黄渤海地区拥有丰富的渔业资源，是全国重要的贝类养殖海域。黄海西以渤海海峡与渤海相连，此海域海水具有低温高盐的特点，适合深海水产品的养殖，是著名的“海上粮仓”(金显仕等, 2023)。渤海是我国最大的半封闭型内海，也是重要的海洋生物产卵场、育幼场和索饵场。山东省烟台市长岛县位于胶东和辽东半岛之间，黄渤海交汇处，拥有优越的地理位置和海洋环境，是全国首个海上经济开发区，也是山东重要的贝类养殖区域。2023年山东扇贝产量为1 023 104 t，约占全国扇贝总产量的55.17% (农业农村部渔业渔政管理局等, 2024)。然而，环黄渤海经济圈在工业化和城市化进程中向黄渤海排放了大量工业污染物，海洋环境严重富营养化(李奇龙等, 2024)。水体富营养化会导致藻类暴发式增长或聚集，从而导致有害藻华产生，严重影响当地贝类养殖与安全。研究发现，山东近海均有赤潮暴发的记录，长岛县海域、烟台四十里湾是最常暴发赤潮灾害的区域(周健等, 2020)。有毒赤潮可能会产生海洋毒素，引起海洋生物的大量死亡，同时可能通过鱼类和贝类的富集最终对人类产生毒害作用(Yan et al, 2024)。

黄渤海海域的产毒藻种类众多，该海域浮游植物、水体基质中已检出多种贝类毒素。产脂溶性贝毒(lipophilic shellfish toxins, LSTs)的鳍藻属(Dinophysis spp.)在北黄海海域被检出(孙洪潇等, 2023)。产软骨藻酸毒素(domoic acid, DA)的伪菱形藻(Pseudo-nitzschia)在北黄海獐子岛典型虾夷扇贝养殖区与烟台四十里湾少量检出(Zhao et al, 2024)。黄渤海海域的水体里也同样存在贝类毒素，Chen等(2018)在黄海和渤海近岸表层海水样品中检测到了扇贝毒素(pectenotoxin, PTX)、大田软海绵酸毒素(okadaic acid, OA)、鳍藻毒素(dinophysistoxins, DTX)、裸甲藻亚胺毒素毒素(gymnodimine, GYM)等多种LSTs；Tang等(2022)在秦皇岛附近海域水体中检出了膝沟藻毒素(gonyautoxin, GTX)1/4、GTX2/3等多种PSTs；Chen J等(2023)对渤海和北黄海的海水、悬浮颗粒物和浮游植物中的DA进行了全海域调查，发现渤海、黄海北部和莱州湾近岸和外海广泛存在溶解态DA。

长岛海域贝毒研究较少，但仍存在PSTs污染。在山东长岛海域记录到能够产生PSTs的亚历山大属藻类(Alexandrium spp.)赤潮，导致大量网箱养殖鱼类死亡(于仁成等, 2016a)。1990—2020年，在长岛县南隍城岛海域监测到产麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins, PSTs)的塔玛亚历山大藻(A. tamarense)赤潮，受灾面积累计2.37 km²，而在烟台四十里湾、威海近海也检测到产PSTs的裸甲藻属(Gymnodinium spp.)，受灾面积累计48.88 km² (周健等, 2020)。2016年，渤海秦皇岛贻贝PSTs最高含量达52 072.8 µg STXeq/kg，导致10余人中毒及2人死亡(张海涛等, 2022)，其含量为欧洲食品安全局(EFSA)安全限量(800 µg STXeq/kg)的65倍(Alexander et al, 2009)；2007年，黄海海域虾夷扇贝PSTs检出率为79.2%，最高含量达8 339.6 µg STXeq/kg (范礼强等, 2021)。2019—2021年，渤海海域唐山贝类养殖区的7种经济贝类检出了PSTs，其中，GTX1含量最高为537.95 μg/kg (郑旭颖, 2023)。Wu等(2015)在我国沿海发现了5种LSTs：OA、氮杂螺环酸毒素(azaspiracid, AZA)1、PTX2、GYM和去甲螺旋内酯C毒素(13-desmethylspirolide C, SPX)1，最高含量分别为37.3、5.90、16.4、14.4和8.97 μg/kg，其中，山东青岛样品的PTX2含量最高，为14.4 μg/kg。Zheng等(2022)在山东省7个城市采集了133个贝类样品用于测定DA含量，超过1/3 (36.1%)的样品检测到DA，含量范围为0~102 μg/kg，其中，烟台DA平均含量为22.0 μg/kg。

黄渤海海域已广泛存在PSTs、LSTs、DA及其产毒藻属藻类(Song et al, 2014)。长岛地处两大海域交汇处，目前还缺乏对贝类毒素组分种类、含量、季节变化规律等方面的全面系统的研究，对于毒素污染特征及潜在来源尚未明确(Chen N et al, 2023; 于仁成等, 2016b)。本研究通过在长岛对浮游植物及贝类进行连续采样，使用LC-MS/MS法筛查不同基质中多种贝类毒素，探究长岛海域中贝类毒素的种类、含量及分布特征，了解目标海域贝类毒素的污染状况和变化规律，以期识别目标海域贝类中毒素风险的可能来源。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂

毒素标准溶液：OA、DTX1、DTX2、虾夷扇贝(yessotoxin, YTX)、AZA1、AZA2、AZA3、PTX2、GYM、SPX、DA、磺酰氨甲酰膝沟藻毒素(N-sulfocarbamoylgonyautoxin-2 & 3, C1 & 2)、脱氨甲酰基膝沟藻毒素(decarbamoylgonyautoxin, dcGTX) 2 & 3、GTX2 & 3、GTX1 & 4、GTX5、脱氨甲酰基新石房蛤毒素(decarbamoylneosaxitoxin, dcNEO)、石房蛤毒素(saxitoxin, STX)和新石房蛤毒素(neosaxitoxin, neoSTX) (加拿大国家研究所)。去离子水；甲酸、氨水、甲酸铵、乙腈、乙酸、甲醇(质谱纯, 德国Merck公司)。

1.1.2 仪器

液相色谱(Shimadzu Prominence LC-20ADXR, 日本)–四极杆线性离子阱复合质谱仪(AB-5500 QTRAP, AB Sciex，美国)；高效液相色谱(U3000)–三重四极杆质谱仪(TSQ Endura) (Thermo Scientific，美国)；HILIC色谱柱(TSK gel Amide-80, 2.0 mm ×150 mm, 5 μm, 日本东曹株式会社)；Kinetex C18色谱柱(2.1 mm× 100 mm, 2.6 μm, Phenomenex，美国)；X-Bridge C18色谱柱(3.0 mm×150 mm, 3.5 μm, Waters，美国)；高速离心机(Himac CR 22GⅡ, Hitachi，日本)；ENVI-Carb SPE柱(3 mL, 250 mg, Supelco，美国)；Strata™-X SPE柱(3 mL, 60 mg, Phenomenex，美国)；Bond Elut SAX SPE柱(3 mL, 500 mg, Agilent，美国)；固相萃取装置(Supelco，美国)。

1.2 样品采集

2023年6—10月期间，每月在山东烟台长岛海域的常规站位(S1、S2、S3、S4和S5)采集浮游植物1次；8月和10月在监测站位(S6和S7)采集浮游植物1次(图 1)。浮游植物样品采集方法：采集表层海水5 L，其中1 L×5分别过滤到4张GF/C滤膜(孔径1.2 μm, Φ47 mm)和1张PC膜(孔径0.22 μm, Φ47 mm)，4张微孔滤膜分别用于测定PSTs/LSTs/DA/备份，PC膜样品用于测定有毒藻分子生物学相关信息，–20 ℃冷冻保存，并尽快转移至–80 ℃保存。2023年6—10月每月在长岛附近海域养殖场采集贝类样品，包括太平洋牡蛎、栉孔扇贝和紫贻贝。沉积物采集：使用抓斗式采泥器采集沉积物，采集后用软胶管吸走上腹水，将沉积物放至洁净的不锈钢样品盘中。用不锈钢勺取表层0~2 cm沉积物样品，保存在样品袋，做好标记、冷藏保存。所有样品均按地点和时间分类，保存在4 ℃便携式冷却箱中，并在48 h内运至实验室。

1.3 毒素提取 1.3.1 贝类PSTs、LSTs、DA提取

PSTs：参考Zheng等(2024)的方法，使用1%乙酸提取PSTs，提取液使用ENVI-Carb SPE柱(3 mL, 250 mg)萃取净化，过0.22 μm水系滤膜于进样小瓶中。LSTs：参考Wu等(2015)的方法，采用甲醇溶液提取LSTs，使用Strata TM-X SPE柱(3 mL, 60 mg)萃取提取液，定容后过0.22 μm有机系滤膜于进样小瓶中。DA：参考Zheng等(2022)的方法，选择Bond Elut SAX SPE柱(3 mL, 500 mg)萃取提取液，定容后过0.22 μm水系滤膜于进样小瓶中。以上样品均供LC-MS/MS分析。

1.3.2 浮游植物PSTs、LSTs、DA提取

将GF/C滤膜剪碎放入离心管中，分别加入5 mL 1%乙酸水(提取PSTs)/甲醇(提取LSTs)/50%甲醇(提取DA)溶液，冰浴超声破碎(间隔2 s, 破碎5 min)，取破碎完液体2 mL，10 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，分别过0.22 μm水系/有机系/水系滤膜于进样小瓶中，供LC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS方法与参数

PSTs：参考Boundy等(2015)和Qiu等(2022)的方法，采用高效液相色谱–三重四极线性离子阱质谱对PSTs样品进行LC-MS/MS分析。使用HILIC色谱柱在40 ℃下分离PSTs。LSTs：参考Wu等(2015)的方法，使用Waters X-Bridge C18色谱柱在40 ℃下分离LSTs。DA：参考Zheng等(2022)的方法，使用U3000高效液相色谱系统和三重四极杆质谱仪进行分析。液相系统中使用Kinetex C18色谱柱，温度为35 ℃。

1.5 浮游植物高通量测序分析方法

本研究使用S3站位(120.72°E, 38.05°N)采集的浮游植物样品进行高通量分析，筛选长岛附近海域潜在的PSTs产生源。样品制备和分析方案参照Chen等(2019)的方法，使用E.Z.N.A™ Mag Bind Soil DNA Kit (Omega, M5635-02, 美国)提取浮游样品基因组DNA。反应设置：微生物DNA (10 ng/μL) 2 μL；扩增子PCR正向引物(10 µmol/L) 1 µL；扩增子PCR反向引物(10 µmol/L) 1 µL；2×Hieff^® Robust PCR Master Mix (Yasen, 10105ES03, 中国)。将板密封并在热循环仪器(Applied Biosystems 9700, 美国)中使用以下程序进行PCR：1个循环在95 ℃变性3 min，前5个循环在95 ℃变性30 s、45 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，然后95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，循环20次。

PCR产物使用TBE缓冲液(Tris、硼酸、EDTA)中的2% (w/v)琼脂糖凝胶电泳进行检查，用溴化乙锭(EB)染色并在紫外光下可视化。使用通用Illumina进行文库构建。在测序之前，使用Qubit^® 4.0 Green双链DNA测定法测定每个PCR产物的DNA浓度，并使用生物分析仪(Agilent 2100, 美国)进行质量控制。

1.6 质量控制

实验中使用的所有容器在使用前均用甲醇和蒸馏水交替冲洗2~3次，以减少潜在污染或残留效应。LC-MS/MS分析中，每10个样品插入一次试剂空白、标准溶液，以保证结果的精密度和准确性。同时使用样品空白来验证样品在处理过程中是否存在污染。所有目标分析物的回归系数r²均高于0.995。所有目标分析物的加标回收率为63.7%~91.3%。

1.7 数据处理

描述及统计性相关图表均使用Origin 2023处理生成，使用Usearch软件将有效标签聚类成相似度≥97%的操作分类单元(OTU)，采样图使用ArcGIS Pro(2022)绘制，底图从国家地理信息公共服务平台下载，审图号：GS(2024) 0650号。

2 结果

对2023年6—10月在长岛附近海域采集的贝类样品、浮游植物样品进行毒素分析，共筛查29种贝毒，包括14种PSTs、14种LSTs以及1种DA。整个调查期间检出了PSTs和LSTs，未检出DA。其中，PSTs的主要检出组分是GTX1/4、GTX2/3、C1和C2，而LSTs检出率低且含量低，仅有6月栉孔扇贝样品检出PTX2，含量仅为2.46 μg PTX2eq/kg SM，远低于欧盟现行的安全限量160 µg PTX2eq/kg SM (Alexander et al, 2009)。由于本研究中长岛附近海域贝类、浮游植物的DA、LSTs污染风险较低，因此，将重点分析PSTs的污染特征及潜在来源。

2.1 贝类样品中PSTs检出概况

表 1列出了6—10月贝样中检出PSTs的含量、组分及检出率，均未超过EFSA安全限量。检出毒素组分以GTX2、GTX5、C1和C2为主。GTX2是检出率最高的毒素，为53.3%。C1是含量最高的毒素(179 μg/kg)。而GTX1是毒性最强的毒素之一，检出率为30%，最高含量为43.4 μg/kg。全部贝样中未检测到STX、NEO、dcSTX、dcNEO、GTX6等毒素。

图 2展示了6—10月有检出的贝类PSTs含量、组分及毒性当量的变化。整个调查期间采集的贝样中，6月和8月的紫贻贝、太平洋牡蛎，以及7月全部贝样未检出PSTs。而PSTs毒性水平出现了2个峰值，其中，9月栉孔扇贝毒性最高(167 μg STXeq/kg)，其次是10月栉孔扇贝(64.5 μg STXeq/kg)。9月栉孔扇贝PSTs含量为478 μg/kg，同样是所有月份中最高，其次是10月栉孔扇贝，含量为221 μg/kg。其他有检出的月份PSTs含量与毒性水平较低，6—10月采集的贝样PSTs毒性水平及含量总体呈先上升后下降趋势，6—8月无明显升高，9月增至峰值，10月则出现较大回落。

不同月份检出的PSTs组分有所差异(图 3)，6月和8月检出了氨基甲酸酯类的GTX2和GTX3，分别占比73.0%、27.0%与69.9%、30.1%。9月共检出9种组分，其中，N-磺胺甲酰基类的C1占比39.1%，为9月含量最高组分；其次是GTX2，占比17.9%；脱氨甲酰基类的dcGTX2占比12.2%，含量较少的是几种β差向异构体如C2、dcGTX3、GTX3和GTX4，分别占比5.20%、3.30%、4.10%和3.10%。10月检出组分及占比和9月相似，但不同组分含量上有所差异。

2.2 浮游植物样品中PSTs检出概况

2023年6—10月在长岛附近海域7个站位采集了浮游植物样品，其中，9月S2、S3和S4站位采集样品有PSTs检出，10月S1和S2站位有检出，且含量较低。其他月份及站位均未检出PSTs。浮游植物PSTs最高含量为9月S2站位的21.51 ng/L，平均含量为21.09 ng/L。10月PSTs平均含量为2.26 ng/L (图 4)。10月S1和S2站位仅检出2种组分，分别为dcGTX3和GTX4。相比于10月，9月PSTs组分较为丰富，共检出7种组分(图 4)，分别为GTX1/4、GTX2、dcGTX3、GTX5和C1/2，且3个检出站位组分差异较小。

2.3 PSTs潜在产毒藻物种鉴定

本研究选用S3站位(120.72°E, 38.05°N)浮游植物样品的高通量测序数据来检索位于黄渤海交界处的长岛附近海域可能存在的PSTs产毒藻种类。使用Illumina MiSeq系统进行测序。测序后，通过PEAR软件根据重叠情况组装2个短Illumina读数，并处理fastq文件，生成单独的fasta和qual文件，通过标准方法进行分析。使用Usearch软件将有效标签聚类成相似度≥97% OTU。去除嵌合序列和单例OTU，然后根据OTU将剩余序列分类到每个样本中。选择丰度最高的标签序列作为每个簇内的代表序列。通过分别针对NCBI数据库、RDP数据库和UNITE真菌ITS数据库进行检索，对细菌和真菌OTU代表序列进行分类。根据长岛附近海域浮游植物样品高通量测序结果，共有2 012个OTU被归属为真核微藻，经与数据库的BLASTing结果对比，筛选出8个可能属于亚历山大属藻类的OTU。

6—10月检测的5个浮游植物样品藻丰度如图 5所示，7—10月均有亚历山大属细胞检出，其中，9月亚历山大属细胞与其余月份相比丰度最高。对9月S3站位采集的沉积物样品进行甲藻包囊分析鉴定，也发现亚历山大属细胞包囊(图 6)，表明本研究采样的长岛海域可能存在一定的亚历山大属藻类危害。

3 讨论 3.1 长岛附近海域贝类PSTs污染特征

黄渤海地区赤潮灾害发生较为频繁，2023年黄渤海海域共发生15次赤潮灾害，累计受灾面积达426 km² (自然资源部海洋预警监测司, 2024)。李晓康等(2024)检测了2022年3—6月渤海秦皇岛地区部分经济贝类的PSTs含量，其中最高毒性当量为728.1 μg STXeq/kg，主要检出组分为GTX1/4、GTX2/3和C1，其中，北戴河地区的PSTs污染程度最严重。Cao等(2023)研究分析了2019—2020年大连地区黄渤海贝类中PSTs污染状况，栉孔扇贝PSTs检出率高达94.4%，其最高检出量为3 953.5 µg STX·2HCl eq/kg，主要检出组分为GTX1、C1和dcNEO。范礼强等(2021)检测了黄海海域虾夷扇贝PSTs污染情况，其检出率为79.4%，最高检出含量为8 339.6 μg STX eq/kg，远高于PSTs安全限量(800 μg STXeq/kg)。2019年，在渤海海域采集的紫贻贝、虾夷扇贝PSTs检出率为61.1%，最高检出含量为288.5 μg STXeq/kg，而在黄海海域采集的长牡蛎最高含量为526.9 μg STXeq/kg (张海涛, 2022)。与黄渤海其他附近海域相比，本研究分析的长岛附近海域贝类PSTs主要检出组分基本一致，但含量较低；主要组分为GTX1/4、GTX2/3、C1/C2、dcGTX2/3等，不含STX和NEO等毒性当量较高的组分。

3.2 长岛附近海域浮游植物PSTs污染来源及特征

选择高通量扩增的V4靶区，从NCBI下载了12个亚历山大属的18S rDNA V4区序列，结合本研究中筛选的亚历山大属藻OTU序列，采用MEGA 11最大似然法构建系统进化树(图 7)，对部分亚历山大属藻类进行了种系进化关系分析。OTU1735、OTU1463、OTU1776、OTU290和OTU436其对应种的同一性很高(> 99%)，这些OTU有可能代表对应的亚历山大属藻类。其他OTU818与OUT93其对应物种的同一性较低(91%~97%)，但利用18S rDNA V4区域序列构建的最大似然树仍支持其归属。而在可能检出的亚历山大属藻类中，太平洋亚历山大藻(A. pacificum)、近缘亚历山大藻(A. affine)在整个采样期间(6—10月)都持续存在，而微小亚历山大藻(A. minutum)、李氏亚历山大藻(A. leei)仅在9月和10月检出，其余几种丰度较低。值得注意的是，DNA提取及目标序列扩增偏好性对高通量测序结果影响很大，如果采用qPCR方法可能会得到更加可靠的结果。因此，基于V4丰度对PSTs的指示意义值得进一步关注(孙洪潇等, 2023)。

渤海海域发现了亚历山大属藻的营养细胞和包囊，并有亚历山大属赤潮灾害的报道(Liu et al, 2017)。Min等(2023)在山东近海海域检出链状亚历山大藻(A. catenella)、太平洋亚历山大藻、近缘亚历山大藻等亚历山大属藻细胞，其中，太平洋亚历山大藻在夏季检出。Gao等(2015)研究发现黄海海域存在塔玛亚历山大藻、芬地亚历山大藻(A. fundyense)和太平洋亚历山大藻，其中，芬地亚历山大藻、太平洋亚历山大藻会产生较多的C1/2、GTX1/4、GTX2/3、GTX5、dcGTX2/3等毒素。根据其他研究分析，近缘亚历山大藻、微小亚历山大藻会产生GTX1/4、GTX2/3 (Liu et al, 2020)，A. leii会产生GTX5、GTX1/4、GTX2/3 (Nguyen-Ngoc, 2004)。这些研究与本研究检出的藻属、毒素组分及其出现的月份基本对应，因此，推测本研究分析的长岛附近海域PSTs产毒藻可能为亚历山大属藻类。长岛6—10月贝类样品中平均PSTs含量存在差异，9月的贝类样品平均PSTs含量最高。Alonso等(2024)研究发现，亚历山大属藻在生长动力学和温度测试中呈正相关关系，21~27 ℃区间较为适合其生长，最佳温度区间为(25±2) ℃。Nguyen-Ngoc (2004)研究发现，近缘亚历山大藻的生长温度范围为21~27 ℃，在21~24 ℃时达到生长指数期；塔玛亚历山大藻生长率随温度变化显著，低于7 ℃或高于26 ℃时不生长，最适生长范围为11~22 ℃。Suka等(2024)研究发现，在自然环境中，李氏亚历山大藻适合在约20 ℃生长，而链状亚历山大藻适合在约10 ℃下生长。根据中国近海海洋气候检测月报数据显示，2023年9月渤海海域月平均海温为21.5~23.0 ℃；黄海海域月平均海温为21.5~26.0 ℃，其中，靠近长岛附近海域平均海温为21.5~23.0 ℃，适宜部分亚历山大藻类繁殖。结合高通量测序结果，本研究中长岛附近海域PSTs存在的产毒藻可能为近缘亚历山大藻、太平洋亚历山大藻、微小亚历山大藻、李氏亚历山大藻等亚历山大属藻类。

此外，本研究还发现浮游植物与贝类PSTs组分存在差异，其中，GTX1/4、GTX2/3、C1/2差异较为显著。研究表明，贝类体内的谷胱甘肽和半胱氨酸等可将氨基甲酸酯类衍生物发生相互转化，Andres等(2019)进行的微小亚历山大藻暴露贻贝实验中发现，GTX1/4经还原反应向GTX2/3转化。Ding等(2017)研究表明，贝类体内的C1/2能够转化为GTX2/3，从而使低毒性的N-磺酰氨甲酰基类毒素转化为高毒性的氨基甲酸酯类毒素。差向异构化是双壳贝类组织中最常见的生物转化。本研究中浮游植物PSTs组分比贝类组分少，未检出β态差向异构体GTX3和α态差向异构体dcGTX2，可能是在贝类体内α与β态差向异构体发生了一定比例的相互转化(Leal et al, 2022)。而毒素组分差异的原因不仅是PSTs在贝类体内发生生物转化，水体中可能存在其他毒素组分，经贝类滤食后进入贝类体内，从而导致贝类PSTs组分与浮游植物中组分的差异(Chen et al, 2023)。

4 总结与展望

本研究通过对2023年6—10月长岛附近海域贝类、浮游植物中PSTs、LSTs和DA的调查，发现LSTs和DA含量、检出率低，污染风险较低。6—10月PSTs含量大体呈上升趋势，其中，9月平均PSTs含量最高，不同品种中栉孔扇贝PSTs含量最高，不同站位中S2采集的浮游植物PSTs含量最高。进一步对浮游植物进行高通量分析后发现，其中可能存在8种亚历山大藻属藻类，9月亚历山大藻属藻类丰度最高，且在9月沉积物样品中发现了亚历山大藻属藻类包囊，结合相关文献(Min et al, 2023; Gao et al, 2015)推测本研究中长岛海域PSTs产毒藻可能为亚历山大藻属藻类。虽然本研究调查的贝类、浮游植物的PSTs、LSTs和DA毒素水平远低于安全限量，但应持续监测毒素的发生情况，以便对长岛近海海域水产养殖区的毒素污染提供早期预警，保障水产品质量安全。