肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAF)为胞内信号传递蛋白，具有E3泛素连接酶活性，介导包括TNF受体家族(TNFR)和Toll样受体-白细胞介素-1受体(TLR-1L-1R)家族在内的多个受体家族的信号转导过程，激活NF-κB (Nuclear factor-κB)和MAPKs (mitogen-activated protein kinases)在内的多个信号通路(Wang et al, 2010; Ha et al, 2009; Into et al, 2012)，调控先天免疫、获得性免疫、胚胎发育和骨代谢等过程(Xie, 2013; 万春红等, 2016)。TRAFs的保守结构域均具有重要功能，TRAFs的Coiled coil结构域参与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein, MAVS)介导的非特异性免疫过程(Fang et al, 2017)。目前，在哺乳动物中，TRAF家族共鉴定出7种TRAFs，TRAF7是最后在蛋白网络中被筛选并鉴定的(Bouwmeester et al, 2004)。TRAF7与家族其他蛋白的不同之处在于TRAF7缺乏TRAF结构域(Zotti et al, 2012)。研究人员对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)等养殖水产动物的TRAF基因进行了研究，结果均表明TRAF参与有机体应对刺激后的免疫反应过程，验证了半滑舌鳎CsTRAF6、三角帆蚌HcTRAF6和斜带石斑鱼EcTRAF7具有激活NF-κB信号通路的功能(李坤明, 2019; 杨曼, 2018; 胡宸曦, 2020; 雷倩楠等, 2016)。在仿刺参(Apostichopus japonicus) TRAF方面，研究人员仅对仿刺参TRAF6进行基因克隆并分析刺参在灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染后基因表达模式(Lu et al, 2013)。

仿刺参又称刺参，具有重要的食用和药用价值，是我国重要的海水养殖经济物种(郑童潇等, 2023)。刺参属温带种，一般认为其最适生长温度为10~16 ℃(袁秀堂, 2005)，半致死温度为(31.7±0.15) ℃ (张宇洋等, 2022)。然而，近年来，由于全球气温变暖、厄尔尼诺等原因，我国北方夏季频繁出现极端高温天气，造成池塘养殖刺参大面积死亡，严重影响了刺参养殖业发展(Chang et al, 2022; 畅孟阳等, 2023)。目前，已从生理行为、蛋白水平、代谢水平和转录组水平分析了刺参响应高温胁迫的机制，表明刺参应对高温胁迫的免疫机制是一个复杂的调控过程，高温胁迫下刺参氧化应激相关酶活力改变，免疫响应相关蛋白上调，蛋白合成能力受到抑制，能量类物质发生改变，氨基酸、脂类、辅酶和维生素代谢的代谢产物发生变化，碳水化合物代谢减少，热休克蛋白家族相关基因和NF-κB等通路相关基因表达差异显著，但具体的调控机制尚不清晰(温争争, 2016; 霍达, 2020; Chang et al, 2022)。本团队前期在高温胁迫刺参体壁转录组测序结果中发现，TRAF7在对照组健康刺参和高温胁迫组化皮刺参之间表达差异显著(Chang et al, 2022)，暗示了其在响应高温胁迫中发挥一定的调控作用，但刺参TRAF7基因结构及其在高温胁迫下的具体表达模式仍未见相关报道。本研究在前期研究基础上，利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了AjTRAF7的全长序列，预测其蛋白的理化性质和蛋白结构域，解析该基因在基因组中的分布，构建进化树并结合实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)分析该基因在刺参不同组织中的表达以及在响应高温胁迫过程中的表达变化，旨在为进一步深入解析刺参高温耐受机制和耐高温品种的培育提供科学依据。

实验用刺参苗种购自山东省青岛瑞滋集团有限公司，挑选生理活动健康的刺参作为实验对象，实验所用刺参的平均体重为(54.0±0.5) g/只，正式实验开始前在新鲜海水中暂养1周，暂养用海水为砂滤海水，水温为(14.0±0.5) ℃，盐度为28.0±0.5，持续充气。

实验分为高温组和对照组，每组设3个平行。对照组水温控制在(14.0±0.5) ℃，高温组采用逐步升温的策略，即按照每24 h升温2 ℃的策略升至32 ℃后维持恒温，该温度近似刺参半致死温度(LT₅₀)(张宇洋等, 2022)。实验水槽为100 L白色矩形水桶，每桶注入75 L清洁海水并随机放入25头实验用刺参，实验过程中每天更换10 L新鲜海水，连续充气，高温组水温达到32 ℃开始计时。在实验开始时，从对照组中随机选取刺参个体，剖取体壁、呼吸树、肠道、纵肌、性腺和体腔细胞等组织，经液氮速冻后保存于–80 ℃超低温冰箱，用于该基因不同组织间表达差异检测；分别在第0、2、4、6、8天自对照组和高温组中随机抽取刺参个体，剖取各组织用于检测刺参响应高温胁迫过程的表达差异。

使用总RNA提取试剂盒(TaKaRa, 大连)提取刺参各组织总RNA，使用微量分光光度计NanoDrop1000检测RNA浓度与纯度，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，利用反转录试剂盒(TaKaRa, 大连)对所提取的RNA进行逆转录，获取cDNA。

基于本实验室刺参转录组测序文件(Chang et al, 2022)，获取AjTRAF7 CDS片段序列，以该序列为模版，利用Primer 5.0软件设计特异性引物(表 1)。以健康刺参体壁组织cDNA为模版进行PCR扩增，反应体系：2× Rapid Taq Master Mix (Vazyme) 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，灭菌去离子水21 μL；反应程序：95 ℃ 5min，35个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s)，72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。根据获得的基因编码区序列设计用于RACE和巢式PCR的特异性引物(表 1)。利用切胶回收试剂盒(AG艾科瑞)对巢式PCR产物切胶回收，使用pMD19-T Vector载体(TaKaRa)进行TA克隆，并转化至DH-5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序，利用MEGA和SnapGene确认引物位置，并对测序获得的序列进行拼接，获得该基因的全长序列。

表 1(Tab.1)

表 1 AjTRAF7基因全长克隆所用引物序列 Tab.1 Primer sequences used for full-length cloning of AjTRAF7 gene 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) 用途Purpose 5TR-F ACATTTTGCCGGGCCTGTCT 编码区序列扩增 3TR-R CCAGAGCAGAGGAGCCCCTTGGA 编码区序列扩增 5TRGSP1 CAACCGCTTCATTCCATTCCTGC 5′ RACE PCR 5TRGSP2 AGACAGGCCCGGCAAAATGT 5′ RACE巢式PCR 3TRGSP1 TCGTGCAACTAATGCTAAGCCCCGA 3′ RACE PCR 3TRGSP2 TCCAAGGGGCTCCTCTGCTCTGG 3′ RACE巢式PCR SP CTAATACGACTCACTATAGGGC 巢式PCR TRAF7-F4 GCTGCCCTGGACAAGACCATA RT-qPCR TRAF7-R4 TGATGAGAAGAGATTGCTACCGGC RT-qPCR cytb-F TGAGCCGCAACAGTAATC 内参基因的RT-qPCR cytb-R AAGGGAAAAGGAAGTGAAAG 内参基因的RT-qPCR

表 1 AjTRAF7基因全长克隆所用引物序列 Tab.1 Primer sequences used for full-length cloning of AjTRAF7 gene

使用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测序列开放阅读框(ORF)；使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的分子量、不稳定系数和总平均亲水性等理化性质；使用InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)网站预测蛋白结构域；使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)同源建模预测蛋白质三维结构；使用SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)预测信号肽；使用TM-HMM 2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白质跨膜结构域；使用NetPhos 3.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测蛋白的磷酸化位点；使用NetNGlyc-1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)预测蛋白质糖基化位点；使用prabi (https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白二级结构；使用DNAMAN进行序列比对分析；使用ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)和ESPript 3.0 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)绘制序列比对图并计算序列相似性；使用MEGA11、NCBI Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)和ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)分析氨基酸序列相似性；使用MEGA 11计算遗传距离并应用邻接法构建系统进化树；使用TBtools将AjTRAF7 CDS序列和本实验室组装的刺参基因组序列(序列号PRJNA901209)进行比对，根据基因结构注释信息，构建基因染色体分布图；使用软件GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)对所在基因进行外显子和内含子等结构注释。

按照反转录试剂盒(TaKaRa)说明书，以各组织总量1 μg RNA为模版，合成RT-qPCR所需cDNA。基于AjTRAF7编码区序列，在NCBI上设计RT-qPCR引物(表 1)，使用cytb(Cytochrome b)作为内参(杨爱馥等, 2010)(表 1)。按照试剂盒(TaKaRa)说明书，进行RT-qPCR：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (TIi RNaseH Plus) (2×) 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，灭菌去离子水6.4 μL；程序：95 ℃ 30 s，40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，熔解曲线程序参照荧光定量设备说明书(Eppendorf)。

每种组织3个生物学重复、4个技术性重复。使用2^–∆∆Ct方法分析AjTRAF7在健康刺参体壁、呼吸树、肠道、纵肌、性腺和体腔细胞等组织中的相对表达水平及基因在健康刺参第0天和32 ℃高温胁迫第2、4、6、8天化皮刺参体壁组织中的相对表达水平，使用GraphPad prism 9.0软件绘制表达分布特征和调控变化图。显著性水平设为P < 0.05。

利用RACE技术克隆获得的AjTRAF7基因全长为2 576 bp，其ORF为1 770 bp，5´UTR为345 bp，3´UTR为461 bp，编码589个氨基酸(图 1)；该基因预测蛋白质的分子量为65.6 kDa，理论等电点(pI)为7.52，不稳定系数为32.34，不稳定系数低于40，表明该蛋白为稳定蛋白，总平均亲水性(GRAVY)为–0.150，表明该蛋白为亲水性蛋白。

图 1(Fig. 1)

图 1 AjTRAF7基因核酸序列及编码的氨基酸序列 Fig.1 Nucleic acid sequence of the AjTRAF7 gene and the encoded amino acid sequence 大写字母：开放阅读框；小写字母：非编码区；黑色框：起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)；黄色阴影：WD40重复片段；黑色直线：RING finger；黑色波浪线：Coiled coil结构域。 Uppercase letters: ORF; Lowercase letters: UTR; Black box: Start codon (ATG) and stop codon (TGA); Yellow shadow: WD40 Repeat Fragment; Black straight line: RING finger; Black wavy line: Coiled coil structural domain.

蛋白质结构域预测结果见图 2，AjTRAF7蛋白包含一个RING finger结构域，一个Coiled coil结构域，蛋白C端具有与TRAF结构域类似的6个重复WD40结构域，其中，RING finger是TRAFs的典型结构域。蛋白二级结构结果显示，AjTRAF7蛋白含30.05%的α-螺旋，6.62%的β-转角，36.84%的无规则卷曲和26.49%的延伸链。该预测蛋白质的三维结构预测结果见图 3，AjTRAF7蛋白N端包含螺旋区域，与人的TRAF7 (Homo sapiens, NP 115647.2)蛋白三维结构比较，发现二者三维结构存在差异，但二者均包含明显的螺旋区域(图 3)；整个编码蛋白未预测到信号肽和跨膜区域，预测该蛋白为胞质蛋白；分别预测到41个丝氨酸磷酸化位点、20个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点；在蛋白N端具有3个天冬酰胺糖基化位点。

图 1(Fig. 1)

图 2 AjTRAF7蛋白结构域组成 Fig.2 Domain organization of AjTRAF7 protein

图 1(Fig. 1)

图 3 TRAF7蛋白分子结构(左：刺参；右：智人) Fig.3 The structure of TRAF7 protein molecules (Left: Apostichopus japonicus; Right: H. sapiens)

将AjTRAF7 CDS序列与刺参染色体水平全基因组序列进行比对，与基因组中2个CDS序列高度相似，分别为evm.model.chr8.1363 (Score: 3158.9 Bits)和evm.model.chr8.1742 (Score: 3125.7Bits)；AjTRAF7氨基酸与evm.model.chr8.1363和evm.model.chr8.1742氨基酸序列相似性分别为98.98%和98.81%；综合ClustalW、MEGA和NCBI Blastp结果，发现AjTRAF7、evm.model.chr8.1363和evm.model.chr8.1742氨基酸相似性均大于98%，表明evm.model.chr8.1363和evm.model.chr8.1742为AjTRAF7基因的2个拷贝；evm.model.chr8.1363和evm.model.chr8.1742基因分别位于chr8的序列25 Mb和35 Mb (图 4)；对2个拷贝进行结构注释，结果见图 5，evm.model.chr8. 1363基因包含18个外显子(包含UTR区)，15个内含子；evm.model.chr8.1742包含17个外显子(包含UTR区)和14个内含子。

图 1(Fig. 1)

图 4 AjTRAF7在刺参染色体水平基因组分布图 Fig.4 Genomic distribution of AjTRAF7 at the chromosome level in the sea cucumber

图 1(Fig. 1)

图 5 外显子–内含子结构 Fig.5 Exon-intron structure diagram 蓝色：UTR区；黄色：外显子；上方黑线：内含子；下方黑线：基因长度。 Blue: UTR region; Yellow: Exons; Upper black line: Introns; Lower black line: Gene length.

TRAF7蛋白的氨基酸序列相似性分析结果见图 6，刺参与蝠海星(Patiria miniata)和紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)的氨基酸序列相似性较高，分别为40.58%和38.37%，刺参与原鸡(Gallus gallus)相似性最低，为21.39% (表 2)；系统进化分析结果显示，棘皮动物中的刺参、蝠海星和紫色球海胆聚在一个分支，智人和小鼠(Mus musculus)聚为一支，原鸡和绿海龟(Chelonia mydas)聚为一支(图 7)。

图 1(Fig. 1)

图 6 AjTRAF7氨基酸序列与其他物种TRAF7氨基酸序列多重序列比对 Fig.6 Multiple sequence alignment of AjTRAF7 amino acid sequence with other species´ TRAF7 amino acid sequence 红色阴影区域：完全一致的氨基酸残基；红色字母：≥75%相同的残基；蓝色框：75%以上相同的残基；红色框：RING finger结构域；绿色框：Coiled coil结构域；黑色框：WD40重复片段 GenBank number: Homo sapiens (NP 115647.2); Mus musculus (NP 001402080.1); Gallus gallus (XP 040503313.1); Chelonia mydas (XP 043379460.1); Danio rerio (NP 001073654.1); Anneissia japonica (XP 033122179.1); Patiria miniate (XP 038067895.1); Strongylocentrotus purpuratus (XP 003725416.2); Ostrea edulis (XP 048755261.2). Red shaded area: Identical amino acid residues; Red letters: ≥75% identical residues; Blue boxes: more than 75% identical residues; Red box: RING finger structural domain; Green box: Coiled coil structural domain; Black box: WD40 repeats.

表 2(Tab.2)

表 2 刺参与其他动物TRAF7氨基酸序列之间相似性分析与遗传距离 Tab.2 Similarity analysis and genetic distance between the amino acid sequences of the TRAF7 in sea cucumber and other animals 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.82 0.85 1.03 1.11 1.13 1.12 1.12 1.11 1.12 2 40.58 0.67 0.97 1.11 1.08 1.09 1.09 1.12 1.09 3 38.37 46.49 0.94 1.17 1.16 1.22 1.15 1.17 1.16 4 29.03 34.28 36.12 1.14 1.13 1.11 1.11 1.14 1.14 5 21.90 19.40 20.96 24.58 0.08 0.59 0.10 0.03 0.07 6 21.39 19.90 16.34 24.92 92.23 0.56 0.08 0.08 0.03 7 24.45 25.08 16.34 20.90 53.06 55.78 0.53 0.58 0.59 8 22.24 19.40 17.16 25.59 90.30 87.64 55.71 0.10 0.07 9 22.07 19.57 20.79 24.58 95.67 91.44 53.21 90.45 0.07 10 21.90 19.90 16.67 24.75 93.13 97.94 53.51 93.11 92.24 注：1. 仿刺参；2. 蝠海星；3. 紫色球海胆；4. 欧洲平牡蛎；5. 智人；6. 原鸡；7. 海百合；8. 斑马鱼；9. 小鼠；10. 绿海龟. 右上方为遗传距离，左下方为相似性(%)。 Note: 1. Apostichopus japonicus; 2. Patiria miniata; 3. Strongylocentrotus purpuratus; 4. Ostrea edulis; 5. Homo sapiens; 6. Gallus gallus; 7. Anneissia japonica; 8. Danio rerio; 9. Mus musculus; 10. Chelonia mydas. Genetic distances are shown in the upper right and similarities (%) in the lower left.

表 2 刺参与其他动物TRAF7氨基酸序列之间相似性分析与遗传距离 Tab.2 Similarity analysis and genetic distance between the amino acid sequences of the TRAF7 in sea cucumber and other animals

图 1(Fig. 1)

图 7 刺参和其他物种TRAF7系统进化树 Fig.7 Phylogenetic tree of TRAF7 in Apostichopus japonicus and other species 进化树使用MEGA 11软件以Neighbor-Joining方法构建，节点数值表示1 000次重复bootstrap的置信度百分比，遗传距离是0.10，括号内为GenBank number，箭头位置是刺参TRAF7。 The evolutionary tree was constructed using MEGA 11 software using the Neighbor-Joining method. The node values represent the confidence percentage of 1 000 repeated bootstraps, with a genetic distance of 0.10 and GenBank number in parentheses. The arrow position is the AjTRAF7.

AjTRAF7在健康刺参不同组织的表达情况见图 8，结果显示，AjTRAF7在刺参各组织中均表达，将体壁组织中基因表达量设定为标准值1.0，基因在各组织间表达量存在显著差异(P < 0.05)，其中，雌性性腺中表达量最高，为标准值的3.34倍，显著高于其他组织(P < 0.05)，其次为体腔细胞、呼吸树、体壁和肠道，分别为标准值的1.97倍、1.37倍、1.00倍和0.96倍，在雄性性腺和纵肌中相对表达量最低，分别为标准的0.23倍和0.14倍。

图 1(Fig. 1)

图 8 AjTRAF7基因在健康刺参各组织中分布特征 Fig.8 Characterization of AjTRAF7 gene expression distribution in various tissues of healthy sea cucumber (n=3) 不同字母表示不同组织间差异显著(P < 0.05)，下同。 Different letters indicate significant differences among different tissues (P < 0.05), the same below.

鉴于体壁为高温胁迫后最直接的胁迫反馈组织，本研究对比分析了高温胁迫不同时间点体壁组织中该基因的表达情况(图 9)。与对照组第0天相比，高温胁迫后AjTRAF7在第2、4、6、8天刺参体壁中的表达出现变化。在高温胁迫后的第2和4天表达出现显著上升，为对照组体壁中基因表达量的2.48倍和2.60倍(P < 0.05)；第6天，表达上升但不显著，为对照组体壁中表达量的1.44倍；第8天，表达出现显著下降，为对照组体壁中基因表达量的0.48倍(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 9 高温胁迫后AjTRAF7基因在体壁中表达模式 Fig.9 Expression pattern of AjTRAF7 gene in the body wall after high temperature stress 以对照组(CH)体壁组织中基因表达量设定为标准值1.0。 Gene expression in the body wall of the control (CH) was set as a standard value of 1.0.

本研究克隆了刺参AjTRAF7基因全长，序列分析及结构预测结果显示，该基因与水产动物中已报道的TRAF7基本一致。AjTRAF7 ORF长1 770 bp，比三角帆蚌(ORF 1 803 bp)(胡宸曦, 2020)、马氏珠母贝(ORF 1 809 bp)(雷倩楠等, 2016)、半滑舌鳎(ORF 1 965 bp) (李坤明, 2019)和斜带石斑鱼(ORF 1 977 bp)(杨曼, 2018)等水产动物的基因序列要短。刺参TRAF7蛋白未预测到信号肽和跨膜区域，表明该蛋白为胞质蛋白，与软体动物马氏珠母贝PmTRAF7 (雷倩楠等, 2016)预测的结果一致，且与斜带石斑鱼EcTRAF7蛋白的亚细胞定位结果一致(杨曼, 2018)。AjTRAF7蛋白包含1个RING finger结构域、1个Coiled coil结构域和6个WD40重复片段，未预测到TRAF结构域，但WD40重复片段与TRAF结构域作用类似(Xu et al, 2004; Zotti et al, 2012)。AjTRAF7蛋白与刺参TRAF6相比，二者均包含RING finger结构域和Coiled coil结构域，但AjTRAF7蛋白包含WD40重复片段，刺参TRAF6包含MATH结构域(Lu et al, 2013)。研究人员对水产物种TRAF7蛋白结构域进行了预测，发现半滑舌鳎、三角帆蚌、斜带石斑鱼和马氏珠母贝TRAF7蛋白均包含RING finger结构域和7个WD40重复片段，此外，三角帆蚌HcTRAF7蛋白包含1个锌指结构域和1个Coiled coil结构域，斜带石斑鱼EcTRAF7蛋白包含1个Coiled coil结构域，马氏珠母贝PmTRAF7蛋白包含Zinc finger TRAF-type profile (李坤明, 2019; 胡宸曦, 2020; 杨曼, 2018; 雷倩楠等, 2016)。AjTRAF7蛋白包含RING finger结构域与上述水产物种蛋白结构域一致。但AjTRAF7蛋白包含6个WD40重复片段，少于上述水产物种TRAF7蛋白结构域预测结果，TRAF7蛋白能够与MEKK3 (MAP kinase/ERK kinase kinase 3)特异性相互作用，并在激活NF-κB (nuclear factor-κB)过程发挥重要作用，TRAF7蛋白的WD40结构域可与c-Myb特定DNA结合域互作而发挥特定生物功能，AjTRAF7蛋白WD40重复片段的数量减少可能影响其功能(Bouwmeester et al, 2004; Xu et al, 2004; Morita et al, 2005; Tsitsikov et al, 2023)。AjTRAF7蛋白包含1个Coiled coil结构域，与三角帆蚌和斜带石斑鱼TRAF7蛋白结构域预测结果相同，研究提出TRAF7蛋白Coiled coil结构域参与非特异性免疫过程(胡宸曦, 2020; 杨曼, 2018; Fang et al, 2017)。与三角帆蚌HcTRAF7相比，AjTRAF7蛋白未预测到锌指结构，却预测到RING finger结构域，这2个结构域在信号转导过程中均极其重要(胡宸曦, 2020)。TRAF7蛋白的RING finger结构域具有E3泛素连接酶活性，可自身泛素化(Jackson et al, 2000)，并且该结构域在信号转导过程中起重要作用(Wajant et al, 2001)，TRAF7蛋白通过RING结构域促进TANK结合激酶1 (TANK-binding kinase 1, TBK1)的K48连接的泛素化负调控先天抗病毒免疫(Huang et al, 2023)。推测刺参中该蛋白具有信号转导功能，在刺参响应高温胁迫产生非特异性免疫过程中起到重要作用。

AjTRAF7在各组织中均有表达，说明AjTRAF7基因具有广泛的生物学功能。该基因在各组织间相对表达量差异显著，以体壁组织中基因表达量设定为标准值1.0，其在雌性性腺中相对表达量最高，体腔细胞次之，在呼吸树和肠道组织中的表达量较高，在雄性性腺和纵肌中的相对表达量较低。作为棘皮动物，刺参自身并不具备特异性免疫，只能依靠非特异性免疫(Rowley et al, 2007; Wang et al, 2015)，无脊椎动物的体腔细胞作为先天免疫反应的关键影响因子，介导了非特异性免疫反应(Fernanda et al, 2012)。AjTRAF7在雌性性腺中表达量最高，与该基因在三角帆蚌性腺中表达量最高的结果相似(胡宸曦, 2020)。AjTRAF7在体腔细胞中相对表达量较高，与刺参体腔细胞的非特异性免疫功能一致。AjTRAF7在体腔细胞中表达较高，与该基因在马氏珠母贝中主要分布在肝胰腺的结果相似，可能与二者均为免疫组织有关(雷倩楠等, 2016)。AjTRAF7基因在刺参呼吸树分布较高，与该基因在半滑舌鳎主要分布在鳃中及在马氏珠母贝主要分布在鳃中的结果较为相似，该组织均为呼吸相关组织，均为机体接触环境的一道屏障(李坤明, 2019; 雷倩楠等, 2016)。与石斑鱼主要分布在皮肤中的结果具有差异性，猜测可能与物种特异性有关，同时可能与生物生理状态差异有关(杨曼, 2018)。

TRAF7基因作为NF-κB通路相关基因调控非特异性免疫过程。本研究发现，AjTRAF7基因在高温胁迫过程中的表达量差异显著。这与已有研究中刺参受到高温胁迫后，应激防御相关基因被诱导表达，NF-κB通路相关基因表达水平受到影响的结论是一致的(霍达, 2020; 赵欢, 2011)。此外，TRAF7蛋白依赖不同结构域与对应结合域互作，通过相应的反馈模式参与多个家族信号转导并激活NF-κB和MAPKs在内的多个信号通路(Huang et al, 2023)，由于涉及多条通路，TRAF7基因在组织中的表达调控模式可能不同，关于高温胁迫后TRAF7基因具体的表达调控通路需要进一步研究。高温胁迫后AjTRAF7基因在体壁中表达模式结果显示，在胁迫后的第2天和第4天，基因表达显著上升(P < 0.05)，第6天上升不显著，第8天显著下降(P < 0.05)，该结果与石斑鱼、三角帆蚌和半滑舌鳎感染实验中该基因在感染前期上升后期下降的趋势相似(杨曼, 2018; 胡宸曦, 2020)。据此推测，在免疫调控前期，AjTRAF7基因在体壁中上调以响应高温胁迫，后期受长期高温胁迫，免疫力受到严重影响，刺参状态差且出现大量化皮现象，基因表达出现下降(Dong et al, 2007; Wang et al, 2008)。

综上，本研究克隆了刺参TRAF7 cDNA全长序列，并对该基因结构和表达模式进行分析。AjTRAF7在各组织中均有分布，在雌性性腺中相对表达量最高，在体腔细胞中次之。随着高温胁迫时间增加，该基因在体壁中呈现先上升后下降的调控模式，表明其可能参与刺参对于高温胁迫的响应过程，而具体的分子调控机制需要进一步研究。本研究结果可为刺参高温耐受机制研究和耐高温品种的培育提供一定参考。