纳米银(Ag NPs)具有独特的抗菌性能，是世界上最常用的纳米材料之一，广泛应用于医疗设备、化妆品、纺织品、电子、玩具和家用电器等领域(Desireddy et al, 2013; Loo et al, 2018; Bruna et al, 2021)。Ag NPs的广泛应用使它们不可避免地会通过废水、大气沉降和其他途径进入河流、湖泊、河口和沿海水域(Zhao et al, 2021; Kang et al, 2023)，引发了人们对其生态安全性的担忧(Mühling et al, 2009; Yi et al, 2017; Li et al, 2020)。对于河口环境中纳米材料的风险评估而言，微生物(尤其是细菌)是理想的指示物(Hegde et al, 2016; Zhang et al, 2021)。因此，准确测定纳米材料对细菌的抑制效应是进行环境风险评估活动的必要前提之一(Zhang et al, 2021)。

Kirby-Bauer纸片扩散法、显微镜法、平板计数法、生物量测定法、微量肉汤稀释法(BMD)、电化学传感器、表面增强拉曼光谱法和浊度法(OD)等基于微生物生长分析的表型方法已经被广泛应用于测定纳米材料对细菌的抑制效应(Westmeier et al, 2018)。基于遗传物质分析的基因型方法(如PCR、qPCR、RT-PCR和高通量测序)由于可以节约细菌培养所需时间，近年来也发展迅速(Doiron et al, 2012; Metch et al, 2018; Xu et al, 2019)。这些表型和基因型方法在测定实验室单纯介质(如培养基)中纳米材料对微生物的影响时具有很好的性能(Westmeier et al, 2018; Du et al, 2019; Huq, 2020)。然而，当它们被用于测定纳米材料在真实的复杂介质(如河口水样)中对微生物的影响时，必需经过繁琐的分离、纯化等前处理步骤(Niu et al, 2021)，不仅效率低，而且主客观误差也在所难免(Westmeier et al, 2018; Zhang et al, 2023b)。目前，准确、高效地测定实际复杂样品介质中纳米材料抑菌效应的分析方法依然是业界的急迫需求。

近年来，我们团队研制出了一种基于电容耦合非接触电导(C⁴)原理的多通道传感器，为在线监测微生物生长过程提供了可能(Zhang et al, 2018、2020、2021)。C⁴检测是一种独特的电导率分析方法，工作时电极不与被测试介质直接接触(Chantipmanee et al, 2020; Hauser et al, 2020; Zhang et al, 2020; Tuma, 2022)，输出的信号值正比于介质导电离子浓度及介质中载流子的迁移率。它不仅具有经典接触式电化学分析技术的优点——如仪器简单、成本低廉、响应速度快、不受浊度影响、易于小型化等，而且不存在电极的极化、钝化和污染风险(Zhang et al, 2023a)。我们基于该多通道传感器，研制出了32通道电子微生物生长分析仪(EMGA)。但是，尚未曾采用EMGA建立测定河口水中纳米材料抑菌效应的方法。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)广泛存在于河口及近岸环境中(李昊等, 2023)，是一种条件性致病的革兰氏阴性嗜盐菌(Baker-Austin et al, 2010; 黄梦诗等, 2019)。另一方面，它们还具有优异的异养硝化–好氧反硝化能力，能够降解碳氢化合物、木质素等一些难降解的化合物(Grimes, 2020)。因此，探索Ag NPs对河口水中副溶血弧菌的影响具有重要的科学意义。本研究以副溶血弧菌为模式微生物，通过采用EMGA测定Ag NPs胁迫下细菌生长动力学曲线，建立一种分析纳米材料在河口水中抑菌效应的高效方法，探讨该方法的可靠性和实用性，并采用经典的BMD法和平板计数法进行性能验证。

副溶血弧菌标准菌株(ACTT17802)购自北京百欧博伟生物技术有限公司，采用Zhang等(2023b)报道的方法进行培养。Luria-Bertani (LB)培养基干粉购自青岛海博生物技术有限公司，采用超纯水制成实验用液体培养基(含0.5 g/L NaCl、10.0 g/L胰蛋白胨和5.0 g/L酵母提取物)。副溶血弧菌在LB液体培养基中接种，在Herocell C1S型培养箱(上海润度生物科技有限公司, 上海)中于36 ℃下150 r/min轻摇预培养过夜。然后选择活性菌株，转移到新的液体培养基中。第2次培养达到指数期后(约14 h)，取出一部分用标准平板计数法测定细菌浓度(单位CFU/mL) (Zhang et al, 2018)。其余培养液以三平行进行梯度稀释备用。除特殊说明之外，本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯。

采用Bastús等(2014)报道的湿化学法制备Ag NPs。50 mL柠檬酸钠(5 mmol/L)和单宁酸(0.25 mmol/L)的水溶液在三颈圆底烧瓶中油浴，剧烈搅拌下回流15 min。然后在溶液中注入0.5 mL 25 mmol/L的AgNO₃。关闭加热器，让反应持续10 min。冷却后，取出生成物。通过3次离心除去未反应物以纯化产物，最终获得0.80 g/L的Ag NPs纯水分散液。产物采用透射电镜(TEM, 200 KeV, FEI Talos F200S G2, 美国)、紫外-可见分光光度计(Lambda 900, PerkinElmer, 美国)和粒度仪(Malvern, 英国)进行形貌与性质表征。

河口水采样点信息如表 1所示，采集时间为2022年4月和12月，方法参照Das等(2012)的报道。简而言之，使用4 L柱式聚乙烯采水器在水面下10~15 cm处采集，然后装在洁净玻璃瓶中于室温下运输到实验室。为去除自然菌群的干扰，样品到达实验室后在121 ℃下灭菌30 min。然后于室温下密闭保存，使用前摇匀。

表 1(Tab.1)

表 1 采样点经纬度信息 Tab.1 Longitude and latitude information of sampling sites 采样点Sampling site 纬度N Longitude 经度E Latitude S1 36°11′00″ 120°07′25″ S2 36°10′55″ 120°07′34″ S3 36°10′45″ 120°07′44″ S4 36°14′37″ 120°18′31″ S5 36°09′17″ 120°09′17″ S6 36°09′11″ 120°21′48″ S7 36°01′59″ 120°12′00″ S8 37°00′44″ 120°11′37″

表 1 采样点经纬度信息 Tab.1 Longitude and latitude information of sampling sites

如图 1所示，EMGA法测定Ag NPs在河口水中抑菌效应的操作包括2个步骤：1)副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，暴露混合液加入预装有LB液体培养基的检测管中；2)检测管置入EMGA中测定存活细胞的生长动力学曲线，从而示出最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。具体如下：将10⁸ CFU/mL副溶血弧菌接种到灭菌处理过的河口水样品中，使其终浓度为10⁵ CFU/mL。然后各取10 mL分装入6个15 mL离心管中。分别加入倍比质量的Ag NPs，使该纳米材料的终浓度分别为0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 mg/L。室温下，150 r/min轻摇离心管30 min，然后各取200 μL暴露作用后的混合液分别注入预装有1.8 mL LB液体培养基的检测管(外径5 mm, NORELL公司, 美国)中。以灭菌LB液体培养基作为阴性对照，同样装入检测管。将每个检测管分别插入EMGA的一个工作通道中，开启仪器，设置参数——激励电压12 V、激励频率400 MHz、采集周期1 min和采集次数1 200，点击“开始”键，EMGA即实时呈现所有检测管中细菌生长的动力学(ΔC⁴-t)曲线。测定结束后，根据是否出现反正弦型生长曲线直接读出生理盐水中Ag NPs对副溶血弧菌的MIC值(Theophel et al, 2014)。

图 1(Fig. 1)

图 1 EMGA法测定河口水样中Ag NPs对副溶血弧菌抑制活性的示意图 Fig.1 Schematic of the working steps of determining MICs of Ag NPs against V. parahaemolyticus in estuarine water samples using the EMGA method

根据CLSI规定的BMD方法(Ceriotti et al, 2012)测定河口水中Ag NPs对副溶血弧菌的抑制效应。10⁵ CFU/mL副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，将混合物装入离心管中，采用Optima XL-90型离心机(贝克曼库尔特公司, 美国)处理5 min (3 000 r/min)以去除影响结果判断的悬浮颗粒(Nayak et al, 2005)。然后，各取20 μL暴露作用后的混合液分别注入预装有180 μL LB液体培养基的96孔板(康宁生物技术公司, 美国)中(姜晓瑜等, 2021)。用封口膜封住96孔板以防蒸发。将96孔板放在培养箱中于36 ℃下培养20 h，取出后，通过肉眼观察是否浑浊判断是否有菌生长增殖，进而读出MIC值。

参照Feng等(2020)报道的平板计数法测定河口水中Ag NPs对副溶血弧菌的抑制效应。10⁵ CFU/mL副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，如无特殊说明，采用1.5部分述及的离心法除去混合物中的悬浮颗粒。然后，采用移液器各取100 μL暴露作用后的混合液，10倍梯度稀释后，分别均匀涂在LB琼脂平板上。琼脂平板加盖后，在培养箱中于36 ℃下静止培养过夜，取出后，通过观察是否有菌斑生成判断细菌是否被完全抑制，进而判断出MIC值。

以BMD法或平板计数法所测定的MIC值为相对标准，采用基本符合(EA)率值考察EMGA法测定Ag NPs抑菌活性的有效性。即将EMGA法测定的Ag NPs对副溶血弧菌的MIC值与平板计数法或BMD法所测定的MIC值比较，如果正负相差不大于1倍，则视作基本符合(EA)；如果正负相差大于1倍而不大于2倍，则视作小偏差(mE)；如果正负相差大于2倍，则视作大偏差(ME)。为了验证EMGA法的重现性和精密度，测定Ag NPs在河口水样S1中抑菌效应的实验做9个平行。采用Microsoft Excel 2021处理数据以计算出平行实验结果的平均值和标准差(SD)。

透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)表征结果显示，本研究中合成的大部分Ag NPs接近球形，且在水中具有较好的分散性(图 2a)。随机分析100个颗粒的粒径(d, nm)，结果显示，平均值为(37±5) nm(图 2b)。新制备的纳米材料最大光吸收峰出现在415 nm左右(图 2c)，表现出Ag NPs的特征峰。该结果还表明，产物具有较好的形貌一致性和纯度。

图 1(Fig. 1)

图 2 Ag NPs的TEM (右上角插图：其在水中的分散液照片)(a)、粒度分布图(b)和UV-vis光谱图(c) Fig.2 TEM image (Top right inset showing aqueous dispersion photo) (a), particle-size distributions (b) and UV-vis spectra (c) of Ag NPs

科研界常通过分析纳米材料对微生物生长曲线的影响来推测该被分析物的抑菌效应(Theophel et al, 2014)。研究首先以河口水样S1作为代表探讨了复杂介质中Ag NPs对副溶血弧菌的作用。在河口水样S1中，10⁵ CFU/mL的副溶血弧菌急性暴露于不同浓度的Ag NPs之后，暴露混合液直接转入预装有LB液体培养基的检测管中，采用EMGA法测定存活细胞的生长动力学曲线，结果如图 3a所示。Ag NPs浓度为0时(阳性对照)，三平行实验皆得到了重现性良好的反正弦型生长曲线，说明本实验条件下存活细菌很多且正常、稳定地增殖与生长。当河口水中Ag NPs浓度逐渐增大时，副溶血弧菌的生长调整期随之逐渐增加，直到出现直线型响应线(表明新陈代谢活动完全被抑制)。当生理盐水中Ag NPs浓度≥24.0 mg/L时，在该培养时间范围内没有反正弦型细菌生长曲线出现，根据国际通用规则(Theophel et al, 2014)，可以认为在本实验条件下Ag NPs对副溶血弧菌的MIC值为24.0 mg/L。

图 1(Fig. 1)

图 3 EMGA法(a)、BMD法(b)和平板计数法(c)测定Ag NPs在河口水中对副溶血弧菌的抑制作用 Fig.3 Effects of Ag NPs on V. parahaemolyticus in estuarine water determined with the EMGA (a), BMD (b) and plate counting (c) methods in triplicate

为了验证EMGA法测定纳米材料抑菌活性的重现性和精密度，在一周内研究团队3名成员采用完全相同的操作方法分别进行了3次实验，测定了Ag NPs在河口水样品S1中对副溶血弧菌的MIC值，得到的MIC值皆为24.0 mg/L。该结果说明EMGA法具有良好的精密度和重现性。

作为对比，实验采用BMD法和平板计数法测定了相同条件下Ag NPs对副溶血弧菌的抑制效应，结果分别见图 3b和图 3c。由图 3可知，BMD法和平板计数法测定的MIC值也为24.0 mg/L，说明采用EMGA法分析河口水中Ag NPs的抑菌效应时，所得数据和采用经典的BMD法和平板计数法所得数据具有良好的一致性。

实验采用EMGA法、BMD法和平板计数法分别测定了S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8共8个河口水样品中Ag NPs对副溶血弧菌的急性暴露影响，MIC值如表 2所示。结果表明，EMGA法测定结果和BMD与平板计数法测定的MIC值吻合性很好，基本符合(EA)达到75%；小偏差(mE)为25%，未发现大偏差(ME)，说明EMGA法测定Ag NPs对副溶血弧菌抑菌效应具有良好的准确性。此外，EMGA法测定的MIC值往往大于或等于BMD法和平板计数法的测定结果，其原因在于自动化仪器的灵敏度高于肉眼观察。因此，EMGA法的抑菌效应测定结论比基于肉眼判断的结果具有更高的可靠性。

表 2(Tab.2)

表 2 EMGA法、BMD法和平板计数法测定的MIC值 Tab.2 MIC values of Ag NPs against V. parahaemolyticus obtained by EMGA, BMD and plate counting methods/(mg/L) 方法Method 样品Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 EMGA法 24.0 — — — — — 48.0 — BMD法 24.0 — 48.0 48.0 — — 48.0 — 平板计数法 24.0 — — 48.0 — 48.0 48.0 — 注：—表示Ag NPs在0~48.0 mg/L范围内未抑制住细菌的生长。 Note: —indicates that Ag NPs did not inhibit the bacterial growth over the concentration range of 0–48.0 mg/L.

表 2 EMGA法、BMD法和平板计数法测定的MIC值 Tab.2 MIC values of Ag NPs against V. parahaemolyticus obtained by EMGA, BMD and plate counting methods/(mg/L)

Zhang等(2021)研究表明，采用OD法测定模拟河口水中纳米材料对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制效应时，细菌生长OD-t曲线因受共存物质光学信号的干扰而波动严重，导致无法读取MIC的准确值。本研究采用BMD法和平板计数法测定河口水样中Ag NPs的抑菌效应时也需要采用离心法除去悬浮颗粒等干扰物，否则严重影响MIC值的准确读取(如图 4所示)。

图 1(Fig. 1)

图 4 未去除悬浮固体情况下河口水的BMD (a)和平板计数(b)结果图像 Fig.4 BMD (a) and plate counting (b) images of estuarine water in case of without removing suspended solids

由于MIC值和存活微生物的培养时间具有相关性(Theophel et al, 2014)，研究中培养时间全部采用20 h。在这种情况下，如图 5所示，采用EMGA法测定河口水样中Ag NPs对副溶血弧菌的影响时仅需要两步手工操作——将暴露后的混合物直接转移到检测管和上机测定存活细菌的生长动力学曲线，检测总周期为1 210 min。而采用BMD法和平板计数法都需要3个步骤，检测总周期为1 230 min。较之于经典的方法，EMGA法需要的手工操作步骤较少，意味着耗时、劳动力、费用和误差的降低，因此具有显著的性能优势。

图 1(Fig. 1)

图 5 EMGA法(上)和BMD、平板计数法(下)测定Ag NPs在河口水中抑菌效应的流程和时效示意图 Fig.5 Schematics of the procedures and time-consumption of determining MICs of Ag NPs against V. parahaemolyticus in estuarine water using the EMGA method (upper) and BMD and plate counting methods (lower)

本研究建立了一种测定Ag NPs在河口水中抑菌效应的表型方法。该方法仅需要两步手工操作：1)直

接将暴露混合液加入预装有LB液体培养基的检测管中；2)把检测管置入EMGA工作通道中测定存活细菌的生长动力学曲线。根据细菌生长曲线形状即可判读出该纳米材料在河口水中对副溶血弧菌的MIC值。较之于经典的测定方法(如BMD和平板计数)，其优势在于无需去除暴露混合液中诸如悬浮颗粒之类的复杂共存物，因此操作更简便、劳动强度小，总周期缩短至少20 min。此外，由于手工操作步骤较少，有效地降低了主观和客观误差风险。EMGA法测得的MIC值具有良好的精密度和重现性。同时，该基于传感器识别结果的自动化方法比BMD法和平板计数法具有更高的灵敏度。本研究为准确、高效地测定纳米材料在诸如河口水之类复杂介质中的环境毒理效应提供了新手段。