金属纳米颗粒是含有金属元素的纳米颗粒(林道辉等, 2009; 韩泽蓉等, 2023)，因其具有巨大的比表面积、特殊的小尺寸效应、良好的光电性能等优越的理化特性(王大力等, 2012; 陈嘉祥等, 2018; Sengul et al, 2020)，被广泛应用于陶瓷、化工、通讯和生物医疗等领域(Klaine et al, 2008; Naqvi et al, 2010; 花文凤等, 2014; Feng et al, 2018)。随着金属纳米颗粒在各领域的广泛使用，其废弃物不可避免地产生并进入自然界中；同时天然来源的有机胶体、火山爆发产生的烟尘气溶胶等金属纳米颗粒也广泛存在于自然界中。这些环境中的天然和人工金属纳米颗粒可通过污水倾倒、空气沉降、地表径流等直接或间接方式最终汇入海洋，从而对海洋环境构成潜在威胁(苗令占等, 2019)。研究发现，长江口淡水沉积物中锌纳米粒子的浓度为2.74×10¹²~1.21×10¹³颗粒/kg (Tou et al, 2021)；地中海和大西洋中检测到的钛基纳米粒子的浓度范围为1.2×10⁸~3.8×10⁹颗粒/L (Sanchís et al, 2020; Li et al, 2023)。随着时间积累，海洋中的金属纳米颗粒浓度逐年增加，其对海洋生态环境的影响引起了人们的关注。

海洋细菌是海洋生态系统中丰度最高的微生物类群(王奕娜, 2020)，常见的有假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、微球菌属(Micrococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)和链霉菌属(Streptomyces)等多个属，它们在海洋生态系统中的物质循环、能量流动以及维持海洋生态系统的多样性等方面发挥着重要作用(寻卓然等, 2024)。海洋细菌还参与各种海洋污染物和毒物转化与降解的过程，这有助于保持海洋生态系统的平衡和促进海洋的自净能力(程晓宇, 2019; 王奕娜, 2020)。随着海洋环境中金属纳米颗粒浓度的增加，其对海洋细菌生理生态的影响亟需深入研究。

获取纳米材料对细菌毒性效应数据的常规测定方法有平板涂布法、牛津杯法、紫外分光光度计法等，这些传统的方法在测定过程中耗时长、误差大、操作复杂(姜晓瑜等, 2021)。近年来，Zhang等(2021、2023)创建了一种新型的自动化表型方法——非接触式电导率传感器(CCS)法，其主要采用改进的电容耦合非接触电导检测器进行微生物培养液电导率值的在线、实时监测，所获得的响应值与培养介质中离子载流的浓度和迁移率成正比。通过检测培养介质的电导率变化情况即可快速而准确地记录细菌的生长过程。根据细胞结构的不同，细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中革兰氏阴性菌细胞壁比革兰氏阳性菌多一层由紧密堆积的脂多糖(LPS)分子构成的外膜，导致这2类细菌对外界胁迫产生不同的抵抗效应(李永强等, 2024; 刘畅等, 2024)。同时，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为海洋环境中广泛存在的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，它们分别代表了2种重要的微生物类别(Baker-austin et al, 2017; 鄢陆琪, 2023)。其中，枯草芽孢杆菌是海洋环境中的典型益生菌，其在促进宿主健康和环境修复方面发挥着关键作用；而副溶血弧菌则是海洋环境中的致病菌代表，其在引发食源性疾病方面具有显著影响(Liu et al, 2010; 郑姚等, 2021)。基于2种细菌在海洋微生物群落中的生态角色和功能，本研究以枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌为实验生物，以常见的金属纳米颗粒为研究对象，采用CCS法研究金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)和副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)的生长毒性效应，并获取其12 h-EC₂₀值，此研究结果将为海洋环境中金属纳米颗粒的环境风险评估提供科学依据。

所用金属纳米颗粒均购自苏州衍生生物科技有限公司，其具体相关信息见表 1，不同金属纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)表征图像见图 1。

表 1(Tab.1)

表 1 金属纳米颗粒材料相关信息 Tab.1 The information of nano-metal particles 纳米材料 Nanomaterials 粒径 Particle size/ nm 质量浓度 Mass concentration/ (mg/mL) 纳米银Ag NPs 30 0.10 纳米金Au NPs 30 0.10 纳米氧化银Ag2O NPs 30 1.00 纳米氧化锌ZnO NPs 30 1.00 纳米氧化铁Fe2O3 NPs 30 1.00 纳米二氧化钛TiO2 NPs 40 1.00

表 1 金属纳米颗粒材料相关信息 Tab.1 The information of nano-metal particles

图 1(Fig. 1)

图 1 金属纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像 Fig.1 Transmission electron microscopy (TEM) image of a metal nanoparticle

枯草芽孢杆菌(库藏号：B10)和副溶血弧菌(库藏号：V12)均分离自渤海海域，并保存于中国水产科学研究院黄海水产研究所。枯草芽孢杆菌采用Luria-Bertani (LB)培养基，副溶血弧菌采用Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)培养基，培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

实验开始前，采用CCS法绘制枯草芽胞杆菌和副溶血弧菌的生长曲线，如图 2可知，枯草芽胞杆菌和副溶血弧菌在720 min (12 h)时基本都进入生长稳定期。

图 1(Fig. 1)

图 2 枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌生长曲线 Fig.2 Growth curves of B. subtilis and V. parahaemolyticus

32通道非接触式电导率传感器(澳大利亚专业电子公司代加工)(Zhang et al, 2021)；BSA223型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，ES-60C恒温孵育摇床(杭州米欧仪器有限公司)，KH5200型超声波清洗器(昆山禾制超声仪器有限公司)，BPN-150CH二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

将副溶血弧菌接种于TCBS液体培养基中28℃培养12 h；蘸取菌液在TCBS平板上划线并过夜培养；挑取平板上的单菌落再次接种到新的TCBS液体培养基中28 ℃培养12 h；将培养后的菌液放入离心机中离心，弃上清液，用生理盐水(0.85 % NaCl) 2次洗涤离心，并将细菌沉淀重新悬浮于生理盐水中供后续研究使用。枯草芽孢杆菌的配制方法与副溶血弧菌相同，使用的培养基为LB培养基。

以Ag NPs为例，取Ag NPs悬液标准品，加入配置好的LB (或TCBS)培养基稀释成10 mg/L Ag NPs悬液储备液(每次使用前需超声20 min)，再通过稀释10 mg/L Ag NPs悬液储备液得到所需浓度的悬液。配置其他金属纳米颗粒悬浮液时采用相同的方法，其中，Ag₂O NPs储备液的浓度为50 mg/L，ZnO NPs、Fe₂O₃ NPs和TiO₂ NPs储备液的浓度为200 mg/L，不同金属纳米颗粒不同浓度悬浮液配制见表 2。

表 2(Tab.2)

表 2 金属纳米颗粒悬浮液的配制 Tab.2 Nanomaterial suspension preparation concentration/(mg/L) 纳米材料 Nanomaterial 枯草芽孢杆菌菌液 B. subtilis solution 副溶血弧菌菌液 V. parahaemolyticus solution Ag NPs 0.02 0.04 0.08 0.16 0.32 0.64 1.28 2.56 0.02 0.04 0.08 0.16 0.32 0.64 1.28 2.56 Au NPs 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 Ag2O NPs 2.00 4.00 8.00 10.00 12.00 16.00 20.00 30.00 2.00 4.00 8.00 10.00 12.00 16.00 20.00 30.00 ZnO NPs 0.50 2.00 3.50 5.00 6.50 8.00 9.50 11.00 1.00 2.00 4.00 8.00 16.00 32.00 64.00 128.00 Fe2O3 NPs 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 110.00 120.00 140.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 110.00 120.00 140.00 TiO2 NPs 5.00 10.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 5.00 10.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00

表 2 金属纳米颗粒悬浮液的配制 Tab.2 Nanomaterial suspension preparation concentration/(mg/L)

根据Zhang等(2021)的实验步骤进行操作，以枯草芽孢杆菌和Ag NPs为例。量取10 mL配制好的Ag NPs悬液于已灭菌的玻璃瓶中；取配制好的100 μL枯草芽孢杆菌菌液接种到其中，混合均匀；用无菌注射器吸取3 mL混合体系加入到核磁共振管中，每个浓度取3管，并设置阳性及阴性对照各3管(阳性对照：核磁共振管中加入10 mL培养基和100 μL菌液；阴性对照：核磁共振管中加入等量的培养基)；将核磁共振管放入仪器中进行测量(Zhang et al, 2021)，仪器激励电极处的电压为16 V，频率为2 MHz，设置仪器每隔1 min采集一次数据，实验持续12 h。测定其他纳米材料，即Au NPs、Ag₂O NPs、ZnO NPs、Fe₂O₃ NPs、TiO₂ NPs对枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的生长毒性时采用相同的实验方法。

由于非接触式电导率传感器激励电极处产生的交流电流信号经过信号处理电路中的电流–电压转换环节、整流环节等最终将交流电流信号转化成直流电压信号输出(Zhang et al, 2023; 周颖, 2015)，因此，本研究采集到的是关于浓度和电压关系的数据。

为计算金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的12 h-EC₂₀值，利用Graphpad Prism软件，将不同金属纳米颗粒浓度的对数值与细菌的生长抑制率作图，生成剂量–抑制曲线，并由此计算枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的12 h-EC₂₀值。

此外，本研究所有数据均采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，平均值和标准差用Excel软件进行计算。组间数据用Excel软件进行差异分析，P < 0.05表示数据间有显著性差异，并利用Origin 9.1软件做图，生成浓度–电压柱形图。

本研究采用CCS法研究了常见的金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的毒性影响，由图 3可知，Au NPs、Ag NPs、Ag₂O NPs、ZnO NPs、Fe₂O₃ NPs和TiO₂ NPs对枯草芽孢杆菌的生长具有抑制作用，当其浓度分别为1.50、0.04、2.00、2.00、60.00和5.00 mg/L时，枯草芽孢杆菌生长开始受到抑制(P < 0.05)(图 3A~F)。同时，当Au NPs (图 3A)和ZnO NPs (图 3D)悬液浓度分别高于1.50 mg/L和5.00 mg/L时，它们对枯草芽孢杆菌的毒性影响逐渐减弱，这可能与纳米粒子的团聚现象有关。研究表明，Au NPs和ZnO NPs的毒性与粒径有关，粒径越小，毒性越强；随着浓度增加，Au纳米颗粒和ZnO纳米颗粒团聚并导致其有效粒径变大，对细菌的毒性作用也随之减弱(Iswarya et al, 2016; 荣馨宇等, 2023)。金属纳米颗粒对细菌的毒性影响与其浓度也有关，浓度越高其释放的金属离子浓度越高，毒性越强(丁怡丹等, 2020)。随着Ag NPs浓度的增加，枯草芽孢杆菌生长受到的抑制作用增强(图 3B)。

图 1(Fig. 1)

图 3 金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌的生长抑制 Fig.3 The growth inhibition of metal nanoparticles on B. subtilis

此外，本研究还发现ZnO NPs和Fe₂O₃ NPs对枯草芽孢杆菌的生长表现出抑制现象(图 3D~E)，而对副溶血弧菌的生长表现出促进现象(图 4D~E)。这一方面是由于副溶血弧菌对锌和铁的需求比较高，其在富锌和富铁环境中可以利用锌和铁进行呼吸作用和代谢活动，从而获得能量和生长所需的营养物质(刘芳彤等, 2019)；而枯草芽孢杆菌对锌和铁的需求较低，虽然其也可利用锌和铁进行呼吸作用和代谢活动，但它通常在低锌或低铁环境中生长得更好(Hood et al, 2012; Cornelis et al, 2013)。另一方面是由于ZnO NPs和Fe₂O₃ NPs对细菌的毒性与受试菌种的类型有关(王大力等, 2012)，相比于革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)，革兰氏阴性菌(副溶血弧菌)的细胞壁多有一层LPS外膜结构，且已有研究表明，细菌细胞壁的LPS能够吸附Mg²⁺和Ca²⁺等阳离子，形成非常紧密的堆积层，并赋予外膜特有的渗透屏障特性，使它们在允许营养物质进入的同时能够在一定程度上阻碍有毒物质(金属纳米颗粒等)进入细胞(张静静, 2022)，这为副溶血弧菌提供了有效抵抗纳米粒子的屏障(Fan et al, 2002; Yoon et al, 2007; Tran et al, 2010)。

图 1(Fig. 1)

图 4 金属纳米颗粒对副溶血弧菌的生长抑制 Fig.4 The growth inhibition of Metal nanoparticles on Vibrio parahaemolyticus sp.

本研究通过CCS法还研究了常见的金属纳米颗粒对副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)的生长影响，由图 4可知，Au NPs、Ag NPs、Ag₂O NPs和TiO₂ NPs对副溶血弧菌的生长具有抑制作用，当其浓度分别为2.00、2.56、4.00和10.00 mg/L时，副溶血弧菌的生长开始受到抑制(P < 0.05)(图 4A~C、F)。已有研究也发现，一定浓度的金属纳米颗粒对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)和藻类等的生长表现出明显的抑制作用(Zhang et al, 2021; 郑有坤等, 2021; Cavalu et al, 2011)。金属纳米颗粒对副溶血弧菌的生长抑制作用与金属纳米离子的释放(Au⁺、Ag⁺等)有关(Xie et al, 2020; Zhang et al, 2021)，金属纳米离子的不断释放是一种潜在的杀菌机制(刘玉琳等, 2023)。研究表明，Au NPs、Ag NPs、Ag₂O NPs释放的Au⁺和Ag⁺能够刺激副溶血弧菌产生活性氧(ROS)等超氧化物，大量的超氧化物会造成副溶血弧菌DNA损伤和ATP水平下降，进而引起副溶血弧菌细胞壁和细胞膜损伤、细菌死亡(Shareena Dasari et al, 2015; Lee et al, 2018)。研究还发现，金属纳米颗粒对副溶血弧菌的生长抑制作用也与金属纳米颗粒的种类有关(朱小山等, 2008; 王壮等, 2021)。由于TiO₂ NPs是一种惰性物质，其溶解速率非常低且在水介质中不能释放金属离子，它的抗菌活性主要通过接触、渗透或吸附在细菌表面并破坏细菌细胞壁而产生(Priyanka et al, 2016; Ammendolia et al, 2022)。与溶解性较好的金属纳米颗粒(如Au NPs、Ag NPs等)相比，TiO₂ NPs对副溶血弧菌的毒性偏弱，因此，Au NPs、Ag NPs和Ag₂O NPs对副溶血弧菌的毒性强于TiO₂ NPs。

在生态风险评估和生态毒理学中，通常使用2个测量终点来总结毒性：无观察效应浓度(NOEC)和x%有效浓度(ECx)(Beasley et al, 2015)。然而，由于NOEC只是一个实验设计浓度，不能构造置信区间，经济合作与发展组织推荐应用低ECx模拟NOEC作为生态安全暴露基准浓度(Isnard et al, 2001; 施文杰等, 2019)。EC₂₀值是一种与环境相关的浓度，是指与对照相比，在给定的暴露期内溶解在介质中的目标物质(本研究中为金属纳米颗粒)使20%的受试生物表现出响应(如：生长、繁殖等)的浓度(戚钱菊, 2022)，在已有的研究中，EC₂₀常用于各种污染物的环境风险评估(Liu et al, 2019; Gao et al, 2022)。本研究通过绘制金属纳米颗粒对细菌的剂量–抑制曲线(图 5、6)，计算出金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的12 h-EC₂₀值。从图 6可以看出，本研究浓度范围内ZnO NPs和Fe₂O₃ NPs对副溶血弧菌的生长表现出促进作用，与图 4中金属纳米颗粒对副溶血弧菌的生长抑制结果相一致。由表 3可知，Ag NPs对副溶血弧菌和芽孢杆菌的生长抑制作用最强，其对2种菌的12 h-EC₂₀值分别为0.16 mg/L和0.03 mg/L。覃春丽等的研究结果也表明，与其他金属纳米材料(ZnO NPs、TiO₂ NPs等)相比，Ag NPs对假单胞菌(Pseudomonasadaceae)、大肠杆菌等的EC₂₀值更低，毒性作用更强(覃春丽, 2012; Barros et al, 2019; 段颖, 2021)。

图 1(Fig. 1)

图 5 金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌的12 h剂量–抑制曲线 Fig.5 The dose-inhibition curves of metal nanoparticles on B. subtilis

图 1(Fig. 1)

图 6 金属纳米颗粒对副溶血弧菌毒性的12 h剂量–抑制曲线 Fig.6 The dose-inhibition curves of metal nanoparticles on V. parahaemolyticus

表 3(Tab.3)

表 3 枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌12 h-EC20值 Tab.3 The EC20 values of B. subtilis and V. parahaemolyticus on 12 h /(mg/L) 纳米材料 Nanomaterials 枯草芽孢杆菌 B. subtilis 副溶血弧菌 V. parahaemolyticus Au NPs 1.81 8.11 Ag NPs 0.03 0.16 Ag2O NPs 1.71 2.97 ZnO NPs 3.53 0.68 Fe2O3 NPs 118.4 43.12 TiO2 NPs 54.43 81.55

表 3 枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌12 h-EC20值 Tab.3 The EC20 values of B. subtilis and V. parahaemolyticus on 12 h /(mg/L)

目前，根据实验室毒性实验得出的急性x%致死/有效/抑制浓度(LCx/ECx/ICx)或慢性无观察效应浓度(NOEC)的毒性终点，已经开发出物种敏感性分布(SSD)等方法来评估不同污染物的潜在环境风险(Gottschalk et al, 2013; Feng et al, 2022)。同时，我国国家生态环境标准中用于污染物潜在环境风险评估的物种主要为藻类、鱼类和虾蟹类等，且已有的研究中，对污染物的环境安全阈值评估的数据(LCx/ECx /ICx)也主要来源于植物和动物(Gambardella et al, 2015; Fazelian et al, 2019)。然而，Xu等(2015)报告表明，评估某种有毒污染物对生态系统的生态风险时，需选择代表不同营养级分类群的物种。微生物作为营养级中的分解者，其在生态系统中扮演着不可或缺的角色，然而，当前用于污染物潜在环境风险评估的研究对象多聚焦于生产者和消费者，而对分解者关注不足。因此，建议研究人员在未来的研究过程中加强污染物对分解者毒性效应的关注，本研究结果也将为我国构建更完善的风险评估系统提供理论支撑。

本研究通过新型的自动化表型方法——非接触式电导率传感器(CCS)法研究常见6种金属纳米颗粒对枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌的生长毒性，结果表明，Au NPs、Ag NPs、Ag₂O NPs、ZnO NPs、Fe₂O₃ NPs和TiO₂ NPs对枯草芽孢杆菌的生长均具有抑制作用，当其浓度分别为1.50、0.04、2.00、2.00、60.00和5.00 mg/L时，枯草芽孢杆菌的生长开始受到抑制(P < 0.05)；只有4种金属纳米颗粒(Au NPs、Ag NPs、Ag₂O NPs和TiO₂ NPs)对副溶血弧菌的生长具有抑制作用，当其浓度分别为2.00、2.56、4.00和10.00 mg/L时，副溶血弧菌的生长开始受到抑制(P < 0.05)；在本实验设定浓度范围内，ZnO NPs (1.00~128.00 mg/L)和Fe₂O₃ NPs (60.00~140.00 mg/L)对副溶血弧菌的生长表现出促进作用。传统污染物环境风险评估方法中关注的主要物种是生产者和分解者，忽略了污染物对生态系统中重要的分解者的影响，本研究通过CCS法快速获取金属纳米颗粒对海洋生态系统中的分解者(枯草芽孢杆菌和副溶血弧菌)的生长抑制EC₂₀值，该结果可为我国全面系统的构建金属纳米材料在海洋生态系统中的环境风险评估提供理论依据。