚历山大藻属(Alexandrium)多个物种、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)、巴哈马梨甲藻(Pyrodinium bahamense)产生(Rodríguez-Cabo et al, 2021)，在全球广泛分布并引发大量中毒事件(Bazzoni et al, 2020; Stüken et al, 2015)。PSTs主要通过食物链传递蓄积到双壳贝类等海洋生物中并发生代谢转化(Reis Costa, 2016)，从而对消费者产生健康风险。在全球范围内年均造成2 000余人中毒，死亡率高达15% (Wang et al, 2016)。因此，中国、美国、欧盟等国家或地区均对双壳贝类中PSTs设定了安全限量值(400 MU/100 g或800 μg STXeq/kg)(Visciano et al, 2016; Yoo et al, 2020; 梁玉波等, 2019)并定期监控(郑旭颖等, 2023)。近年来，以贻贝为代表的海洋贝类中屡次检出高含量的PSTs，如2016年秦皇岛和2017年福建近海海域的贻贝中PSTs含量分别达到限量值的50.7倍和42.7倍(梁玉波等, 2019)。由此可见，贻贝已成为我国PSTs风险最为严峻的海洋贝类，亟需强化贻贝中PSTs蓄积转化研究，以期为我国贻贝产品中PSTs风险防控提出基础科学数据。
双壳贝类对PSTs的蓄积能力与其摄食行为高度相关，受摄食率、选择性摄食以及机体吸收产毒藻效率等因素影响(Fernández-Reiriz et al, 2008; Li et al, 2001)。Li等(2001)对比了中国南海2种双壳贝类对毒素的蓄积与摄食能力差异，发现产毒藻塔玛亚历山大藻(A. tamarense)与非产毒藻伪矮海链藻(Thalassiosira pseudonana)暴露下华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)的PSTs含量远高于菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)，同时，华贵栉孔扇贝对产毒藻的滤食率与吸收同化能力也强于菲律宾蛤仔。此外，PSTs蓄积能力还与双壳贝类的神经敏感性有关，由于贻贝的神经元轴突对PSTs不敏感，导致贻贝对PSTs的蓄积能力高于其他贝类(颜天等, 2001)。此外，不同贻贝对PSTs的蓄积能力具有品种差异性(Cadaillon et al, 2022; Goya et al, 2020)。Young等(2006)比较了3种贻贝的蓄积差异，发现厚壳贻贝(Mytilus unguiculatus)毒素蓄积量分别为翡翠贻贝(Perna viridis)及紫贻贝(M. galloprovincialis)的1/2和1/3，这一结果同样在自然赤潮暴发期间得到证实。
厚壳贻贝是我国三大经济贻贝之一，主产地位于浙江舟山嵊泗地区，根据历史数据可见该地区为赤潮高发区(于仁成等, 2020)。其分布的PSTs产毒藻主要包括太平洋亚历山大藻(A. pacificum)、微小亚历山大藻(A. minutum)、链状亚历山大藻(A. catenella)(Gu et al, 2022)。以亚历山大藻属为主的PSTs产毒藻分布十分广泛(Paredes-Mella et al, 2021)，5—7月是该地区PSTs风险较为严重的季节且多次检出PSTs残留的情况(彭志兰等, 2017)。嵊泗厚壳贻贝不仅是我国重要的地理标志产品(陈瑜等, 2020)，并且为首批入选《中欧地理标志协定》的贝类产品，具有重要的经济价值和社会影响。然而，目前针对厚壳贻贝中毒素蓄积代谢特征的研究严重不足，限制了这一重要经济品种安全防控技术的建立。本研究通过将厚壳贻贝暴露于不同密度链状亚历山大藻，揭示产毒藻暴露下厚壳贻贝对PSTs的蓄积代谢能力及滤食率的变化，为评估厚壳贻贝中PSTs风险形成机理并构建风险防控技术提供数据支撑。
1 材料与方法 1.1 实验材料链状亚历山大藻(GY-H25株)，购自上海光语生物科技有限公司。厚壳贻贝购自于浙江省舟山市嵊泗县，使用游标卡尺选择壳长(7.5±1.0) cm，壳宽(3.0±1.0) cm，且活性良好个体，在实验条件下净化2 d后用于暴露实验。饵料藻为小球藻(Chlorella vulgaris)。石房蛤毒素(STX)，新石房蛤毒素(NEO)，膝沟藻毒素(GTX1、GTX2、GTX3和GTX4)，N-磺酰氨甲酰基类毒素(GTX5、C1和C2)，脱甲酰基类毒素(dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3)标准品购自加拿大国家海洋研究中心。
1.2 实验方法 1.2.1 链状亚历山大藻培养链状亚历山大藻接种于f/2培养基，初始接种密度为6.5×105 cells/L，培养条件：温度25 ℃，光照为54 μmol/(m2·s)，光暗时间比为12 h∶12 h。每3天取样10 mL藻液加入150 μL鲁格试液(Lugol's)固定，充分摇匀，光学显微镜下进行观察和计数，取3次的平均值评估产毒藻的生长阶段。取20 mL生长平台期藻液5 000 r/min的条件下离心15 min，取下层藻细胞用于PSTs分析。
1.2.2 暴露实验随机挑选760只厚壳贻贝，根据产毒藻的投喂量分为高密度组、低密度组和对照组，每个处理组设置3个平行，每个平行84只贻贝。实验共持续30 d，其中，1~7 d为蓄积阶段，8~30 d为代谢阶段。蓄积阶段每天早晚2次对实验组贻贝投喂产毒藻，早晚投喂量为1∶2。高密度组投喂量为7.0× 105 cells/d/只，低密度组投喂量为2.8×105 cells/天/只。蓄积阶段结束后，实验组及对照组每组每天投喂2 g小球藻。每组分别于0.5、1、2、4、6、7、8、10、12、14、18、22、26和30 d各取6只贻贝清洗后切断闭壳肌，其中，2只分离出软组织，其余4只分离出肝胰腺及可食组织(软组织中除肝胰腺部分)，每个组织分3个平行样品，筛网滤去表面水分后进行PSTs分析。
1.2.3 PSTs检测产毒藻样品加入5 mL 1%乙酸水溶液，冰浴超声破碎5 min，单次破碎时间为8 s并停2 s，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液过0.22 μm Clarinert针式过滤器(MCM亲水)于进样小瓶待测。
贝类样品前处理参考Wu等(2022)与李瑾祯等(2023)：5 g样品加入5 mL 1%的乙酸水提取毒素，沸水浴中煮沸5 min，4 500 r/min离心10 min。取1 mL提取液，加入5 μL氨水过ENVI-Carb固相萃取柱净化，1 mL 75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸)洗脱，过0.22 μm Clarinert针式过滤器(Nylon通用)后存于进样小瓶待上机检测。
液相色谱和质谱的条件参考张海涛等(2023)的方法，Sciex 5500 QTRAP液相色谱–串联质谱，采用喷雾电离子源(ESI)多反应监测(MRM)正负离子切换模式。色谱柱TSK-Amide-80 (3 μm, 2 mm×15 cm)，柱温40 ℃，流动相A为水(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)，流动相B使用95%乙腈水溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)。梯度洗脱条件为0~3.0 min，80% B；3.1~5.0 min，80%~40% B；5.1~10.0 min，40% B；10.1~11.0 min，40%~80% B；11.1~13.0 min，80% B；流速为0.4 mL/min。离子源温度为550 ℃，喷雾电压为5 000 V–4 500 V，气帘气压力为20 psi，雾化气压力为30 psi，辅助加热器压力为30 psi，碰撞气Medium。
1.2.4 计算公式(1) 滤食率的计算方法为，在投喂产毒藻时与投喂产毒藻1 h后取5 mL水样加入鲁格试液用于固定藻细胞，显微镜下对水样中藻细胞计数。
| $ {I_R} = [1 - ({C_0} - {C_{1{\text{h}}}}/{C_0})] \times 100 $ | (1) |
式中，IR表示1 h厚壳贻贝的滤食率，C0与C1h分别为投喂产毒藻时与投喂产毒藻1 h后5 mL水样中的藻细胞个数。
(2) 日平均蓄积速率参考Liu等(2020)的计算方法：
| $ \text { 日平均蓄积速率 }=\left(T_n-T_m\right) /(m-n) $ | (2) |
式中，Tn和Tm是蓄积阶段厚壳贻贝特定组织在第n天和第m天PSTs含量，单位为μg STXeq/kg。
日平均代谢率计算公式为：
| $ \text { 日平均代积率 }=\left(T_n-T_m\right) /(m-n) / T_n $ | (3) |
式中，Tn和Tm是代谢阶段厚壳贻贝特定组织在第n天和第m天PSTs含量，单位为μg STXeq/kg。
1.2.5 数据处理实验数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，利用SPSS 25和Excel 2018等软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P < 0.05为差异显著水平，结果利用origin 2021软件作图。
2 结果 2.1 链状亚历山大藻的生长与产毒特征如图 1所示，A. catenella接种后细胞密度持续升高并于24 d达到平台期，藻密度为1.5×107~1.6× 107 cells/L，42 d进入衰退期细胞密度持续降低。平台期产毒藻所产PSTs组分及含量为C2：3.9~4.7 pg/cell，C1：0.8~3.1 pg/cell，GTX5：0.5~0.6 pg/cell，NEO：0.3~0.4 pg/cell，GTX4：0.1 pg/cell和GTX3：0.1 pg/cell (表 1)，其中，C2、C1和GTX5三种组分占比最高，平均单细胞产毒量为2.0 pg STXeq/cell。因此，选用培养24~30 d的藻细胞进行暴露实验。
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图 1 链状亚历山大藻生长曲线以及单细胞产毒量 Fig.1 Growth curve and single cell toxicity of A. catenella |
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表 1 链状亚历山大藻生长平台期产毒情况 Tab.1 Toxicity production of A. catenella at stationary phase |
如图 2a所示，厚壳贻贝滤食率随暴露时间呈下降趋势。暴露7 d时，滤食率分别降低为初始值的26.7% (高密度组)和37.1% (低密度组)，高密度组显著低于低密度组(P < 0.05)。蓄积阶段不同组织中PSTs含量均表现为上升趋势，而蓄积含量具有显著差异。肝胰腺为毒素蓄积靶器官，PSTs含量最高为7 458.2 μg STXeq/kg (高密度组)和2 555.9 μg STXeq/kg (低密度组)(图 2b)。贻贝肝胰腺和软组织日平均蓄积速率，高密度组分别为981.6 μg STXeq/kg/d和106.5 μg STXeq/kg/d，低密度组分别为365.1 μg STXeq/kg/d和40.8 μg STXeq/kg/d。整个实验阶段，仅高密度组6 d软组织中PSTs含量超过安全限量值(图 2c)。高低密度组厚壳贻贝可食组织中PSTs含量均小于108.6 μg STXeq/kg (图 2d)。由表 2可知，PSTs含量与滤食率呈显著负相关。肝胰腺中PSTs含量与滤食率相关性最强，而可食组织的相关性最弱。
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图 2 不同暴露密度下厚壳贻贝滤食率(a)及各组织(b：肝胰腺；c：软组织；d：可食组织)中PSTs含量变化 Fig.2 Changes of filtration rate (a) and PSTs content in different tissues (b: Hepatopancreas; c: Soft tissue; d: Edible tissue) of M. unguiculatus at different exposure densities *表示组间有显著性差异(P < 0.05)。 * denotes significant difference between groups (P < 0.05). |
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表 2 不同暴露密度下厚壳贻贝各组织PSTs含量与其滤食率的相关性分析 Tab.2 Correlation analysis between PSTs content and filtration rate of M. unguiculatus at different exposure densities |
代谢阶段各组织PSTs代谢速率由高到低依次为肝胰腺、软组织、可食组织。其中，实验7~9 d为快速代谢期，高密度组肝胰腺日代谢速率为1 860.3 μg STXeq/kg/d。高密度组贻贝各组织日平均代谢率分为18.4% (肝胰腺)、18.1% (软组织)和13.1% (可食组织)。暴露30 d时，各组织PSTs含量仅为最高值的50.0%以下，低于安全限量值。高密度组肝胰腺PSTs含量维持在1 400.0 μg STXeq/kg左右，低密度组则维持在600.0 μg STXeq/kg左右。
2.3 厚壳贻贝中PSTs组成及转化为评估厚壳贻贝对PSTs的代谢转化能力，本研究比较了产毒藻与肝胰腺中毒素组分及转化情况。在厚壳贻贝肝胰腺中，除dcNEO外12种混和标准品PSTs组分均有检出。不同暴露密度下厚壳贻贝肝胰腺中优势PSTs组分与含量由高到低排序均为C1、C2、GTX5 (图 3)。主要的毒素转化发生在从产毒藻到内脏的转移过程，转化类型为差向异构化C2→C1。
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图 3 主要毒素组分在产毒藻和厚壳贻贝肝胰腺中百分含量(a)及暴露期间占比变化(b：高密度组、c：低密度组) Fig.3 Content of the main toxin components in the hepatopancreas of A. catenella and M. unguiculatus (a) and changes in proportion during exposure (b: high-density group, c: low-density group) 柱形图上方字母不同表示差异显著(P < 0.05)。 Different letters on the column indicate significant differences (P < 0.05). |
由图 3a可知，在贻贝摄食产毒藻后C2百分含量显著降低(P < 0.05)，由74.1% (藻细胞)分别降低至22.6% (高密度组)与17.1% (低密度组)；C1则由10.6% (藻细胞)上升54.1% (高密度组)和54.0% (低密度组)。不同密度组贻贝与产毒藻中GTX5百分含量无显著差异。整个暴露实验中，C1组分占比维持在47.1%~ 62.0%，C2组分含量占比维持在13.1%~33.7%，GTX5组分占比维持在8.9%~20.8% (图 3b、c)。
3 讨论 3.1 厚壳贻贝PSTs蓄积对滤食率的影响贝类在长期的进化过程中产生了独特的逆境适应机制，因此，在有害赤潮暴发期间维持较高的存活率(Lassudrie et al, 2014; Li et al, 2017; Turner et al, 2019)。有限的研究表明，自然赤潮条件下厚壳贻贝对PSTs蓄积能力弱于其他贻贝(Kim et al, 2006)。之前有诸多学者开展了紫贻贝在室内暴露条件下的PSTs蓄积代谢规律研究。邱江兵(2014)研究紫贻贝肝胰腺日平均蓄积速率可达到1 736.0 µg STXeq/kg/d，最高PSTs含量为868.0 µg STXeq/100g，为本研究PSTs最高含量的1.2倍。Sekiguchi等(2001)将紫贻贝暴露于塔玛亚历山大藻中，其肝胰腺日平均蓄积速率为1 370.0 µg STXeq/kg/d。本研究暴露组厚壳贻贝肝胰腺PSTs日平均蓄积速率均低于上述研究。此外，其他组织蓄积能力也相对较低，如厚壳贻贝软组织日平均蓄积速率显著低于翡翠贻贝(917.5 µg STXeq/kg/d)，厚壳贻贝最高PSTs含量也仅为翡翠贻贝的22.0% (Andres et al, 2019)。张海涛等(2023)采用相同暴露条件下，紫贻贝肝胰腺PSTs含量与本研究相当，但可食组织中PSTs含量约为本研究中厚壳贻贝的2倍。本研究中，仅高密度暴露条件下厚壳贻贝第6天PSTs含量超过安全限量值。与之相比，Andres等(2019)的研究中产毒藻暴露下翡翠贻贝仅16 h软组织PSTs含量就高于安全限量值。综上可见，厚壳贻贝对PSTs蓄积能力相对较弱。
双壳贝类对有害藻华的反应涉及复杂的生理和行为机制(Freitas et al, 2020; Lavaud et al, 2021)，短期影响主要包括摄食降低(Pousse et al, 2018)，闭壳肌关闭等摄食行为的影响(Comeau et al, 2019)。如Bianchi等(2019)的研究中利用链状亚历山大藻与塔玛亚历山大藻暴露紫贻贝，7 d发现其滤食率降低20.0%~ 30.0%。Fernandez-Reiriz等(2008)的研究中，暴露于链状亚历山大藻的智利贻贝(M. chilensis) 1 d后，其对产毒藻的滤食率与吸收消化降低约67.0%。本研究厚壳贻贝从蓄积阶段第3天开始滤食率持续下降，导致PSTs蓄积的降低，胡杨杨等(2019)研究发现，暴露于腹泻性贝类毒素的过程中厚壳贻贝也发现类似现象。这种摄食行为的变化为PSTs在双壳贝类体内蓄积的结果(Andres et al, 2019; Stüken et al, 2015)。狮爪扇贝(Nodipecten subnodosus)暴露于产GTX类毒素的链状裸甲藻，发现其出现滤食率降低后，依次出现壳瓣部分关闭、假粪增加、消化腺出现严重的氧化损伤等生理反应(Estrada et al, 2007)。综上所述，PSTs暴露下的双壳贝类会产生摄食生理应激来减少其对产毒藻的摄食。
滤食率与产毒藻密度呈显著负相关(P < 0.05)，这与相同暴露条件下紫贻贝滤食率随着毒素的蓄积呈正相关结论相反(张海涛等, 2023)。Tobke等(2021)研究发现，智利贻贝对产毒藻中的有机物利用率远远低于非产毒藻。Lavaud等(2021)研究发现，产毒藻暴露导致蓝贻贝(M. edulis)瓣膜开启幅度的降低，可显著减轻产毒藻对双壳贝类的生理影响。但其暴露实验中蓝贻贝的日平均蓄积速率为516.0 µg STXeq/kg/d，高于本研究暴露组厚壳贻贝软组织中PSTs日平均蓄积速率，说明厚壳贻贝比蓝贻贝对PSTs的敏感性更高。此外，Lavaud等(2021)研究表明，产毒藻的毒性大小、密度以及投喂方式都能够影响贻贝蓄积能力。因此，产毒藻差异会对厚壳贻贝中毒素蓄积产生影响，需要开展系统研究。
3.2 产毒藻暴露下厚壳贻贝中PSTs的代谢转化双壳贝类肝胰腺为PSTs蓄积靶器官，通常该组织富集毒素后向其他组织转移完成代谢转化(Meng et al, 2023)。如扇贝的肝胰腺被证实具有PSTs解毒的功能(Wang et al, 2017)，毒素转移至代谢器官被转化降解，该过程可减轻组织损伤并促进机体恢复，对提升贝类的PSTs耐受能力具有重要影响。本研究厚壳贻贝中PSTs分布组织差异性显著，这与其他双壳贝类组织差异一致(Bianchi et al, 2019; 邴晓菲等, 2017)。高密度组厚壳贻贝各组织仅2 d代谢了约50.0%的PSTs，清除速率为25.0%/d，为其他双壳贝类的4.2~4.6倍(邴晓菲等, 2017; 沈和定等, 2011)。厚壳贻贝低密度组各组织PSTs含量在代谢7 d后均低于欧盟安全限量标准，而暴露于相同时间和相同产毒藻密度的紫贻贝中PSTs含量远高于厚壳贻贝，高密度组紫贻贝肝胰腺维持在2 000.0 μg STXeq/kg，低密度组紫贻贝肝胰腺维持在1 000.0 μg STXeq/kg。这说明厚壳贻贝在具有低蓄积能力的同时，还具有快速代谢与低PSTs残留率等特点。
双壳类动物组织中最常见的生物转化为差向异构化，主要由藻类产生的β-差向异构体(C2、GTX3和GTX4)在双壳类动物摄取后通常转化为热力学更稳定的α-差向异构体(C1、GTX2和GTX1)(Sekiguchi et al, 2001)。暴露实验发现，产毒藻到内脏的转移过程中的毒素转化表现为C2→C1差向异构体转化。除此之外，在贻贝体内还检测出产毒藻中未检出的几种毒素组分(STX、dcSTX、GTX1、GTX2、dcGTX2和dcGTX3)，这是产毒藻中毒素组分转化的结果。例如，林卓如等(2022)将毛蚶(Scapharca subcrenata)暴露于太平洋亚历山大藻，发现毛蚶中出现了产毒藻中未检出的GTX2和GTX3两种组分，并推测是由GTX1与GTX4转化而来。本研究暴露实验中3种组分占比均无明显改变，这说明3种组分在贻贝中达到平衡比例后停止转化。而Tang等(2021)研究发现，厚壳贻贝在PSTs代谢阶段可以将高毒性的GTX1/4转化为低毒性的C1/2。邱江兵(2014)报道紫贻贝体内出现了明显的α、β差向异构毒素的转化，并将塔玛亚历山大藻中的GTX6全部转化为GTX5。Kim等(2015)比较产毒藻和贻贝PSTs组分，发生的主要转化类型为C2、GTX4转化为C1和GTX1。而Wu等(2022)研究表明，在自然条件下紫贻贝中毒素主要以原型组分直接代谢排出。本研究中，厚壳贻贝中3种毒素组分占比由高到低依次为C1、C2、GTX5，且未发生转化现象。综上可见，不同贻贝对PSTs的转化能力存在差异。
4 结论本研究探究了不同密度链状亚历山大藻暴露对厚壳贻贝PSTs蓄积、滤食率及代谢转化的影响。研究表明，厚壳贻贝对链状亚历山大藻的滤食率与产毒藻密度、PSTs含量呈显著负相关，这是其对PSTs蓄积产生的应激反应。厚壳贻贝对PSTs的快速代谢与低转化、低残留等特点也表明其食用风险低于其他贻贝。研究结果为进一步探讨厚壳贻贝中PSTs风险形成规律、科学构建防控技术提供了研究基础。
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