表1(Table 1)
海水循环水养殖作为一种可持续发展的养殖方式，具有节水节地、高产、环保等优势(He et al, 2018、2020)。循环水养殖系统(recirculating aquaculture system, RAS)水处理设备中的生物滤池可通过硝化反应，将养殖动物代谢产生的毒性较高的总氨氮、亚硝酸盐氮(NO2–-N)转化为硝酸盐氮(NO3–-N)(He et al, 2021)。若通过换水控制NO3–-N浓度，不仅消耗大量水资源(Diaz et al, 2012)，而且含有高浓度NO3–-N的养殖尾水排放会危害周边水域环境，造成水体富营养化(Martins et al, 2010)。我国生态环境部明确提出，在2023年，各沿海省份均需根据各自养殖情况出台相应的海水养殖尾水排放标准，以山东省为例，其总氮一级排放标准为4.0 mg/L，二级排放标准为6.0 mg/L。尾水中高浓度NO3–-N成为限制尾水达标排放、制约海水循环水养殖可持续发展的主要因素之一。
生物反硝化是去除NO3–-N的主要途径(Zheng et al, 2020)。但由于海水循环水养殖水体中C/N低(阮赟杰等, 2009)，需额外添加液体碳源(葡萄糖、甲醇) (Tsukuda et al, 2015)、天然植物碳源(稻草、玉米秸秆)(Tan et al, 2010)等有机碳源作为电子供体，驱动反硝化，这不仅会增加成本，而且碳源的添加量难以与波动的NO3–-N浓度相匹配，也增加了对水体二次污染的风险(Tsukuda et al, 2015)。硫自养反硝化(sulfur autotrophic denitrification, SAD)是硫自养菌在厌氧或缺氧条件下，以无机碳(CO2、HCO3–)为碳源，单质硫颗粒(S0)等还原态硫为电子供体，将NO3–-N还原为N2，还原态硫自身被氧化为SO42–的过程(Vo et al, 2021)。S0是目前应用最广泛的SAD电子供体，但属于危险化学品，因此本研究采用复合填料进行探究(王鸿博等, 2024)。SAD过程具有无需添加有机碳源、污泥产量低等优势(Christianson et al, 2015; Zhou et al, 2017)。但SAD反应生成H+ (式1)，降低水体pH，影响反硝化装置长期运行稳定性(Moon et al, 2008)。
| 55 S+20CO2+50NO−3+38H2O+4NH+4→4C5H7O2 N+25 N2+55SO2−4+64H+ | (1) |
SAD装置实际运行过程中，常使用CaCO3 (Di Capua et al, 2015)、石灰石(Kilic et al, 2014; Wang et al, 2023)、牡蛎壳(Simard et al, 2015)等作为填充基质调节水体pH，维持装置脱氮效能，其中，牡蛎壳作为厨房废弃物，便宜、易得，受到了广泛关注(Liang et al, 2018)。牡蛎壳中CaCO3含量约为93%，能够较好地调节水体pH，提供有利于微生物附着的有机基质以及含有大量营养元素促进微生物生长(Liang et al, 2020)。Liang等(2020)将硫粉和牡蛎壳粉以3∶1 (V/V)的比例制成均匀颗粒填充SAD装置处理地表水，最大的NO3–-N去除速率为0.33 kg N/(m3·d)，且pH保持在6.8~7.2之间。Simard等(2015)研究表明，S0/牡蛎壳体积比为3.3∶1，进水NO3–-N为25~30 mg/L，水力停留时间(hydraulic retention time, HRT)为16~19 h时，SAD装置能去除海洋水族馆水体中几乎所有的NO3–-N。He等(2020)研究了海水进水NO3–-N为60 mg/L，S0/牡蛎壳体积比为1.7∶1，HRT分别为24、12和8 h时SAD装置的脱氮性能，结果表明NO3–-N去除速率在84~942 g N/(m3·d)之间，pH保持在7.5~8.2之间，且随着HRT的降低，出水NO3–-N浓度呈线性增加。
不同S0–牡蛎壳配比会对装置内部微环境产生影响，进而改变功能菌的丰度与分布特征。水力负荷(hydraulic loading rate, HLR)是反应装置的重要运行参数(Çakir et al, 2015)。高HLR会提升装置的处理水量，但同时也会降低水体与基质及功能菌的接触时间，导致反硝化效率降低；低HLR会在一定程度上提升反硝化效率，但会减少处理水量。因此，适合的HLR对SAD装置的实际应用至关重要。目前，关于不同S0/牡蛎壳填充比例下SAD装置对海水循环水养殖尾水在不同HLR下的脱氮性能、微生物群落结构的研究鲜有报道。
本研究比较了3个S0/牡蛎壳配比的SAD装置在5个HLR下其处理海水循环水养殖尾水的脱氮性能及进、出水pH和溶解氧的变化，结合微生物群落特征及功能基因预测分析，评估不同S0/牡蛎壳配比对SAD装置脱氮性能的影响，以期为海水循环水养殖尾水SAD装置的设计与运行提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验装置3个SAD装置的本体采用有机玻璃圆形结构，圆柱体直径为14 cm，高30 cm，有效体积为4.7 L。圆柱体下方填充S0/牡蛎壳填料，上方填充火山岩(粒径3~6 mm)至出水口，S0/牡蛎壳填料体积共为4 L，将S0 (粒径2~6 mm)铺设于中间，牡蛎壳(2~6 mm)均匀铺设于S0上方及下方。装置中S0/牡蛎壳体积比分别为5∶1 (R1)、3∶1 (R2)和1∶1 (R3)，对应的孔隙率分别为36.97%、40.53%和48.94% (Kilic et al, 2014)。装置中平均水体温度为(21.71±0.76) ℃，外壁包裹锡纸以排除光照影响，采取上行流运行模式，液面略高于填料，以创造缺氧环境。实验装置具体结构见图 1。
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图 1 实验装置示意图 Fig.1 Schematic diagram of experimental setup |
装置采用活性污泥接种挂膜的方式启动，活性污泥取自山东莱州明波水产有限公司循环水养殖厂排水管。使用人工配制的海水养殖尾水开展实验，将硝酸钠(NaNO3)溶解到过滤海水中，NO3–-N质量浓度为18 mg/L。启动阶段：通过蠕动泵将活性污泥的上清液循环泵入装置中，HRT为48 h，运行8 d进行接种。然后将人工海水泵入装置中，HRT缩短为24 h (Wang et al, 2023)，对菌群进行驯化培养。当出水NO3–-N连续5 d为0 mg/L时，开展正式实验(阮赟杰等, 2009)。
正式实验周期为75 d，根据HRT分别为15、12、9、6和3 h计算HLR，不同HLR分为5个阶段：Ⅰ，HLR=0.19 m3/(m2·d)；Ⅱ，HLR=0.24 m3/(m2·d)；Ⅲ，HLR=0.32 m3/(m2·d)；Ⅳ，HLR=0.48 m3/(m2·d)；Ⅴ，HLR=0.95 m3/(m2·d)，每个HLR下运行15 d。每24 h测进、出水水温、pH，每个阶段测3次溶解氧(DO)。每24 h取进、出水桶水样，水样经0.45 μm滤膜过滤后测定NO3–-N、NO2–-N和氨氮(NH4+-N)。3个SAD装置运行稳定后，正式实验前于装置上部(牡蛎壳与S0填料)交接处、中部(S0填料)、底部(S0与牡蛎壳填料)交接处取填料表面生物膜，使用0.22 μm孔径的过滤膜过滤，取过滤膜贮存于–80 ℃冰箱。
1.3 分析方法温度、pH采用YSI便携式多参数水质分析仪(Multi 3630 IDS，德国WTW公司)测定；DO采用光纤氧气测量仪(FireStingO2，德国Pyroscience公司)测定；NO3–-N、NO2–-N和NH4+-N使用Skalar连续流动分析仪(SA5000，荷兰)测定；总无机氮(TIN)为三氮之和。使用Microsoft Excel软件进行数据处理，实验所得数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 26.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05表示差异显著。使用Qiime软件计算α多样性指数，使用PICRUSt2功能预测分析与KEGG基因数据库预测和注释氮代谢相关酶的功能基因，使用TBtools绘制氮代谢基因热图，微生物群落结构分析在上海美吉生物医药科技有限公司云平台完成(www.majorbio. com)。
2 结果 2.1 氮变化情况 2.1.1 NO3–-N去除情况3个装置进、出水NO3–-N浓度如图 2a所示。HLR改变时，装置运行前2 d脱氮性能出现波动，因此，本研究采用每阶段运行稳定期(后13 d)数据分析装置的反硝化性能。实验期间，R1、R2和R3的NO3–-N平均去除率分别为(68.88± 11.24)%、(68.61±13.07)%和(65.71±15.75)%(P > 0.05)，NO3–-N平均去除负荷分别为(19.36±11.64)、(18.90± 10.63)和(16.83±7.34) mg N/(m3·d) (P > 0.05)。
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图 2 NO3–-N去除情况 Fig.2 NO3–-N removal situation R1、R2和R3的S0/牡蛎壳体积比分别为5∶ 1、3∶ 1和1∶ 1。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ阶段的水力负荷(HLR)分别为0.19、0.24、0.32、0.48和0.95 m3/(m2·d)。不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。下同。 R1, R2 and R3: S0/oyster shell is 5∶ 1, 3∶ 1 and 1∶ 1, respectively. The HLR of phaseⅠ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴis 0.19, 0.24, 0.32, 0.48 and 0.95 m3/(m2·d), respectively. Different letters represent significant difference (P<0.05). The same below. |
如图 2b和2c所示，Ⅰ~Ⅳ阶段(除第Ⅲ阶段)，同一HLR下不同SAD装置之间及同一装置在不同HLR下的NO3–-N去除率均无显著差异，R1、R2和R3的去除率分别为(72.11±12.64)%~(75.85±7.95)%、(76.00±6.91)%~(78.13±6.45)%、(70.40±7.78)%~(75.76± 8.98)%。当HLR继续提升至第Ⅴ阶段时，R1、R2和R3的NO3–-N去除率均显著降低，分别为(61.16± 9.31)%、(56.62±7.23)%和(38.98±10.19)%，且R3的NO3–-N去除率显著低于R1和R2 (P < 0.05)。如图 2d和2e所示，除第Ⅲ阶段外，Ⅰ~Ⅳ阶段，R1、R2和R3间NO3–-N去除负荷无显著差异。Ⅰ~Ⅴ阶段，随着HLR升高，R1和R2的NO3–-N去除负荷显著升高，分别达(39.10±6.18)和(36.19±4.66) mg N/(m3·d) (P < 0.05)。R3的NO3–-N去除负荷在Ⅰ~Ⅳ阶段显著升高，达(24.24±1.87) mg N/(m3·d)；而第Ⅴ阶段，R3的NO3–-N去除负荷无显著升高，维持在(24.94±6.63) mg N/(m3·d)，并且显著低于R1和R2 (P < 0.05)。
2.1.2 NO2–-N和NH4+-N产生情况3个装置出水NO2–-N与NH4+-N浓度变化如图 3a和3b所示。实验期间，R1、R2和R3出水平均NO2–-N浓度分别为(0.79±0.46)、(0.59±0.39)和(0.86±0.43) mg/L，R2出水平均NO2–-N浓度最低(P < 0.05)；出水平均NH4+-N浓度分别为(0.17±0.07)、(0.18±0.07)和(0.19±0.11) mg/L，3个装置间无显著差异(P > 0.05)。
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图 3 NO2–-N和NH4+-N产生情况 Fig.3 Production of NO2–-N and NH4+-N |
NO2–-N是SAD反应的中间产物(He et al, 2020)。如图 3c所示，3个装置出水NO2–-N浓度在第Ⅱ阶段均较高，分别为(1.33±0.15)、(1.28±0.22)和(1.33± 0.30) mg/L (P > 0.05)。随着实验开展至第Ⅴ阶段，R2出水NO2–-N浓度较低且趋于稳定，而R3在第Ⅴ阶段出水NO2–-N浓度升高，为(0.85±0.08) mg/L (P < 0.05)。
3个装置的出水中均有NH4+-N，表明SAD装置中存在硝酸盐异化还原为氨(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)的过程(Wang et al, 2023)。如图 3d所示，在第Ⅴ阶段，即最高HLR下，3个装置的出水NH4+-N浓度均有所降低，可能是高的HLR对DNRA过程有抑制作用(Wang et al, 2023)。
2.1.3 TIN去除情况3个装置进、出水TIN浓度如图 4a所示，实验期间，3个装置TIN平均去除率分别为(63.81±11.14)%、(64.49±12.47)%和(60.19±15.91)% (P > 0.05)，TIN平均去除负荷分别为(18.07±11.20)、(17.90±10.32)和(15.38±6.94) mg N/(m3·d) (P > 0.05)。
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图 4 TIN去除情况 Fig.4 TIN removal situation |
实验期间，SAD对TIN和NO3–-N的去除呈类似趋势。如图 4b和4c所示，除第Ⅲ阶段外，Ⅰ~Ⅳ阶段，R1、R2和R3间TIN去除率差异均不显著，分别达(68.94±7.25)%、(74.81±6.64)%和(72.08±5.53)% (P > 0.05)。当HLR继续提升至第Ⅴ阶段时，R1、R2和R3的TIN去除率均显著降低，分别为(58.09±9.55)%、(54.09±7.28)%和(34.07±10.65)%，且R3的TIN去除率显著低于R1和R2 (P < 0.05)。如图 4d和4e所示，除第Ⅲ阶段外，Ⅰ~Ⅳ阶段，R1、R2和R3间TIN去除负荷无显著差异。Ⅰ~Ⅴ阶段，随着HLR升高，R1和R2的TIN去除负荷显著升高，分别达(37.15±6.36)和(34.57±4.69) mg N/(m3·d) (P < 0.05)。R3的TIN去除负荷在Ⅰ~Ⅳ阶段显著升高，达(23.29±1.94) mg N/(m3·d)；而在第Ⅴ阶段TIN去除负荷无显著升高，为(21.79± 6.89) mg N/(m3·d)，并且显著低于R1和R2。
2.2 DO和pH变化情况装置进、出水DO和pH变化情况如表 1所示。实验期间，3个装置的出水DO显著低于进水，装置间的出水DO无显著差异。3个装置的出水pH显著低于进水，R1和R2的出水pH低于R3 (P < 0.05)。如图 5所示，随着HLR提升，装置的出水pH降低。
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表 1 各实验组进、出水DO和pH均值变化情况 Tab.1 Changes in mean values of DO and pH of inlet and outlet water in each experimental group |
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图 5 各实验组在不同HLR下出水pH变化情况 Fig.5 Change of effluent pH of each experimental group under different HLRs |
各实验组的α多样性指数如表 2所示，不同装置及同一装置不同取样位置的细菌α多样性存在差异。通过Chao指数分析发现，相比于上部基质交接处和中部，3个装置底部基质交接处的物种丰富度最高。通过Shannon指数分析发现，3个装置中部，即S0填料表面的物种多样性最低，SAD装置上部以及底部基质交接处的物种多样性较高。
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表 2 各实验组α多样性指数 Tab.2 α diversity index in each experimental group |
在各实验组中主要检测到8个菌门，如图 6a所示，分别为弯曲杆菌门(Campilobacterota, 6.47%~59.73%)、变形菌门(Proteobacteria, 16.46%~53.93%)、髌骨细菌门(Patescibacteria, 5.76%~28.75%)、拟杆菌门(Bacteroidota, 3.04%~17.35%)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota, 1.71%~ 8.69%)、厚壁菌门(Firmicutes, 0.34%~4.05%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 0.41%~2.97%)和浮霉菌门(Planctomycetota, 0.08%~2.07%)。SAD装置中弯曲杆菌门丰度最高。大多数弯曲杆菌参与反硝化过程(Jin et al, 2023)。R1、R2和R3中部弯曲杆菌门丰度最高，分别为54.03%、59.73%和51.12%。变形菌门和拟杆菌门丰度分别位于第2和第4。这2个菌门中包含许多反硝化菌，且在水产养殖系统菌群中占据主导地位(Chen et al, 2023; Zhang et al, 2022)。脱硫杆菌门在SAD过程中具有重要作用(Wei et al, 2023; Liu et al, 2023)。R1、R2和R3中平均丰度分别为5.06%、5.53%和6.13%。厚壁菌门在SAD装置处理水体过程中占据重要地位(Zhou et al, 2023)。R1、R2和R3中平均丰度分别为1.92%、1.33%和0.54%。
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图 6 门水平细菌群落结构(a)、主成分分析(PCA)(b)、属水平细菌群落结构(c)、功能基因热图(d)、Mantel检验(e)和Pearson相关性分析 Fig.6 Phylum level bacterial community structure (a), Principal Component Analysis (PCA) at the genus level (b), Genus level bacterial community structure (c), Functional gene heatmap (d), Mantel test and Pearson correlation analysis (e) |
如图 6b所示，在属水平上使用主成分(PCA)分析比较各反应装置中细菌群落的差异，2个主坐标贡献率分别为27.29% (PC1)和18.44% (PC2)，3个实验组间菌群差异不显著(P=0.728)。同一装置中不同位置的菌属存在较大差异；3个装置中部，即S0填料上的菌属差异较小。
为了进一步揭示装置中的功能细菌，本研究分析了属水平上的细菌群落组成。如图 6c所示，丰度排名前10的菌属为硫单胞菌属(Sulfurimonas, 2.70%~ 49.50%)、α变形菌(Alphaproteobacteria, 2.01%~ 10.52%)、硫卵菌属(Sulfurovum, 1.58%~12.81%)、聚集杆菌属(Sedimenticola, 1.79%~10.55%)、脱硫藻属(Desulfocapsa, 1.04%~6.81%)、白杆菌属(Albirhodobacter, 0.24%~5.54%)等。硫单胞菌属属于弯曲杆菌门，参与硫自养反硝化反应，其高丰度可以作为SAD装置菌群挂膜成熟的指标(Wang et al, 2023)。R1、R2和R3中部的硫单胞菌属丰度最高，分别为42.30%、49.50%和46.61%。硫卵菌属是以S0等还原态硫为电子供体的ε变形杆菌(Kilic et al, 2014)。聚集杆菌属具有氧化S0等还原态硫的化学自养能力(Slobodkina et al, 2023)。脱硫藻属与无机硫化物的歧化有关，可以通过S0进行富集(Song et al, 2020)。白杆菌属属于红杆菌科(Rubrobacteraceae)，是需氧或兼性厌氧的化学自养菌(Foesel et al, 2011)。
2.3.3 功能基因预测及分析根据基因丰度绘制热图，如图 6d所示，在3个装置中发现了2种潜在的氮代谢途径，其功能基因的相对丰度从高到低依次为：将NO3–-N还原为N2的SAD过程(包括将NO3–-N还原为NO2–-N，NO2–-N还原为NO，NO还原为N2O，N2O还原为N2的过程)，包括narGHI、napAB、nirKS、norBC和nosZ功能基因；将NO3–-N还原为NH4+-N的DNRA过程，包括nirBD、nrfAH功能基因。
如图 6e所示，对属水平菌群、环境因子和氮代谢功能基因之间进行相关性分析，通过Mantel检验表示其相关性，线条宽度对应Mantel´s r统计量；颜色梯度表示其Spearman相关系数。硫单胞菌、α变形菌、硫卵菌、白杆菌与napAB基因存在相关性(P < 0.05)；聚集杆菌与narGHI基因存在相关性(P < 0.05)。硫卵菌与nirKS基因有相关性(P < 0.05)；α变形菌、白杆菌与nirS基因存在相关性(P < 0.05)(Xing et al, 2022)。α变形菌、聚集杆菌、脱硫藻、白杆菌与nirBD基因存在相关性(P < 0.05)。属水平菌群丰度与环境因子无显著相关性(P > 0.05)。pH与装置出水NO3–-N、TIN和NH4+-N浓度呈正相关，可归因为R3出水的pH最高，但R3的脱氮性能最差，出水NH4+-N最高。pH与narGHI、nirS、norC、nosZ和nirBD基因丰度呈正相关，与nirK基因丰度呈负相关。
3 讨论 3.1 硫自养反硝化性能第Ⅲ阶段，3个装置的NO3–-N去除率均显著降低(P < 0.05)，主要是由于该阶段开始时出水NO3–-N浓度波动较大导致，考虑其对本研究比较不同S0/牡蛎壳配比装置性能并无影响，具体原因将在后续研究中深入探讨。
S0/牡蛎壳为5∶1和3∶1装置的脱氮性能优于S0/牡蛎壳=1∶1。3个装置出水NO2–-N浓度在第Ⅱ阶段均较高，可能是前期装置脱氮性能不稳定，NO2–-N还原为N2的速率低于NO3–-N还原为NO2–-N的速率，造成NO2–-N累积(史航等, 2022)。本研究在HLR为0.19~0.48 m3/(m2·d)时，不同S0/牡蛎壳配比的装置间NO3–-N与TIN的去除率和去除负荷无显著差异，可能是电子供体S0过量的原因，水体pH均在SAD合适的范围内，即进水NO3–-N负荷为(12.83±0.25)~ (32.36±0.70) mg N/(m3·d)时，装置中S0/牡蛎壳配比在5∶1、3∶1和1∶1之间变化不会影响脱氮性能。Sahinkaya等(2014)研究表明，厌氧条件下进水NO3–-N负荷低于0.24 g N/(m3·d)，不同S0/石灰石配比的SAD装置反硝化性能无明显差异；类似的，Kilic等(2014)研究表明，进水NO3–-N负荷低于0.4 g N/(m3·d)，装置中S0/石灰石配比在1∶1、2∶1和3∶1间变化不影响其反硝化性能。不同S0/牡蛎壳配比的SAD装置脱氮时具有相似的现象。当HLR提升至0.95 m3/(m2·d)时，随进水NO3–-N负荷继续升高，3个SAD装置的NO3–-N去除负荷升高，但平均NO3–-N去除率显著下降，可能是过高的HLR导致水体与基质接触时间过短，导致反应时间不足(Liang et al, 2020)。S0/牡蛎壳=1∶1装置的S0的体积比最小，考虑到S0的有限溶解速率，该装置的脱氮性能在HLR持续升高时最先受到影响，反硝化无法反应完全，可能导致了装置出水NO2–-N浓度最高，从而导致其平均NO3–-N去除率和去除负荷显著下降。因此，S0/牡蛎壳为5∶1和3∶1装置的反硝化性能优于S0/牡蛎壳=1∶1。Kilic等(2014)研究同样发现，在低HRT或高NO3–-N负荷下，S0/石灰石为3∶1装置的反硝化性能优于S0/石灰石=1∶1和2∶1的装置。因此，SAD装置用于海水养殖尾水处理时应优先考虑增大装置中S0的体积比，以满足高HLR下运行高脱氮性能的需求(Liang et al, 2022)。
3.2 DO和pH的影响本研究中装置出水DO低于进水，可能是装置中的菌对O2的消耗(He et al, 2018)；但出水DO浓度无显著差异且均大于3 mg/L。Wang等(2023)研究建议将SAD装置中的DO保持在2.0 mg/L以下。Zhang等(2022)研究表明，进水中DO的存在会影响SAD装置的反硝化性能，抑制NO2–-N还原酶的活性。本研究的进、出水溶氧过高，这解释了SAD装置脱氮性能低于类似研究的原因。后续可通过控制海水循环水养殖尾水中的DO，探究不同S0/牡蛎壳配比的SAD装置最佳的反硝化性能。
SAD过程产酸，随着进水NO3–-N负荷增加，装置出水pH下降，但本研究中水体pH均在硫自养菌适宜的范围内。随S0/牡蛎壳比例升高，装置出水pH降低，表明牡蛎壳能够调节水体pH (Zheng et al, 2020)。随着HLR升高，装置出水pH均降低，因为随着平均NO3–-N去除负荷提升，SAD反应产生了更多的酸，但牡蛎壳溶解的速率并未发生改变(Sahinkaya et al, 2014)。因此，在高HLR运行条件下，可增大牡蛎壳的体积比以满足pH稳定的需求。
3.3 微生物群落特征α多样性结果与前人研究一致。基质的交接处更有利于多种菌的生长。Wang等(2019)研究表明，SAD装置底部交接处微生物数量最多。Tong等(2017)研究表明，相比于S0，牡蛎壳上的物种多样性较高。单一富足S0的底物条件更利于硫自养菌占据主导(Christianson et al, 2015)。S0和牡蛎壳的不同配比对装置中部S0上的菌群结构影响不大(Kilic et al, 2014)，可能会影响菌群的丰度。SAD装置中主要功能菌为硫自养菌，其具有完整的反硝化功能基因。硫单胞菌属在SAD装置中属水平上的平均丰度最高。随S0/牡蛎壳比例下降，装置内以及装置上部交接处的硫单胞菌属丰度上升，可能是随S0体积的减少，装置的反硝化效率降低，当进水自下而上流到装置上部交接处时，水体中NO3–-N浓度变高，硫单胞菌属丰度因底物浓度升高而随之上升。Wang等(2019)研究表明，硫单胞菌属丰度与较高浓度的NO3–-N正相关。R2中的变形菌门和α变形菌平均丰度最高，装置中部弯曲杆菌门和硫单胞菌属丰度最高，可能是导致实验第Ⅰ阶段R2的NO3–-N和TIN去除率较高的原因。Wang等(2019)研究表明，装置中硫自养菌越多，反硝化速率越快。
Mantel检验表明，硫单胞菌属与napAB基因显著相关，可能是硫单胞菌属只参与了SAD中的NO3–-N还原为NO2–-N这一步反应(Huang et al, 2021)。R3中napAB基因丰度最高与R3中的硫单胞菌属丰度最高相一致。脱硫藻属只与nirBD基因存在相关性，可能只参与了DNRA反应，因此，随着S0/牡蛎壳的比例下降，装置中脱硫藻属的平均丰度升高与装置出水NH4+-N逐渐上升的趋势相一致。随S0/牡蛎壳的比例下降，装置中nirS基因丰度上升，nirK基因丰度下降。Xing等(2022)研究表明，nirS和nirK这2个基因对环境因子会表现出不同的生态响应，且nirS基因对脱氮性能的贡献更大。因此，除了nirK基因，本研究中pH与所有反硝化基因丰度呈正相关，表明装置出水pH越高，越有利于反硝化反应的进行。杨文焕等(2023)研究也表明，pH是影响氮代谢路径基因丰度的主要影响因子，pH值与反硝化基因和绝大多数DNRA基因呈显著正相关。
4 结论HLR为0.95 m3/m2·d时，S0/牡蛎壳为5∶1和3∶1装置的NO3–-N去除性能显著优于S0/牡蛎壳=1∶1的装置。装置的出水pH随S0/牡蛎壳比例和HLR的升高而降低。SAD装置中优势菌门为弯曲杆菌门(6.47%~ 59.73%)，优势菌属为硫单胞菌属(2.70%~49.50%)。随着S0/牡蛎壳的比例下降，装置内及装置上部牡蛎壳和S0交接处硫单胞菌属丰度上升。pH与反硝化基因丰度呈正相关。
ÇAKIR R, GIDIRISLIOGLU A, ÇEBI U. A study on the effects of different hydraulic loading rates (HLR) on pollutant removal efficiency of subsurface horizontal-flow constructed wetlands used for treatment of domestic wastewaters. Journal of Environmental Management, 2015, 164: 121-128 |
CHEN S J, SUN X Q, TIAN X L, et al. Influence of ammonia nitrogen management strategies on microbial communities in biofloc-based aquaculture systems. Science of the Total Environment, 2023, 903: 166159 DOI:10.1016/j.scitotenv.2023.166159 |
CHRISTIANSON L, LEPINE C, TSUKUDA S, et al. Nitrate removal effectiveness of fluidized sulfur-based autotrophic denitrification biofilters for recirculating aquaculture systems. Aquacultural Engineering, 2015, 68: 10-18 DOI:10.1016/j.aquaeng.2015.07.002 |
DI CAPUA F, PAPIRIO S, LENS P N L, et al. Chemolithotrophic denitrification in biofilm reactors. Chemical Engineering Journal, 2015, 280: 643-657 DOI:10.1016/j.cej.2015.05.131 |
DIAZ V, IBANEZ R, GOMEZ P, et al. Kinetics of nitrogen compounds in a commercial marine recirculating aquaculture system. Aquacultural Engineering, 2012, 50: 20-27 DOI:10.1016/j.aquaeng.2012.03.004 |
FOESEL B U, DRAKE H L, SCHRAMM A. Defluviimonas denitrificans gen. nov., sp nov., and Pararhodobacter aggregans gen. nov., sp nov., non-phototrophic Rhodobacteraceae from the biofilter of a marine aquaculture. Systematic and Applied Microbiology, 2011, 34: 498-502 DOI:10.1016/j.syapm.2011.08.006 |
HE Q C, CHENG Z, ZHANG D Q, et al. A sulfur-based cyclic denitrification filter for marine recirculating aquaculture systems. Bioresource Technology, 2020, 310: 123465 DOI:10.1016/j.biortech.2020.123465 |
HE Q C, DASI E A, CHENG Z, et al. Wood and sulfur-based cyclic denitrification filters for treatment of saline wastewaters. Bioresource Technology, 2021, 328: 124848 DOI:10.1016/j.biortech.2021.124848 |
HE Q C, ZHANG D Q, MAIN K, et al. Biological denitrification in marine aquaculture systems: A multiple electron donor microcosm study. Bioresource Technology, 2018, 263: 340-349 DOI:10.1016/j.biortech.2018.05.018 |
HUANG S, YU D S, CHEN G H, et al. Realization of nitrite accumulation in a sulfide-driven autotrophic denitrification process: Simultaneous nitrate and sulfur removal. Chemosphere, 2021, 278: 130413 DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.130413 |
JIN C H, TANG Q, GAO Y B, et al. Nitrogen removal from low-C/N-ratio wastewater using a three-dimensional bioelectrical reactor. Journal of Water Process Engineering, 2023, 53: 103835 DOI:10.1016/j.jwpe.2023.103835 |
KILIC A, SAHINKAYA E, CINAR O. Kinetics of autotrophic denitrification process and the impact of sulphur/limestone ratio on the process performance. Environmental Technology, 2014, 35: 2796-2804 DOI:10.1080/09593330.2014.922127 |
LIANG B R, CHANG M D, ZHANG K, et al. Investigation of different solid carbonate additives in elemental-sulfur- based autotrophic denitrification process coupled with anammox process. Environmental Technology & Innovation, 2020, 20: 101149 |
LIANG B R, KANG F, WANG Y, et al. Denitrification performance of sulfur-based autotrophic denitrification and biomass-sulfur-based mixotrophic denitrification in solid- phase denitrifying reactors using novel composite filters. Science of the Total Environment, 2022, 823: 153826 DOI:10.1016/j.scitotenv.2022.153826 |
LIANG J, CHEN N, TONG S, et al. Sulfur autotrophic denitrification (SAD) driven by homogeneous composite particles containing CaCO3-type kitchen waste for groundwater remediation. Chemosphere, 2018, 212: 954-963 DOI:10.1016/j.chemosphere.2018.08.161 |
LIU F F, ZHANG Y X, LU T. Performance and mechanism of constructed wetland-microbial fuel cell systems in treating mariculture wastewater contaminated with antibiotics. Process Safety and Environmental Protection, 2023, 169: 293-303 DOI:10.1016/j.psep.2022.11.022 |
MARTINS C I M, EDING E H, VERDEGEM M C J, et al. New developments in recirculating aquaculture systems in Europe: A perspective on environmental sustainability. Aquacultural Engineering, 2010, 43: 83-93 |
MOON H S, SHIN D Y, NAM K, et al. A long-term performance test on an autotrophic denitrification column for application as a permeable reactive barrier. Chemosphere, 2008, 73: 723-728 |
RUAN Y J, TAN H X, LUO G Z, et al. Nitrate removal and kinetic model of saline water by sulfur-based autotrophic denitrification. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2009, 25(2): 167-172 [阮赟杰, 谭洪新, 罗国芝, 等. 硫自养反硝化对含盐水体脱氮及其动力学模型. 农业工程学报, 2009, 25(2): 167-172] |
SAHINKAYA E, KILIC A, DUYGULU B. Pilot and full scale applications of sulfur-based autotrophic denitrification process for nitrate removal from activated sludge process effluent. Water Research, 2014, 60: 210-217 |
SHI H, LONG T Y, LIU C, et al. Deep nitrogen removal from urban wastewater by ceramsite-sulfur mixed biological fillers based on heterotrophy-sulfur autotrophic denitrification coupling technology. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2022, 16(4): 1363-1372 [史航, 隆添翼, 柳聪, 等. 基于异养–硫自养反硝化耦合技术的陶粒–硫磺混合生物填料对城市污水处理厂尾水的深度脱氮. 环境工程学报, 2022, 16(4): 1363-1372] |
SIMARD M C, MASSON S, MERCIER G, et al. Autotrophic denitrification using elemental sulfur to remove nitrate from saline aquarium waters. Journal of Environmental Engineering, 2015, 141(12): 1-10 |
SLOBODKINA G, MERKEL A, RATNIKOVA N, et al. Sedimenticola hydrogenitrophicus sp. nov. a chemolithoautotrophic bacterium isolated from a terrestrial mud volcano, and proposal of Sedimenticolaceae fam. nov. in the order Chromatiales. Systematic and Applied Microbiology, 2023, 46(5): 126451 |
SONG Y Y, LI H B, HAN Y, et al. Landfill leachate as an additional substance in the Johannesburg-Sulfur autotrophic denitrification system in the treatment of municipal wastewater with low strength and low COD/TN ratio. Bioresource Technology, 2020, 295: 122287 |
TAN H, LAI C, LUO G, et al. Using biodegradable polymers as carbon source for nitrate removal in marine re-circulated aquaculture systems. Marine Sciences, 2010, 34: 22-27 |
TONG S, RODRIGUEZ-GONZALEZ L C, FENG C P, et al. Comparison of particulate pyrite autotrophic denitrification (PPAD) and sulfur oxidizing denitrification (SOD) for treatment of nitrified wastewater. Water Science and Technology, 2017, 75: 239-246 |
TSUKUDA S, CHRISTIANSON L, KOLB A, et al. Heterotrophic denitrification of aquaculture effluent using fluidized sand biofilters. Aquacultural Engineering, 2015, 64: 49-59 |
VO T K Q, KANG S, AN S A, et al. Exploring critical factors influencing on autotrophic denitrification by elemental sulfur-based carriers in upflow packed-bed bioreactors. Journal of Water Process Engineering, 2021, 40: 101866 |
WANG H B, ZHENG X Y, WANG W, et al. Study on the denitrification performance of the secondary sink water of the urban sewage treatment plant based on the sulfur autotrophic denitrification filler. Technology of Water Treatment, 2024, 50(9): 91-97 [王鸿博, 郑晓英, 王慰, 等. 基于硫自养反硝化填料对城市污水厂二沉水的脱氮性能研究. 水处理技术, 2024, 50(9): 91-97] |
WANG L, LIU J, LI Y, et al. Elemental sulfur-driven autotrophic denitrification process for effective removal of nitrate in mariculture wastewater: Performance, kinetics and microbial community. Chemosphere, 2023, 337: 139354 |
WANG W, WEI D Y, LI F C, et al. Sulfur-siderite autotrophic denitrification system for simultaneous nitrate and phosphate removal: From feasibility to pilot experiments. Water Research, 2019, 160: 52-59 |
WEI Z P, XU Y F, SHI Y Y, et al. The response mechanism of microorganisms to the organic carbon-driven formation of black and odorous water. Environmental Research, 2023, 231(3): 116255 |
XING S Y, WEN C Z, YUAN L B, et al. Diversity and community composition of nirS-type denitrifying bacteria and ammonia-oxidizing archaea in biofilm samples attached to bio-substrate and abio-substrates in integrated ecological floating bed systems. Ecological Engineering, 2022, 180: 106641 |
YANG W H, ZHEN Y, YAO Z, et al. Characterization for nitrogen metabolism of sediments in highland saline lake. China Environmental Science, 2023, 43(3): 1328-1339 [杨文焕, 甄玉, 姚植, 等. 高原盐化湖泊沉积物氮代谢特征解析. 中国环境科学, 2023, 43(3): 1328-1339] |
ZHANG X N, ZHU L, LI Z R, et al. Thiosulfate as external electron donor accelerating denitrification at low temperature condition in S0-based autotrophic denitrification biofilter. Environmental Research, 2022, 210: 113009 |
ZHENG S, LIU H, PENG J, et al. Biological nitrogen removal performance of heterotrophic-autotrophic coupling deep denitrification system. Research of Environmental Sciences, 2020, 33: 385-391 |
ZHOU L J, LAI Y Z, SHAO Z Y, et al. Keystone bacteria in a thiosulfate-driven autotrophic denitrification microbial community. Chemical Engineering Journal, 2023, 470: 144321 |
ZHOU W L, LI Y, LIU X, et al. Comparison of microbial communities in different sulfur-based autotrophic denitrification reactors. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101: 447-453 |