表1(Table 1)
2. 天津农学院 天津市水产生态及养殖重点实验室 天津 300384;
3. 农业农村部珠江流域渔业生态环境监测中心 广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室 广东 广州 510380;
4. 国家渔业资源环境广州观测实验站 广东 广州 510380
2. Tianjin Agricultural University, Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China;
3. Fishery Ecological Environment Monitoring Center of Pearl River Basin, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Immunology and Sustainable Aquaculture, Guangzhou 510380, China;
4. National Agricultural Scientific Observing and Experimental Station for Fisheries Resources and Environment, Guangzhou 510380, China
池塘养殖是我国传统的水产养殖方式，近年来，我国的水产养殖进入到一个以高密度、集约化池塘养殖模式为主的快速发展阶段(金渝钦等, 2023)。然而，现阶段的池塘养殖模式为追求产量和经济效益，大量的饲料、肥料和药物投入以及养殖鱼类代谢沉积，导致水体中的无机氮浓度通常处于较高水平，养殖生态环境恶化(莽琦等, 2022)。因此，开展池塘养殖环境调控技术模式研究是我国池塘渔业发展的重要方向。生物絮团技术(biofloc technology, BFT)调控养殖池塘水质是近年来应用较为广泛的新兴技术，是指在养殖过程中无换水的基础上，通过添加有机碳调节养殖水体中的碳氮比，促进水体中异养细菌大量繁殖(Kumar et al, 2024)，而异养细菌可将养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害物质转化为可被养殖生物直接利用的生物絮凝颗粒，从而达到降低水体含氮类营养盐浓度、改善养殖水质的目的(Faizullah et al, 2019)。以色列水产养殖专家Avnimelech (1999)首次系统阐述了添加碳源技术，形成了生物絮团技术在水产养殖中应用的理论基础。添加碳源对水产养殖的核心在于微生物同化无机氮，实现对氨氮、亚硝酸盐的快速异养转化，减少养殖水体中有毒有害物质的积累(Raza et al, 2024)，同时实现营养物质的再次循环利用，提高饲料利用率，减少换水量，提高养殖鱼类成活率(李乐康等, 2015)。目前，多国的水产研究机构均对添加碳源和生物絮团技术进行了诸多研究，并在虾类和鱼类养殖中取得了一定成效(Yu et al, 2023)。
细菌在生物絮团介导的有机物分解、氮磷等营养元素转化、养殖生物饵料供给等过程中，发挥着重要的功能(Padeniya et al, 2022)。因此，对养殖池塘水质及细菌群落的研究，不仅可以了解养殖环境给养殖生物带来的潜在风险，也是促进养殖生物与池塘环境和谐发展的关键环节(张旭等, 2024)。近年来，国内外学者针对添加碳源对养殖池塘水质及细菌群落演变这一前沿热点课题已开展众多研究。在罗非鱼(Tilapia) (Khanjani et al, 2022)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus) (Tayyab et al, 2023)、福瑞鲤(Cyprinus carpio var. Furui) (刘艳辉等, 2021)和凡纳对虾(Penaeus vannamei) (廖栩峥等, 2020)等养殖水体中，添加碳源均可显著降低池塘水体中过高的氨氮，并对降低亚硝酸盐和化学需氧量也具有一定作用。Crab等(2009)和夏耘等(2012)采用PCR-DGGE技术分别研究了应用添加碳源及生物絮团技术的罗非鱼杂交种(Oreochromis niloticus × Oreochromis aureus)和草鱼养殖系统中的细菌群落结构，表明α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Baccilli)和拟杆菌纲(Bacteroidetes)是其中的优势类群。Wei等(2016)和Panigrahi等(2018)比较探究了添加不同种类碳源及不同碳氮比(C/N)的生物絮团对细菌群落的影响，发现细菌多样性及群落组成具有显著区别，说明添加碳源的种类和性质对水体细菌群落具有显著影响。
大口黑鲈(Micropterus salmoides)隶属于鲈形目(Perciformes)，俗称加州鲈，原产于北美洲，属于典型的淡水肉食性经济鱼类，由于其生长速度快、对环境的适应性强、味道鲜美、无肌间刺等优点，深受市场青睐。目前，在我国大口黑鲈养殖生产中，由于残饵及其排泄物得不到及时分解，水体中的氮经常处于高水平(王珂珂等, 2021)。近年来，对大口黑鲈养殖的研究多集中在饲料配比(江坤生等, 2023; 王凯等, 2024)、病害防治(李顺等, 2023)和养殖模式(逯冠政等, 2022; 李素芳等, 2024)等方面，对于利用添加碳源技术改善大口黑鲈养殖池塘水质的相关研究则鲜有报道。因此，本研究通过开展大口黑鲈养殖池塘受控实验，对比研究添加不同种类碳源对大口黑鲈养殖过程中水质及细菌群落结构和功能的影响，以期实现为大口黑鲈高效养殖池塘的构建提供一定的理论参考依据。
1 材料与方法 1.1 采样地点与养殖情况本研究实验池塘为中国水产科学研究院珠江水产研究所芳村养殖基地内8个室外养殖池塘(单个面积约200 m2)。干塘后使用生石灰泼洒池壁池底，浸泡后，再用花地河自然河水冲洗干净，注入花地河河水待用。本实验选用养殖生物为大口黑鲈。试水鱼在池塘内1 h无异常现象之后，再大批量布鱼。苗种下池前用2%~4%的食盐水浸洗鱼体5 min，称重后随机分放，每池约200尾鱼，平均体重约为100 g。
本研究为对比分析2种水产养殖产业中常用碳源材料对大口黑鲈养殖水体水质及细菌群落结构和功能的影响，分别选用特种碳源“菌来”和缓释碳源“PHB”为外加碳源(2种碳源均由广州先得生物科技有限公司研发并提供)。其中，特种碳源“菌来”为多糖类食品原料的发酵产物，富含高生物活性有机碳、有机酸、酶等物质，对促进益生菌生长繁殖、抑制有害细菌、促进生物絮团形成具有显著效果。缓释碳源“PHB”主要成分为聚-β-羟基丁酸酯，是由细菌合成的一种酯类天然产物，可对养殖生物的肠道微生物和免疫基因产生显著影响，亦可作为媒介促进水体中的细菌形成生物絮团(吴霞等, 2021)。特种碳源“菌来”为白色粉末，易溶于水；缓释碳源“PHB”为由人工合成高分子材料包裹的白色米粒状结晶颗粒，不溶于水，在水体中碳源缓慢溶出。
按照产品说明书，实验前2周(第1~2周)每周向特种碳源和缓释碳源组每个池塘分别添加300 g “菌来”和300 g “PHB”，实验中期(第3~4周)每周向特种碳源和缓释碳源组每个池塘分别添加600 g “菌来”和600 g “PHB”，实验后2周(第5~6周)每周向特种碳源和缓释碳源组每个池塘分别添加900 g “菌来”和900 g “PHB”，实验期间2种碳源添加量相同。添加碳源受控实验从2023年10月开始，实验周期为6周。每日09:00投喂饲料，每次30 min左右，至鱼不再摄食并游开为止。
碳源添加方法：将特种碳源“菌来”和缓释碳源“PHB”分别用池塘水稀释搅匀后全池均匀泼洒，添加时开启增氧机。每周添加1次，连续添加6周。每周一09:00采集池塘水样后，将事先称重的碳源粉末用池水混匀，全池泼洒。其中，A、B两个池塘为对照组，不另加碳源；C、E、G三个池塘为添加特种碳源组(实验T组)；D、F、H三个池塘为添加缓释碳源组(实验H组)。每次在添加碳源前取离水面约0.5 m深处的水样并测定水质指标，同时监测池塘水体总菌落数(bacterial abundance, BA)、生物絮团沉积量(bioflocs volume, BFV)等参数。在培养初始时(第1周)、培养中期(第3周)和培养结束时(第6周)采集细菌群落结构样品。
1.2 样品采集与测定水质指标：实验期间，每周测定水体理化指标一次。水温(water temperature, WT)、盐度(salinity, Sal)、电导率(conductivity, Cond)、总溶解固体(total dissolved solids, TDS)、氧化还原电位(oxidation-reduction potential, ORP)、溶解氧(dissolved oxygen, DO)、pH值等参数用水质分析仪(YSI, 美国)现场测定；采用有机玻璃采水器分别在池塘中心和四角采集水深20~30 cm处水样，混合均匀后用于水质及细菌样品测定。采集约100 mL水样用于叶绿素a (Chl a)浓度的测定，总氮(total nitrogen, TN)、氨氮(NH4+)、亚硝酸盐(NO2–)、硝酸盐(NO3–)、总磷(total phosphorus, TP)和磷酸盐(PO43−)等营养盐参数使用营养盐自动分析仪(Skalar, 荷兰)，测定具体方法参照《水和废水监测分析方法(第四版)》。采用稀释涂布平板计数法测定水体BA(石鹤, 2010)。使用英霍夫式锥形管测定BFV，样品体积为1 L，经30 min沉降后记录沉积物的体积，每组取3份平行。采用全自动显微镜(蔡司, 德国)拍照记录生物絮团的微观结构。
细菌群落：采集水样500 mL经孔径为0.22 μm聚碳酸酯滤膜(Whatman, 美国)过滤后，滤膜置于无菌冻存管中放置于液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱，用于后续DNA提取，每组2个平行。采用DNeasy PowerWater试剂盒(美国)进行基因组DNA提取后，利用NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, 美国)检测DNA的纯度和浓度。提取的基因组DNA送至广州美格生物科技有限公司进行测序。将DNA浓度稀释至2 ng/μL作为模板，利用细菌16S rDNA V3~ V4区通用引物341F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3ʹ)和806R(5ʹ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ʹ)进行PCR扩增。PCR产物以等摩尔量混合后回收，在Illumina二代测序平台(Illumina Inc, 美国)测序。
1.3 数据分析对测序获得的原始数据进行有效拼接后，利用拼接好的有效数据进行OTUs (operational taxonomic unit)聚类分析，同时将OTU和物种注释结合，得到每个样品的OTUs及分类谱系。再根据OTUs进行丰富度以及多样性指数分析：首先在97%的相似性水平上，利用UPARSE算法进行OTU聚类；使用SILVA等数据库进行物种分类信息分析。使用PICRUSt软件，基于OTU的物种注释和丰度信息，将KEGG数据库中已有基因组的原核生物16S rRNA序列与SILVA数据库中16S rRNA序列进行关联，然后将KEGG数据库已有的原核物种基因组进行序列打断，利用UProC对所有基因组的KO序列进行统计和KEGG预测(杜宛璘等, 2020)。采用非度量多维尺度(NMDS, nonmetric multidimensional scaling)方法分析细菌群落组间差异及时空分布特征。基于群落Bray- Curtis相异度，采用RStudio程序包vegan和grid进行RDA分析，评估细菌与环境因子之间的关系(杜宛璘等, 2020)。采用基于群落Bray-Curtis距离的Adonis、ANOSIM和MRPP分析法检验组间群落结构的差异及其显著性。两组间的环境因子差异分析采用SPSS软件中t-test检验法。原始数据已上传至MCBI-SRA数据库，登录号：PRJNA1153802。
2 结果与分析 2.1 水质指标实验期间特种碳源和缓释碳源组中Cond整体呈持续升高的变化趋势。在培养结束时，特种碳源组和缓释碳源组中Cond显著高于对照组(P < 0.05)。实验前3周，缓释碳源组Cond低于特种碳源组，第3周之后，缓释碳源组Cond显著高于特种碳源组(P < 0.05) (图 1A)。与Cond变化趋势相似，对照组和实验组的TDS随实验进行整体呈升高趋势。第4周后，实验组TDS显著高于对照组(P < 0.05)，其中，缓释碳源组TDS在实验结束时较特种碳源组更高，但二者差异并不显著(P > 0.05)(图 1B)。实验期间，对照组和实验组中ORP降低，在实验结束时，对照组、特种碳源组和缓释碳源组ORP分别降低为初始值的30.16%、41.76%和54.61%，且特种碳源组和缓释碳源组ORP显著高于对照组(P < 0.05)(图 1C)。人工泵氧和生物消耗氧气使得DO保持基本稳定。实验前5周，对照组DO显著高于实验组(P < 0.05)(图 1D)。对照组和实验组水体pH值均呈先升高后降低再升高的变化趋势，实验结束时，实验组pH显著低于对照组(P < 0.05)(图 1E)。实验期间，对照组Chl a浓度显著高于实验组(P < 0.05)，且在第4周达到最高值82.17 μg/L后降低。特种碳源组和缓释碳源组中Chl a浓度在实验期间略有降低并基本保持稳定，且两组之间无显著性差异(P > 0.05)(图 1F)。对照组BA在实验期间基本保持稳定，实验组BA持续升高，到培养结束时，实验组BA约为对照组的5倍，且特种碳源组和缓释碳源组间无显著差异(P > 0.05) (图 1G)。实验期间，实验组与对照组的BFV均有不同程度的升高，实验组较对照组升高幅度更大，在实验结束时，特种碳源组和缓释碳源组BFV分别为对照组的2.7倍和2.2倍，且两组实验组间存在显著差异(P < 0.05)(图 1H)。
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图 1 添加碳源对水质指标的影响 Fig.1 Effect of adding carbon sources on water quality parameters T: Special carbon source addition; H: Slow-release carbon source addition. The same below. |
实验期间，对照组和实验组TN、NH4+和NO3–整体呈升高趋势。实验结束时，对照组、特种碳源组和缓释碳源组TN浓度分别较初始值升高了2.9倍、2.6倍和2.7倍(图 2A)，实验组中含氮类营养盐浓度均显著低于对照组(P < 0.05)，且特种碳源组中TN、NH4+和NO2–浓度显著低于缓释碳源组(P < 0.05)。实验组和对照组中TP和PO43−浓度呈先升高后降低的变化趋势，培养结束时，3组间TP和PO43−浓度无显著差异(P < 0.05) (图 2)。实验结束时，实验组中pH、Chl a、TN、NH4+、NO2–和NO3–均显著低于对照组(P < 0.05)，而BA和BFV显著高于对照组(P < 0.05)。特种碳源组Chl a、BFV和NO3–显著高于缓释碳源组(P < 0.05)，特种碳源组TN、NH4+和NO2–显著低于缓释碳源组(P < 0.05) (图 1和图 2)。
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图 2 添加碳源对营养盐的影响 Fig.2 Effect of adding carbon sources on nutrients |
对培养实验期间3个时间点(第1、3和6周)的大口黑鲈养殖池塘水样进行16S rRNA基因高通量测序，共得到4 904 810条有效序列，注释到6 317个OTUs，每个样本的OTU数目在771~1 654之间。本研究重点讨论平均相对丰度高于0.5%的细菌门类群和属类群。
在门水平上，放线菌(Actinobacteria)、变形菌(Proteobacteria)和拟杆菌(Bacteroidetes)是主要类群，其平均相对丰度分别为47.8%、31.6%和16.6%；其次为疣微菌(Verrucomicrobia)和蓝细菌(Cyanobacteria)。随着培养的进行，放线菌门相对丰度显著降低，变形菌、拟杆菌和疣微菌相对丰度升高。培养初始时(第1周)，缓释碳源组放线菌相对丰度(平均为60.6%)显著高于对照组(平均为55.0%)和特种碳源组(平均为50.5%)；培养结束时(第6周)，缓释碳源组放线菌相对丰度(平均为30.0%)显著低于对照组(平均为39.9%)和特种碳源组(平均为33.5%)。培养初始时，对照组变形菌相对丰度(平均为30.9%)显著高于特种碳源组(平均为30.2%)和缓释碳源组(平均为25.2%)；而在培养结束时对照组变形菌相对丰度(平均为28.3%)显著低于特种碳源组(平均为37.6%)和缓释碳源组(平均为38.3%) (图 3A)。
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图 3 添加碳源对细菌群落结构在门水平(A)和属水平(B)分布的影响 Fig.3 Effect of adding carbon sources on bacterial community structure at phylum level (A) and genus level (B) |
在属水平上，hgcI_clade (平均相对丰度43.8%)、CL500-29_marine_group (平均相对丰度10.3%)、MWH-UniP1_aquatic_group (平均相对丰度6.6%)和多核杆菌属(Polynucleobacter)(平均相对丰度6.2%)为主要优势类群。随着培养的进行，hgcI_clade、CL500- 29_marine_group和MWH-UniP1_aquatic_group相对丰度降低，沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、栖湖菌属(Limnohabitans)和Fluviicola相对丰度升高。培养结束时，特种碳源和缓释碳源组中栖湖菌属、沉积物杆状菌属、Fluviicola、黄杆菌属(Flavobacterium)、红杆菌属(Rhodobacter)和新鞘脂菌属(Novosphingobium)等细菌类群相对丰度显著高于对照组，而hgcI_clade和CL500-29_marine_group等细菌类群相对丰度显著低于对照组(图 3B)。
NMDS分析(图 4A)和基于群落Bray-Curtis距离的Adonis、ANOSIM和MRPP分析显示(表 1)，随着培养的进行，对照组、特种碳源组和缓释碳源组的细菌群落结构均发生显著变化。且在培养初始(第1周)、培养中期(第3周)和培养结束时(第6周)，对照组、特种碳源组和缓释碳源组3组间细菌群落结构均存在显著差异。基于细菌群落结构与环境因子间的RDA分析显示，轴1和轴2分别可解释环境因子影响的81.6%和9.2%。所有环境因子中，DO(R2=0.72, P < 0.05)、NO3–(R2=0.57, P < 0.05)、TN(R2=0.55, P < 0.05)、TP (R2=0.52, P < 0.05)、WT(R2=0.42, P < 0.05)、Cond (R2=0.34, P < 0.05)、NH4+ (R2=0.16, P < 0.05)和Sal (R2=0.12, P < 0.05)对细菌群落结构具有显著性影响(图 4B)。在门水平上，变形菌和拟杆菌均与DO、TN、NO3–、NH4+、Cond和TDS显著正相关，与WT和TP负相关；放线菌则与之相反，与DO、TN、NO3–、NH4+、Cond和TDS显著负相关，与WT、TP和Sal显著正相关(图 5A)。在属水平上，栖湖菌属与DO、NO3–和Cond显著正相关，与Chl a、pH、NO2–、Sal、TP和WT显著负相关；沉积物杆状菌属与Chl a、pH、NO3–和Sal显著负相关；新鞘脂菌属与pH、NO2–和Sal显著负相关；黄杆菌属与DO和NO3–显著正相关，与NO2–、Sal、TP和WT显著负相关；红杆菌属与Cond和TDS显著正相关。而hgcI_clade和CL500-29_marine_group则与Sal、TP和WT显著正相关，与DO、TN、NO3–、NH4+、Cond和TDS显著负相关。MWH-UniP1_aquatic_ group与TP和WT显著正相关，与DO、TN、NO3–和Cond显著负相关(图 5B)。
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图 4 细菌群落结构的NMDS(A)和RDA分析(B) Fig.4 NMDS (A) and RDA (B) of bacterial community structure |
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表 1 不同组别间细菌群落结构显著性差异分析(P < 0.05表示具有显著性差异) Tab.1 Significant difference analysis of bacterial community structure between different groups (P < 0.05 indicatng significant difference) |
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图 5 细菌群落结构与环境因子在门水平(A)和属水平(B)相关性 Fig.5 Correlation between bacterial community structure and environmental factors at phylum level (A) and genus level (B) |
培养期间池塘水体细菌群落KEGG功能基因预测结果显示，氨基酸代谢(amino acid metabolism)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)和辅助因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)等是细菌群落主要功能基因。培养结束时，特种碳源组和缓释碳源组中与碳水化合物代谢、脂质代谢(lipid metabolism)、异种生物降解和代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism)、膜运输(membrane transport)、细胞活性(cell motility)、信号转导(signal transduction)、环境适应(environmental adaptation)等相关的功能基因相对丰度显著高于对照组。而特种碳源组和缓释碳源组中与辅助因子和维生素的代谢、能量代谢(energy metabolism)、复制和修复(replication andrepair)、折叠分选与降解(folding sorting and degradation)和翻译(translation)等相关的功能基因相对丰度显著低于对照组(图 6)。
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图 6 添加碳源对细菌群落功能预测基因的影响 Fig.6 Effect of adding carbon sources on bacterial community functional gene prediction |
本研究结果显示，大口黑鲈对营养物质的代谢排放以及投入饵料的积累使得本次实验期间养殖池塘中Cond和TDS较实验初始时更高，ORP较实验初始时更低(图 1)。在实验前3周，缓释碳源组Cond和TDS低于特种碳源组；第3周后，缓释碳源组Cond显著高于对照组和特种碳源组，且缓释碳源组TDS显著高于对照组(图 1A和1B)，其中可能的原因是缓释碳源释放有机碳的速率较慢，到实验后期才大量释放有机碳，促进细菌生长代谢及无机营养盐的排放，导致更高的水体Cond和TDS (杨泳等, 2023)。ORP是反映水体氧化还原性能的指标，ORP越高，表示水体的氧化性越强；反之，ORP越低，还原性越强。且ORP对指示水体自净能力具有重要意义，较高的ORP将有利于好氧微生物的生长和有机污染物的分解，从而增强水体的自净能力；相反，低的ORP则有利于厌氧菌的繁殖，可能导致水体的恶化(Lima, 2002)。本实验结束时，特种碳源组和缓释碳源组ORP显著高于对照组(图 1C)，可间接印证添加碳源有助于养殖水体自净。实验第2周后，实验组水体pH显著低于对照组(图 1E)，其原因可能是，一方面，对照组中Chl a浓度高，浮游植物生长旺盛，吸收水体CO2、释放O2，引起水体pH值升高；另一方面，实验组中添加碳源可促进异养细菌生长，消耗水体氧气，释放CO2，导致水体pH值降低；此外，实验组中细菌更加活跃的硝化作用会产生酸性代谢物，也将进一步导致水体pH下降(李莉等, 2019)。这种添加碳源导致鳙鱼(Aristichthys nobilis) (Jiang et al, 2020)、南美白对虾(Penaeus vannamei) (刘克明等, 2019)、凡纳对虾(Huang et al, 2022)和中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)(岳强等, 2012)等养殖池塘水体pH降低的现象已被广泛报道。
实验结束时，特种碳源组和缓释碳源组中BA和BFV均显著高于对照组(图 1G和1H)，说明添加碳源促进了养殖水体细菌生长及生物絮团的形成。大量研究表明，向养殖水体中添加碳源后，异养细菌被激活，快速繁殖并大量附着于水体悬浮颗粒上，异养细菌富集的颗粒同时会附着藻类、原生动物以及大分子有机质等，形成生物絮团(李志斐等, 2015; Kumar et al, 2024)。显微镜观测结果显示，本研究中生物絮团中充满较多细菌、藻类和原生动物(图 7)。
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图 7 显微镜观测生物絮团的形态结构 Fig.7 Morphology of biofloc under microscope |
实验结束时，实验组BFV显著高于对照组(图 1H)，而TN、NH4+和NO2–浓度显著低于对照组(图 2)，说明此时生物絮团已基本稳定形成并发挥降氮作用，从而调节养殖系统的水质。这与龙丽娜等(2022)在低盐度条件下开展的生物絮团对凡纳对虾养殖池塘水质的影响结果一致，即生物絮团在15 d左右形成并逐步稳定。实验结束时，对照组、特种碳源组和缓释碳源组TN浓度分别较初始值升高了2.9倍、2.6倍和2.7倍(图 2A)，这是因为随着鱼体的生长，通过代谢排出体外的含氮类无机营养盐含量增加，且投饲量增大，水体中残饵、粪便等有机物增多，细菌将其分解产生的含氮类无机营养盐含量也相应增多(Liu et al, 2022)。实验前2周，3组池塘水体NO3–和NO2–浓度基本稳定，这是由于养殖前期，鱼体较小，耗氧量少，且饲料投喂量较少，养殖生物排泄和残饵形成的NO3–和NO2–尚未在养殖池中大量积累。实验结束时，实验组中TN、NH4+、NO2–和NO3–浓度均显著低于对照组，说明添加特种碳源和缓释碳源均可达到降低水体氮含量的效果，且添加特种碳源对TN、NH4+和NO2–的降低效果较缓释碳源更显著(图 2)。众多研究也表明，添加碳源能将罗非鱼(Mali et al, 2024)、凡纳对虾(Huang et al, 2021; 龙丽娜等2022)、松浦镜鲤鱼(Cyprinus specularis Songpu) (赵志刚等, 2013)和草鱼(Lu et al, 2013; 夏耘等, 2014)养殖池塘水体含氮类营养盐浓度控制在较低且稳定的水平，说明添加碳源后形成的生物絮团对含氮类营养盐的控制效果较好，生物絮团系统中的异养细菌能将系统中的无机氮转化为自身蛋白，维持良好的养殖水质(Avnimelech et al, 2012)。实验结束时，特种碳源组BFV显著高于缓释碳源组(图 1H)，且特种碳源组TN、NH4+和NO2–显著低于缓释碳源组(图 2)，说明特种碳源“菌来”的添加对生物絮团的形成产生更加显著的促进作用，且其改善养殖水质的效果较缓释碳源“PHB”更优。这可能是由于经发酵过的复合特种碳源“菌来”中包含大分子有机质如多糖、蛋白质等，以及氨基酸和单糖等小分子有机质，可供细菌快速吸收后大量繁殖并形成生物絮团；而缓释碳源“PHB”不溶于水，依靠胞外水解酶降解产生可溶性有机单体或低聚物，再供细菌利用(Li C et al, 2022)，因此，缓释碳源对本研究中大口黑鲈养殖池塘水质的影响不及特种碳源所产生的影响显著。
3.2 添加碳源对细菌群落结构与功能的影响本研究结果显示，在大口黑鲈养殖池塘水体中，放线菌、变形菌和拟杆菌是主要门类群，这与廖栩峥等(2020)、夏耘等(2015)的研究结果一致。在培养初始，实验组变形菌相对丰度低于对照组，而到培养结束时，实验组中变形菌相对丰度显著高于对照组(图 3A)，这可能与多核杆菌属和栖湖菌属等β-变形菌的生长有关(图 3B)。多核杆菌属和栖湖菌属均可高效利用水体有机碳(Watanabe et al, 2010; Avila et al, 2019)，本研究中向大口黑鲈养殖池塘添加碳源，促进了这两类细菌生长，导致其相对丰度升高。且变形菌门包含绝大多数反硝化功能菌群，参与脱氮除磷过程，对有机物的降解具有重要的作用(Yang et al, 2011; Liu et al, 2022)，这可能是本研究中添加碳源组中含氮类营养盐TN、NH4+、NO2–和NO3–浓度均显著低于对照组的原因之一。随着培养的进行，hgcI_clade和CL500-29_ marine_group等细菌相对丰度降低(图 3B)。Gomez-Consarnau等(2012)发现hgcI-clade和CL500-29_ marine_group是参与自然水体碳循环的重要细菌类群，对有机质具有强降解能力，且偏好富营养化的水体。本研究中，此两类细菌相对丰度与TN、NO3–和NH4+之间存在显著负相关性(图 5B)，推测培养期间养殖池塘水体中TN、NO3–和NH4+浓度的升高可能是导致这两类细菌相对丰度降低的重要原因。培养结束时，实验组中栖湖菌属、沉积物杆状菌属、黄杆菌属、红杆菌属和新鞘脂菌属等细菌类群相对丰度显著高于对照组(图 3B)，且这几类细菌相对丰度均与NO2–浓度显著负相关(图 5B)，说明实验组中生物絮团的形成引起水体NO2–的降低、进而促进这几类细菌的生长。栖湖菌属是参与氨氧化过程的主要细菌，而黄杆菌属和红杆菌属对水体反硝化过程具有促进作用，且黄杆菌属作为噬纤维菌–黄杆菌–拟杆菌亚纲(Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroidia, CFB)细菌之一，对大分子难降解有机碳具有高效降解功能(Li D et al, 2022)。沉积物杆状菌属能够在好氧条件下降解和去除有机碳，在环境污染的处理中具有很大的潜力(宋雅丽, 2018)。添加碳源后，这些参与水体氮循环与碳循环的关键细菌类群相对丰度的升高，说明添加碳源可改善了水体细菌种群结构，增强细菌代谢活性，有利于水体中的有机碳及营养盐的分解、转化。
培养结束时，相较于对照组，特种碳源组和缓释碳源组中与碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、脂质代谢(lipid metabolism)、细胞活性(cell motility)和膜运输(membrane transport)等相关的功能基因相对丰度显著升高(图 6)，这与李志斐等(2015)通过Biolog- ECO技术分析生物絮团对水体微生物代谢功能的结果一致，即生物絮团可增强水体微生物的代谢活性，尤其是对多聚物和碳水化合物的利用活性。此外，在培养结束时，特种碳源组和缓释碳源组中与能量代谢(energy metabolism)及复制和修复(replication and repair)等相关的功能基因相对丰度显著低于对照组(图 6)，说明添加碳源导致细菌群落在有机碳富足的水体中维持自身基础生长代谢所需耗能降低，细菌生长效率(bacterial growth efficiency, BGE)升高，细菌吸收的有机碳更多地以细菌生产力的形式转换成细菌生物量(Carlson et al, 2007)，这也是实验组中细菌丰度显著高于对照组的重要原因之一。
4 结论本研究表明，添加碳源可促进大口黑鲈养殖池塘水体中生物絮团的形成，降低TN、NH4+、NO2–和NO3–浓度，导致细菌群落结构发生显著变化，参与水体氮循环与碳循环的关键细菌类群占比升高，同时，与碳、氮代谢等相关的功能预测基因相对丰度升高，说明添加碳源有助于细菌对水体中的含氮类营养盐及有机碳的降解利用。因此，添加碳源技术可有效改善养殖池塘水质，增强细菌代谢活性，促进养殖水体碳氮循环过程。且相较于缓释碳源，特种碳源对生物絮团的形成产生了更加显著的促进作用，且其改善养殖水质的效果更优。
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