Doublesex and mab-3 related transcription factor (DMRT)基因家族是一个与性别决定相关的转录因子家族(Zarkower, 2001)，家族成员几乎都包含一个具有DNA结合能力的DM结构域(Doublesex and mab-3 DNA-binding domain) (Zhu et al, 2000)。从无脊椎动物到脊椎动物，该结构域序列都高度保守，而该结构域也是基因发挥调节功能的物质基础，但家族成员之间在DM结构域之外的序列相似性却不高(Volff et al, 2003; 李法君等, 2016)。
DMRT家族有多个成员，哺乳动物如人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)均有8种dmrt基因(李海龙等, 2023)。鱼类有5种dmrt基因(dmrt1~ dmrt5)，dmrt2有2种亚型(dmrt2a和dmrt2b) (Zhou et al, 2008)。dmrt1是第1个克隆得到的包含DM结构域的基因，该基因被认为是雄性性别决定的关键基因，是目前已知的从无脊椎动物到人最保守的性别分化相关基因(Raymond et al, 1998)。该基因在胚胎阶段雌雄个体均有表达，而在胚后发育阶段，dmrt1在性腺中特异表达，且精巢中的表达量远高于卵巢(Raymond et al, 1999; Marchand et al, 2000)。dmrt2a存在于所有的脊椎动物中，在胚胎体节的发育过程中起到重要作用(Meng et al, 1999)，并与躯体左右不对称的建立相关(Saude et al, 2005; Hong et al, 2007)，在金鱼(Carassius auratus)精巢和卵巢中的表达量均较高，在脑、肝和肠等组织也有表达(江山等, 2012)。dmrt2b是鱼类特有基因，对胚胎发育中的体节形成和躯体左右不对称的建立起到调控作用(Hong et al, 2007; Saude et al, 2005)，该基因在金鱼的精巢、卵巢、脑、肝脏、肠和肌肉中均有表达，且卵巢表达量高于精巢(江山等, 2012)；dmrt3不仅与性别发育有关，还与神经系统和感官发育相关，其在精巢中高表达，在脑、卵巢和垂体等组织也有部分表达(Winkler et al, 2004; Li et al, 2008; 生锡绘等, 2021)；dmrt4被认为对卵巢的发育起重要作用，也对神经系统形成等发挥作用，除了性腺，在非性腺组织也有表达(Huang et al, 2005; 苏利娜等, 2013)；dmrt5不仅在性腺发育中具有潜在的重要作用，还参与其他组织特别是神经的发育等(Guo et al, 2004)。可见鱼类的5种DMRT家族主要参与性别决定和分化，在神经系统、器官发育及其功能维持中也发挥着重要作用(曹谨玲等, 2011)。
线纹尖塘鳢(Oxyeleotris lineolata)俗称澳洲笋壳鱼、睡鳕，是澳大利亚特有的经济鱼类，1998年引入我国并成功扩繁，属于中国高档名特优淡水养殖鱼类(Herbert et al, 2003、2004; Yang et al, 2016)。线纹尖塘鳢是塘鳢科中体型较大的淡水经济鱼类，野外捕捞到最大个体体重3 250 g，体长90 cm，一般商品鱼规格为500~1 000 g (Herbert et al, 2003)，且具有典型的性别生长二态性，其雄鱼生长速度比雌鱼快25%以上。李春枝等(2010)以线纹尖塘鳢为父本，同属的云斑尖塘鳢(O. marmorata)为母本，通过种间杂交获得了杂交尖塘鳢。杂交尖塘鳢因生长具有超亲杂种优势、体色偏向母本、易驯饲配合饲料、抗逆性强、病害少等诸多优点，其养殖规模逐年增加(骆明飞等, 2016; 樊佳佳等, 2022)。种质调研表明，2022年我国尖塘鳢养殖面积约1 333 hm2，而杂交尖塘鳢养殖占90%以上。因线纹尖塘鳢雄鱼生长速度比雌鱼快且可作为杂交尖塘鳢父本，因此，生产上对线纹尖塘鳢的雄鱼需求多，有必要开展线纹尖塘鳢性别决定和性别分化研究，实现性控育种。转录组测序技术已广泛应用于功能基因挖掘和基因表达调控等研究(周启苓等, 2022; 李雨等, 2023)，研究室前期获得了线纹尖塘鳢精巢和卵巢转录组测序数据(PRJNA936645)，从注释的功能基因中共筛选到2个DMRT家族基因的cDNA序列，且其在精巢和卵巢中存在差异表达，推测这2个基因可能与线纹尖塘鳢性别决定和性别分化相关。本研究克隆扩增这2个dmrt基因cDNA序列，通过生物信息学手段预测2个DMRT蛋白的二级结构、三级结构和分析与其他脊椎动物DMRT家族基因的系统进化关系。通过实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)分析2个基因在雌雄鱼8个组织和早期7个发育阶段的表达情况，并应用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)分析基因在精巢的定位。研究结果可为线纹尖塘鳢性别决定与性别分化分子机制的深入研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验动物实验用线纹尖塘鳢取自广州锐沣渔业有限公司。随机选择1龄成鱼(3尾雌鱼和3尾雄鱼)，用100 mg/kg的MS-222深度麻醉后，剪取性腺、脑、肾脏、肝脏、肌肉、心脏、肠和脾脏共8个组织，液氮速冻，–80 ℃保存，用于提取总RNA。另外，取部分精巢组织，4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)固定，用于Oxldmrt1和Oxldmrt3的FISH检测。选择1对性成熟的线纹尖塘鳢(雌鱼520 g、雄鱼580 g)催产后人工授精，受精卵在28~30 ℃水温下培育，收集受精卵、囊胚期、原肠胚期、眼囊期、出膜期、出膜4 d、出膜7 d的胚胎或仔鱼共7个早期发育阶段样本，每个发育阶段随机取3组样本，每组样本50粒(尾)个体，样本置于冻存管，液氮速冻，–80 ℃保存，用于提取总RNA。
1.2 总RNA的提取及cDNA的合成组织和发育阶段样本总RNA提取按照TRIzol法(Invitrogen, 美国)进行，提取的RNA采用DNaseⅠ清除其中的DNA残留，使用RNA clean试剂盒去除其中的蛋白质残留。采用多功能酶标仪Biotek Cytation 5 (Biotek, 美国)和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA浓度和纯度，提取的总RNA置于–80 ℃保存。
cDNA合成使用PrimeScriptTM RT-PCR反转录试剂盒(TaKaRa, 日本)，反应分2步进行：第1步，dNTP Mix (10 mmol/L each) 1 µL，Oligo dT Primer (2.5 µmol/L) 1 µL，RNA 1 µg，加入RNase Free ddH2O至10 µL，65 ℃ 5 min；第2步，在第1步10 µL体系中再加入5×PrimeScriptTM Buffer 4 µL，RNase Inhibitor (40 U/µL) 0.5 µL，PrimeScriptTM RTase 0.5 µL，RNase Free ddH2O 5 µL，共20 µL体系，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。合成的cDNA置于–20 ℃保存待用。
1.3 Oxldmrt1和Oxldmrt3序列扩增及表达分析从线纹尖塘鳢性腺转录组(PRJNA936645)获得Oxldmrt1和Oxldmrt3基因cDNA，以cDNA序列为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计开放阅读框(open reading frame, ORF)验证引物、RT-qPCR引物和FISH探针，引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，序列信息见表 1。
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表 1 本研究所用的引物及探针序列 Tab.1 Primers and probe sequences used in this study |
ORF扩增及验证：以精巢cDNA为模板，扩增Oxldmrt1和Oxldmrt3基因的ORF序列。PCR体积为50 µL，含有PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa，日本) (1.25 U/µL) 1 µL；5×PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10 µL；dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 4 µL；上下游引物(10 µmol/L)各2 µL；cDNA 2 µL；ddH2O 29 µL。在PCR扩增仪(博日, Life)扩增，扩增程序为94 ℃预变性4 min，然后35个循环(94 ℃变性30 s, 55 ℃复性30 s, 72 ℃延伸120 s)，最后72 ℃延伸7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度，PCR产物送广州艾基生物科技有限公司测序。
时空表达谱分析：以提取的RNA反转录制备的cDNA为模板，包括线纹尖塘鳢雌鱼和雄鱼各8个组织和7个早期发育时期，每个样本3个重复。使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(ABI, 美国)进行RT-qPCR。在冰上避光环境中加样，RT-qPCR采用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(ABI, 美国)进行操作，PCR体系20 µL，包括Power SYBR Green PCR Master Mix 10 µL，ROX Reference Dye 0.4 µL，上、下游引物(10 µmol/L)各0.8 µL，cDNA模板1 µL，ddH2O 7.6 µL。扩增条件为50 ℃预处理2 min，95 ℃变性2 min；42个循环的条件是95 ℃变性15 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s。荧光读板温度为72 ℃。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，每个样本重复3次，并设置阴性对照(不加模板)。
FISH分析：将精巢组织置于PFA固定24 h后，用75%乙醇脱水，然后利用梯度酒精对样本进行脱水、二甲苯透明、石蜡浸润和包埋、然后切成6 µm的切片，烤片、二甲苯脱蜡后，蛋白酶K消化，然后滴加3%甲醇-H2O2阻断内源性过氧化物酶。利用P6探针进行杂交，采用FITC-Tyramide荧光素进行显色，再利用P7探针进行杂交，采用CY3-Tyramide荧光素显色。最后，用DAPI复染细胞核，冲洗后封片。切片于正置荧光显微镜(尼康)下观察并采集图像。
1.4 OxlDMRT1和OxlDMRT3结构分析及系统进化利用ORFFinder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分别对Oxldmrt1和Oxldmrt3核苷酸序列进行分析，确定其ORF及编码的氨基酸；利用Prot-Param Tool (https://web.expasy.org/protparam/)软件预测2个DMRT氨基酸残基组成、等电点、分子量等；利用Psipred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测蛋白质二级结构；利用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)预测蛋白质保守结构域；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质三维结构。
通过NCBI数据库检索哺乳纲代表物种人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)、鸟纲代表物种鸡(Gallus gallus)、爬行纲代表物种蜥蜴(Anolis carolinensis)、两栖纲代表物种非洲蟾蜍(Xenopus laevis)、鱼纲代表物种有鲤形目的斑马鱼(Danio rerio)、鲈形目的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和青鳉(Oryzias latipes)共8个物种的DMRT家族基因氨基酸序列与OxlDMRT1和OxlDMRT3氨基酸序列进行比对，采用ClustalW和MEGA11.0软件构建蛋白质系统进化树，根据模型预测确定JTT+G+F为最优模型，选用邻接法(neighbor joining, NJ)构建进化树，1 000次重复计算自展分析值。
1.5 数据分析本研究RT-qPCR数据均采用2–ΔΔCT方法(Pfaffl, 2001)计算Oxldmrt1和Oxldmrt3在不同组织和发育阶段的相对表达量。基因相对表达量的所有数据处理均采用R语言包进行统计分析，差异显著性用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较，根据平均值±标准差(Mean±SD)绘制统计图。
2 结果与分析 2.1 线纹尖塘鳢Oxldmrt1和Oxldmrt3序列结构以线纹尖塘鳢精巢cDNA为模板，克隆获得Oxldmrt1和Oxldmrt3基因ORF序列。Oxldmrt1的ORF序列长903 bp，共编码300个氨基酸。Oxldmrt3的ORF序列长1 363 bp，共编码453个氨基酸(序列见图 1)。
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图 1 OxlDMRT1(A)和OxlDMRT3(B)氨基酸序列及保守结构域位置
Fig.1 Amino acid sequences and conserved domain locations of OxlDMRT1(A) and OxlDMRT3(B)
 DM结构； DMA结构域； 锌指结合位点1； 锌指结合位点2
DM domain; DMA domain; Zinc-binding sites 1; Zinc-binding site 2
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OxlDMRT1和OxlDMRT3蛋白理化性质结果见表 2。OxlDMRT1和OxlDMRT3分子质量分别为32.54 kDa和48.56 kDa；OxlDMRT1理论等电点为8.36，属于碱性蛋白；OxlDMRT3理论等电点为5.98，属于酸性蛋白；OxlDMRT1和OxlDMRT3不稳定指数均大于40，表明这2个蛋白均不稳定；OxlDMRT1和OxlDMRT3均属于亲水性蛋白，OxlDMRT1比OxlDMRT3蛋白亲水性好；OxlDMRT1具有1个保守的DM结构域，而OxlDMRT3同时具有DM结构域和DMA结构域(DMRTA motif)。其中，DM结构域均由2个保守的锌结合位点组成(CCHC和HCCC)，且每个锌结合位点均由1个组氨酸残基和3个保守的半胱氨酸残基构成(图 1)。
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表 2 OxlDMRT1和OxlDMRT3蛋白结构信息 Tab.2 The structure information of OxlDMRT1 and OxlDMRT3 |
采用SWISS-MODEL在线软件预测OxlDMRT1和OxlDMRT3蛋白三级结构，模型见图 2。OxlDMRT1蛋白以黄金鲈(Perca flavescens)的DMRT1蛋白模型为模板进行建模，序列覆盖度为100%，序列相似性为79.60%，全球模型质量估计(global model quality estimation, GMQE)为0.53。OxlDMRT3蛋白以红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的DMRT3蛋白模型为模板进行建模，序列覆盖度为98%，序列相似性为77.70%，GMQE为0.56。从序列覆盖度、序列相似性和GMQE评估，2个蛋白模型可靠性较高。
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图 2 OxlDMRT1(A)和OxlDMRT3(B)三级结构预测模型 Fig.2 The predicted tertiary structures of OxlDMRT1(A)和OxlDMRT3(B) |
用ClustalW软件将OxlDMRT1和OxlDMRT3与其他脊椎动物的DMRT氨基酸序列进行比对，再用MEGA 11.0软件以NJ法构建系统树(图 3)。结果表明，DMRT不同家族成员独立聚类，OxlDMRT1属于DMRT1家族，而OxlDMRT3属于DMRT3家族。分析OxlDMRT1和OxlDMRT3与其他家族进化起源关系，结果显示，DMRT1家族和DMRT2家族最先聚成一类，再和DMRT3家族聚成一类；DMRT6、DMRT7和DMRT8家族聚成一类，最后再分别与DMRT4家族和DMRT5家族聚类，表明DMRT4和DMRT5家族属于起源最早的基因家族。
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图 3 OxlDMRT1和OxlDMRT3与脊椎动物DMRT家族系统进化树分析 Fig.3 Phylogenetic analysis of OxlDMRT1, OxlDMRT3 and the DMRT family in vertebrate Hs：人；Mm：小鼠；Gg：鸡；Ac：蜥蜴；Xl：非洲蟾蜍；Dr：斑马鱼；On：尼罗罗非鱼；Ol：青鳉。 Hs: Homo sapiens; Mm: Mus musculus; Gg: Gallus gallus; Ac: Anolis carolinensis; Xl: Xenopus laevis; Dr: Danio rerio; On: Oreochromis niloticus; Ol: Oryzias latipes. |
用RT-qPCR检测Oxldmrt1和Oxldmrt3在线纹尖塘鳢雌鱼和雄鱼组织的相对表达量(图 4)，结果显示，Oxldmrt1在精巢中的表达量最高，在卵巢中有少量表达，但极显著低于精巢(P < 0.01)，在脑、肠和脾脏中有微量表达，在其他组织中几乎不表达；Oxldmrt3基因在精巢中的表达量最高，在脑中的表达量次之，其次，在肾脏中有少量表达，而在其他组织中的表达量均较低，其中，雄鱼精巢和脑中的基因表达量均极显著高于雌鱼卵巢和脑(P < 0.01)。
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图 4 Oxldmrt1(A)和Oxldmrt3(B)在雌雄线纹尖塘鳢不同组织中的相对表达量 Fig.4 The relative expression level Oxldmrt1 (A) and Oxldmrt3 (B) in tissues of male and female O. lineolata *代表差异显著(P < 0.05)，**代表差异极显著(P < 0.01)。 * means significant difference (P < 0.05), and ** means highly significant difference (P < 0.01). |
用RT-qPCR检测Oxldmrt1和Oxldmrt3在线纹尖塘鳢早期不同发育阶段的相对表达量(图 5)，结果显示，受精卵中的Oxldmrt1和Oxldmrt3表达量均略高于囊胚到出膜7 d发育阶段，表明这2个基因可能参与重要的受精生物过程。Oxldmrt1和Oxldmrt3在早期各发育阶段均有表达，其中，Oxldmrt1从受精卵到眼囊期的表达量逐渐降低，然后从眼囊期开始又逐渐升高。而Oxldmrt3基因从受精卵到出膜4 d期间的表达量差异不显著，但在出膜7 d后的表达量显著降低(P < 0.01)。
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图 5 Oxldmrt1(A)和Oxldmrt3(B)基因在线纹尖塘鳢不同发育时期的相对表达量 Fig.5 The relative expression level of Oxldmrt1 (A) and Oxldmrt3 (B) in early development of O. lineolata 1：受精卵；2：囊胚期；3：原肠胚期；4：眼囊期；5：出膜期；6：出膜4 d；7：出膜7 d。不同字母代表差异显著(P < 0.05)。 1: Fertilized egg; 2: Blastula: 3: Gastrula; 4: Optic capsule stage; 5: Hatching; 6: 4 d post hatching; 7: 7 d post hatching. Significant differences were showed by different letters (P < 0.05). |
对1龄线纹尖塘鳢的精巢进行HE染色(图 6)，结果显示，线纹尖塘鳢的精巢为小叶型，每个精小叶含有多个精小囊。精原细胞位于精小叶内壁上，精母细胞和未成熟的精子细胞位于精小囊中，其中精原细胞最大，细胞核清晰。
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图 6 1龄线纹尖塘鳢精巢组织特征 Fig.6 Histological characteristics of testes from 1-year-old O. lineolata A：HE染色；B：A图虚框位置放大图；TL：精小叶；SV：精小囊；SG：精原细胞；SC：精母细胞；SA：精子细胞。 A: HE staining; B: The magnified image in the dotted box of panel A; TL: Testis lobule; SV: Seminal vesicle; SG: Spermatogonia; SC: spermatocyte; SA: Spermatid. |
分别用Oxldmrt1和Oxldmrt3基因的特异探针对精巢组织切片进行双色荧光原位杂交(图 7)，结果显示，Oxldmrt1和Oxldmrt3在精巢中表达位置相同，均在精原细胞中有较高的表达信号，而在精母细胞和精子细胞中未检测到表达信号。
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图 7 Oxldmrt1和Oxldmrt3在精巢的荧光原位杂交 Fig.7 The Oxldmrt1 and Oxldmrt3 FISH in testis A：图B、C、D的合图；B：用DAPI对细胞核进行染色；C：Oxldmrt1 mRNA用FITC绿色荧光标记进行定位；D：Oxldmrt3 mRNA用CY3-Tyramide红色荧光标记进行定位。SG：精原细胞。 A: Penal is merged by Penal A, B, C; B: Blue is DAPI staining for nuclei; C: Green is FITC showing the localization of Oxldmrt1 mRNA; D: Red is CY3-Tyramide showing the localization of Oxldmrt3 mRNA. SG: Spermatogonia. |
结构分析表明，Oxldmrt1共编码300个氨基酸，而Oxldmrt3共编码453个氨基酸，2个氨基酸序列同源性不高，仅为65.13%。OxlDMRT1理论等电点为8.36，为碱性蛋白，而OxlDMRT3理论等电点为5.98，为酸性蛋白，因碱性蛋白经常分布在细胞核，而酸性蛋白经常分布在细胞质，推测2个同源蛋白在细胞中的分布出现明显的分化。OxlDMRT1和OxlDMRT3均存在DM结构域。DM结构域是DMRT家族共有的结构，且该结构域在不同进化类型的生物中具有相当高的保守性，即形成了2个高度缠绕的锌指样的DNA结合区，具有锌指结构的蛋白大多是与基因表达的调控有关的功能蛋白(Hamed et al, 2021)，研究发现，该锌指结构能够与Sox9等性别决定相关基因的增强子结合，从而调控该类基因的表达，达到调控性别分化的作用(Zhu et al, 2000)，该结构域还可能与性别相关的DNA小沟中的磷酸骨架接触，从而调控其表达(Murphy et al, 2015)。OxlDMRT3除了存在DM结构域，还存在DMA结构域，DMA结构域被证明在神经形成和神经系统发育类型方面起到一定的调节作用(苏利娜等, 2013)。另外，DMA结构域被认为是更古老的结构域(Volff et al, 2003)，推测Oxldmrt3可能比Oxldmrt1基因更原始。
脊椎动物共存在8种DMRT家族基因，鱼纲和两栖纲存在5种，爬行纲和鸟纲存在6种，哺乳纲存在8种，表明随着物种进化该家族基因扩张，越高等脊椎动物扩张出新的家族基因越多。因为线纹尖塘鳢缺乏参考基因组，仅从性腺转录组筛选到2个dmrt基因的cDNA序列，而将这2个DMRT氨基酸序列与脊椎动物代表物种DMRT家族基因氨基酸进行聚类，结果显示，DMRT不同家族成员独立聚类，OxlDMRT1属于DMRT1家族，而OxlDMRT3属于DMRT3家族。DMRT不同家族聚类结果表明，DMRT5家族基因最原始，其次为DMRT4家族基因，而DMRT3家族基因分化时间早于DMRT1和DMRT2家族。因DMRT3、DMRT4和DMRT5家族均存在DMA结构域，推测这3个家族可能是最古老的基因，在进化过程中，通过基因组加倍后分化而产生了其他家族基因(Zarkower, 2001)。在脊椎动物基因扩增和整个基因组加倍后，一般原始的多功能基因，通过基因拷贝，分化其原始基因的功能而产生新的基因，新的基因功能更单一(Force et al, 1999; Kleinjan et al, 2008)，因为DMRT3家族基因在系统进化显示比DMRT1家族基因更原始，推测Oxldmrt1相对于Oxldmrt3来说其功能可能更单一。
3.2 线纹尖塘鳢Oxldmrt1和Oxldmrt3表达分析Oxldmrt1在性腺中特异表达，在精巢中的表达量最高，而在卵巢中也有少量表达，在精巢中的表达量是卵巢的16.35倍，而在其他组织中的表达量均较低。研究dmrt1在斑马鱼(Guo et al, 2005)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes) (Yang et al, 2007)和鳜(Siniperca chuatsi) (Han et al, 2021)等鱼类中表达模式，也显示其在性腺中特异表达，且精巢中的表达量远高于卵巢，与本研究结果相似。而在虹鳟(Oncorhynchus mykiss) (Marchand et al, 2000)、莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)(Guan et al, 2000)、黑鲷(Sparus macrocephlus)(刘绪生等, 2004)和胡子鲇(Clarias fuscus)(邓思平等, 2012)等鱼类中，该基因仅在精巢中有较高表达，而在其他组织中均不表达，表明该基因特异性地参与鱼类精巢的分化和形成过程。组织表达谱显示，Oxldmrt3也在精巢中表达量最高，在脑中有少量表达，在卵巢基本不表达。而斑马鱼(Li et al, 2008)、大口黑鲈(生锡绘等, 2021)和尼罗罗非鱼(Zafar et al, 2019)等鱼类的dmrt3基因在不同组织中的表达水平与本研究结果相似，均检测到其不但在精巢中的表达量较高，在脑中也有少量表达，推测Oxldmrt3主要在精巢中起重要调节作用，另外，在神经系统脑中也起到一定的调节作用。
利用FISH技术确定Oxldmrt1和Oxldmrt3在精巢组织的表达定位，表明2个基因表达位置相同，均在精原细胞表达，而在成熟的精子细胞中未见表达，但具体在精原细胞的细胞核还是细胞质中表达还需要进一步用电镜等进行研究。分析小鼠dmrt1和dmrt3在雄性生殖系统的表达模式，表明2个基因也均在原始的雄性生殖细胞中表达，而在成熟的生殖细胞中基本不表达(Kim et al, 2003)。Oxldmrt1和Oxldmrt3在受精卵到出膜7 d发育阶段均有表达，且均在受精卵时期表达量最高，推测这2个基因可能在受精过程参与重要的生物过程。眼囊期是个体发育的重要阶段，其视觉系统形成，经过进一步的生长和发育，最终形成幼鱼，Oxldmrt1从受精卵到眼囊期表达量逐渐降低，然后从眼囊期后表达量逐渐升高，推测Oxldmrt1首先从受精卵到原肠胚阶段可能在胚胎发育过程发挥重要功能，因原肠胚阶段基本是原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)形成期，眼囊期后，随着个体生长发育，性腺逐渐形成，生殖细胞开始增殖，性别决定和分化相关基因表达量增加，因此，推测Oxldmrt1可能参与早期的性别决定和性别分化。而Oxldmrt3从受精卵至出膜4 d阶段，表达量差异不显著，出膜4 d为线纹尖塘鳢开口摄食期，从出膜4 d开始，线纹尖塘鳢从内源性营养逐渐转变成外源性营养模式，而性别也开始发生分化。但出膜7 d时，Oxldmrt3表达量显著降低，推测Oxldmrt3主要在早期胚胎发育阶段起调节作用，而在胚后性别分化过程中调节作用降低。Raymond等(1999)研究表明，dmrt1在小鼠胚胎中的生殖期阶段的雌雄个体都有表达，但随着胚胎的不断发育，在雄性性腺中的表达量逐渐增加，而卵巢中的表达量却逐渐减少。Han等(2021)研究表明，鳜的dmrt1在出膜5 d后表达量逐渐增高，而dmrt3表达量较低，也与本研究结果相似。大量研究表明，dmrt1通常处于性别决定系统级联反应的上游，对性别决定和精巢分化与维持起到十分重要的作用(Raymond et al, 1999; 陈芸等, 2010; 黄洋等, 2021)。dmrt3在胚胎发育阶段发挥重要的调节作用，而可能不参与胚后性别决定和性腺分化，但性腺分化后，dmrt3又在精巢发育成熟过程中发挥重要的调节功能，因此，在成鱼精巢中的表达量最高(Li et al, 2008; Zafar et al, 2019; 生锡绘等, 2021)。
4 结论本研究获得线纹尖塘鳢的2个dmrt基因cDNA序列，分别命名为Oxldmrt1和Oxldmrt3，通过生物信息学分析发现，2个基因均含有高度保守的DM结构域，OxlDMRT3还存在DMA结构域。RT-qPCR分析显示，2个基因在精巢中的表达量均显著高于其他组织，Oxldmrt3在脑中也有少量表达；2个dmrt基因在受精卵中的表达量均最高，Oxldmrt1在眼囊期的表达量最低，而Oxldmrt3在出膜7 d时的表达量最低。FISH分析表明，2个基因在精巢中表达部位一致，均在精原细胞中有较强的表达信号。研究结果可为dmrt基因对线纹尖塘鳢性别决定与性别分化分子机制的研究提供基础资料。
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