2. 海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071
2. State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀ × Epinephelus lanceolatus♂)又称龙虎斑、珍珠斑，其肉质细腻、抗病力强、环境适应能力优秀，深受市场欢迎(胡金城, 2017; 相智巍等, 2023)。2022年石斑鱼年产量约为2.06万t (王丹等, 2023)。工厂化循环水养殖系统(RAS)具有节能减排、自动化、规模化及养殖效率高等诸多优点(蔡青霖等, 2023)，是珍珠龙胆石斑鱼目前主要的养殖模式。然而，由于对珍珠龙胆石斑鱼的适宜养殖密度不明确，常出现养殖密度过高造成的密度胁迫等问题。因此，选择何种适宜的养殖密度是工厂化养殖珍珠龙胆石斑鱼中亟待解决的重要问题。
现阶段，国内外关于鱼类密度胁迫的研究已有较多报道，且普遍认为养殖密度越高，鱼类的生长性能越差(李大鹏等, 2004; 薛宝贵等, 2013)。已有研究证明，密度胁迫会抑制哲罗鲑(Hucho taimen)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的生长(白庆利等, 2009; 江仁党, 2009; 郑乐云等, 2013; 陆可等, 2023)。过高密度的养殖会对鱼类造成胁迫，长期密度胁迫会导致鱼类消化能力降低、代谢异常以及内分泌紊乱(张曦文等, 2012; 程佳佳等, 2015)。研究表明，密度胁迫会对西伯利亚杂交鲟(Acipenser baerii♀ × Acipenser schrenckii♂)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)和草鱼(Ctenopharyngodon idella)造成氧化应激(赵大显等, 2022; Li et al, 2023; Zheng et al, 2024)。值得注意的是，氧化应激的发生往往伴随着机体消化代谢能力异常以及内分泌系统紊乱(Jing et al, 2018)。据报道，尖吻鲈(Lates calcarifer)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化酶的活性随着养殖密度增加而降低(Guo et al, 2017; Selvaram et al, 2022)。密度胁迫会导致美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)的多种代谢酶活性[磷酸果糖激酶(PFK)、果糖二磷酸酶(FBP)等]显著升高(Vijayan et al, 1990)。此外，密度胁迫会导致点带石斑鱼(Epinephelus coioides)和塞内加尔鳎(Solea senegalensis)内分泌调控受到干扰进而导致HPI轴相关激素分泌紊乱，血液皮质醇含量显著增加(Salasleiton et al, 2010; 逯尚尉等, 2011)。综上所述，适宜的密度对鱼类的生长和生理健康至关重要。
目前，关于工厂化养殖模式下密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼生长以及生理生化影响的研究甚少。因此，本研究通过设定3种养殖密度探究密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼生长、氧化应激、消化代谢酶活性和HPI轴激素分泌水平及基因表达的影响，以期为珍珠龙胆石斑鱼的集约化健康养殖提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验用鱼实验所用珍珠龙胆石斑鱼购于山东省日照市禹海红旗有限公司，鱼体无外伤、强壮健康，初始体重为(18.00±0.50) g，体长为(8.50±0.86) cm，共1 800尾。实验前于连续充氧的0.6 m3的养殖桶中暂养7 d以适应环境，暂养期间密度为(3.18±0.21) kg/m3。
1.2 实验设计实验在山东省日照市禹海红旗有限公司开展，养殖周期60 d。选用工厂化循环水养殖系统，源水采用砂滤海水。养殖桶高90 cm，半径50 cm (有效水体0.6 m3)，系统循环水量为600 L/h，每日补充新水量在系统最大水量的20%以下。保持水温(27±2) ℃，溶氧(8.0±1.0) mg/L，pH 7.8和盐度24±1，氨氮含量均保持在0.02 mg/L以下，每天记录饲料投喂量及死亡鱼数量。
实验设置3个密度梯度，低密度组(LD)每桶投放珍珠龙胆石斑鱼100尾，密度为(3.14±0.13) kg/m3；中密度组(MD)每桶投放珍珠龙胆石斑鱼200尾，密度为(6.31±0.13) kg/m3；高密度组(HD)每桶投放珍珠龙胆石斑鱼300尾，密度为(9.56±0.24) kg/m3，每组3个平行，共养殖60 d。每日早、晚(08:00, 17:00)按鱼体重的2.5%定量投喂沉降颗粒配合饲料(青岛福满堂海水仔稚鱼3#号配合饲料，粗蛋白≥53%，粗脂肪≥10%，粗灰分≤16%)。
1.3 样品采集实验期间，每20 d测定全部珍珠龙胆石斑鱼的体重、体长和全长。实验结束后，每桶取6尾鱼，共54尾，80 mg/L MS-222麻醉后于尾部静脉抽取血液，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，取上清液于–20 ℃保存待测。在冰上依次取珍珠龙胆石斑鱼脑、肝、肠、胃、肾组织，液氮速冻，随后转运至–80 ℃留存待测。
1.4 酶活性测定从实验室–80 ℃超低温冰箱中取出保存的脑、胃、肠、肝组织，将各组织分别准确称量0.1 g，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，制成10%的组织匀浆，将匀浆液放入离心机(2 500 r/min, 4 ℃, 离心10 min)，取上清液进行预实验，根据结果选择上清液直接检测或稀释一定倍数后测定。胃蛋白酶(PPS)、胰蛋白酶(TPS)、淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)及乳酸脱氢酶(LDH)活性，促肾上腺激素释放激素(CRH)、促肾上腺激素(ACTH)分泌水平，丙二醛(MDA)、皮质醇(CORT)含量检测所需试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司，测试方法按试剂盒说明书操作。
1.5 总RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR根据制造商的说明书，使用快速纯RNA试剂盒(Accurate Biology，湖北)从脑、肝、肾组织中提取总RNA。在1%琼脂糖凝胶上检测RNA降解，并使用Nano Drop 2000分光光度计(Nano Drop Technologies，美国)检查RNA浓度和纯度。按照制造商的说明书，使用Prime Script RT试剂盒从2 μg总RNA合成单链cDNA。cDNA模板储存在–80 ℃直到用于进一步分析。
表 1列出了用于评估HPI轴基因表达的引物。β-actin用作qRT-PCR内部对照。qRT-PCR数据通过LightCycler®480 Ⅱ使用SYBR Green Pro Taq HS(精确生物学)进行分析。qRT-PCR扩增在20 μL的总反应体积中进行。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Tab.1 Primers used in real-time PCR |
特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)、肥满度(K)、存活率(SR)和变异系数(CV)的具体计算公式如下：
| $ \begin{aligned} & \mathrm{SGR}(\% / \mathrm{d})=100 \times\left(\ln W_2-\ln W_1\right) /\left(t_2-t_1\right) \\ & K=\left(W / L^3\right) \times 100 \\ & \mathrm{FCR}=F /\left[\mathrm{n}\left(W_2-W_1\right)\right] \\ & \mathrm{SR}(\%)=D_2 / D_1 \times 100 \\ & \mathrm{CV}(\%)=(\mathrm{SD} / \mathrm{Mean}) \times 100 \end{aligned} $ |
式中，n为鱼尾数，F为总投饵量(g)，W1、W2为时间t1、t2时的平均体重(g)，W为鱼的重量(g)，L为鱼的体长(cm)，D1为初始存活数，D2为最终存活数，SD为该组鱼体重的标准差，Mean为该组鱼体重的平均值。
1.7 数据分析本实验所有数据以平均值±标准差(Mean±SD)形式表示，使用SPSS 22.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若具有显著差异，后使用邓肯法(Duncan´s)进行多重比较，显著水平设置为P < 0.05，数据结果使用Graph Pad Prime 7.0作图。
2 结果 2.1 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响如表 2所示。珍珠龙胆石斑鱼SGR、K和SR随养殖密度的增加呈下降趋势，FCR随养殖密度的增加呈上升趋势。HD组SGR和K均显著低于LD组(P < 0.05)，HD组的SR显著低于LD组和MD组(P < 0.05)。LD组FCR显著低于HD组(P < 0.05)。实验结束后，LD组、MD组及HD组终末密度分别为(15.48± 0.67)、(29.67±0.38)和(38.46±1.19) kg/m3。
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表 2 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响 Tab.2 Effect of density on the growth performance of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ |
密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼体重(Wt)和CV的影响如图 1所示。实验20 d时，LD组、MD组、HD组之间Wt差异不显著；40 d和60 d时，珍珠龙胆石斑鱼的Wt随密度增加呈下降趋势，MD组Wt显著高于HD组(P < 0.05)，显著低于LD组(P < 0.05)。实验20 d和40 d时，MD组和LD组CV无显著性差异，均显著低于HD组(P < 0.05)。60 d时，珍珠龙胆石斑鱼CV随密度增加呈上升趋势，MD组CV显著低于HD组(P < 0.05)，显著高于LD组(P < 0.05)。
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图 1 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼体重和体重变异系数的影响 Fig.1 Effect of density stress on weight and coefficient of variation of body weight of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ 不同英文字母表示差异显著(P < 0.05)，下同。 Different letters represent significant difference (P < 0.05), the same below. |
密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼消化酶和代谢酶活性的影响如图 2所示。消化酶活性随密度的增加呈下降趋势，LD组和MD组PPS活性无显著性差异，均显著高于HD组(P < 0.05)；MD组TPS、LPS和AMS活性均显著低于LD组(P < 0.05)，显著高于HD组(P < 0.05)。代谢酶活性随密度的增加呈上升趋势，LD组和MD组的PK和SDH活性无显著性差异，均显著低于HD组(P < 0.05)；MD组HK和LDH活性显著高于LD组(P < 0.05)，显著低于HD组(P < 0.05)。
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图 2 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼消化及代谢酶活性的影响 Fig.2 Effect of density stress on digestion and metabolic enzyme activities of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ |
密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化酶活性的影响如图 3所示。珍珠龙胆石斑鱼的抗氧化酶活性随密度的增长呈上升趋势，MD组珍珠龙胆石斑鱼肝脏MDA含量、SOD活性、CAT活性及GSH-Px活性显著高于LD组(P < 0.05)，显著低于HD组(P < 0.05)。
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图 3 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化指标的影响 Fig.3 Effect of density stress on antioxidant indexes of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ |
密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼HPI轴相关激素分泌的影响如图 4所示。珍珠龙胆石斑鱼HPI轴相关激素分泌水平随密度的增长呈上升趋势，MD组CRH分泌水平、ACTH分泌水平和CROT含量显著高于LD组(P < 0.05)，显著低于HD组(P < 0.05)。
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图 4 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼HPI轴相关激素分泌影响 Fig.4 Effect of density stress on the secretion of HPI axis related hormones of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ |
密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼HPI轴相关基因表达的影响如图 5所示。MD组珍珠龙胆石斑鱼的crhr1、nr3c1及nr3c2表达量显著高于LD组(P < 0.05)，显著低于HD组(P < 0.05)，而crh-bp表达量MD组显著高于HD组(P < 0.05)，显著低于LD组(P < 0.05)。
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图 5 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼HPI轴相关基因表达的影响 Fig.5 Effect of density stress on HPI axis related gene expression of E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂ |
Sharawy等(2022)研究发现，随着密度增加，鱼类生长速率降低，养殖密度和鱼类生长速率呈负相关关系。曹阳等(2014)研究表明，在高密度组(3.2 kg/m3)中俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedtii)的增重率(WG)和肥满度(K)显著低于中密度组(1.6 kg/m3)和低密度组(0.8 kg/m3)。黄宁宇等(2005)的研究也表明，瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的日增重、增长率及生长效率与密度呈负相关。本研究结果与上述研究一致，在60 d时，HD组珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的Wt、K和SGR显著低于MD组和LD组，并且其FCR显著高于LD组。结果表明，随着密度增加，珍珠龙胆石斑鱼种内空间和食物竞争加剧，导致摄入的能量更多地被消耗而非用于生长，从而生长缓慢。在高密度养殖模式下，具有生长优势的鱼会占据更多生存资源，并因此表现出较快的生长速度。然而，由于生长处于劣势的鱼竞争性差，无法获得更多的生存资源，导致其生长缓慢，最终鱼群产生更大的生长差异(Cutts et al, 1998)。在本研究中，实验20 d时各密度组珍珠龙胆石斑鱼的CV并未呈现出显著性差异。然而在实验40 d时，HD组CV显著高于LD组和MD组。实验60 d时，MD组CV显著高于LD组，显著低于HD组。这表明密度胁迫在一定程度上加剧了珍珠龙胆石斑鱼个体间的差异性。
3.2 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼消化代谢性能的影响消化酶作为鱼体内重要的酶类，在鱼类生长发育的过程中对其适应食物变化和摄取营养物质具有显著影响(Gisbert et al, 2009)。大量研究表明，密度胁迫会降低鱼类消化酶活性，在对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究中发现，随着养殖密度增加，其体内TPS和AMS活性呈下降趋势(乔玮等, 2014)；在对银鲳(Pampus argenteus)的研究中也发现，高密度组幼鱼的PPS、TPS和LPS活性显著低于其他密度组(孔煜夫等, 2023)；此外，在对鲤(Cyprinus carpio)、虹鳟和团头鲂(Megalobrama amblycephala)的研究中同样发现，鱼体内AMS活性随密度增加呈下降趋势(Trenzado et al, 2018; Adineh et al, 2019; Wang et al, 2019)。类似的，本研究中，珍珠龙胆石斑鱼体内的PPS、TPS、LPS、AMS活性均随着养殖密度的增加呈下降趋势。由此可见，密度胁迫可能在一定程度上对鱼类消化生理产生负面影响。研究表明，鱼类受到密度胁迫时会引起一系列生理反应，进而改变代谢酶的活性(Menezes et al, 2015)。PK和HK均为糖酵解过程中的关键限速酶，其活性改变对调控糖代谢有很大的作用，也反映了糖酵解的水平(陈婉情等, 2016)。SDH和LDH是动物体内有氧和无氧呼吸过程中重要的酶，当机体能量需求增加时，通过提升LDH活性来提供更多的能量(Zakhartsev et al, 2004)。本研究发现，珍珠龙胆石斑鱼代谢酶(PK、HK、LDH和SDH)活性均随着密度的增加呈上升趋势。这表明HD组珍珠龙胆石斑鱼在密度胁迫的影响下提高了机体内PK、HK、LDH和SDH的活性，这些酶活性的升高更可能是机体通过糖酵解获取更多的能量以应对强烈的应激胁迫。这与Vijayan等(1990)对美洲红点鲑以及余友斌等(2023)对大黄鱼(Larimichthys crocea)的研究结果类似，但王兴春(2021)研究发现，养殖密度对黄姑鱼(Nibea albiflora)谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、LDH等代谢酶的影响不显著，这可能是实验鱼规格、实验鱼品种和所设置密度的差异所致。
3.3 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼肝脏抗氧化指标的影响抗氧化防御系统在对机体的氧化应激进行抵抗时发挥着至关重要的作用(Wang et al, 2018)，其中SOD首先将产生于机体内的氧自由基分解为过氧化氢(McCord et al, 1969)，与此同时，SOD所生成的过氧化氢一方面被CAT还原成氧分子和水(Rudneva et al, 1997)，另一方面则被GSH-Px消除。此外，GSH-Px还能清除体内脂质过氧化物(Arthur, 2000)，以维持机体的正常生理活动并阻断氧化应激对机体的进一步损伤。本研究中，HD组珍珠龙胆石斑鱼的SOD、CAT和GSH-Px 3种指标均显著高于其他密度组，这与之前对黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)和豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)的研究结果一致(林琳等, 2017; 孙鹏等, 2023)，表明密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼的抗氧化系统造成一定影响，需要机体提供更多的抗氧化酶以对抗密度胁迫所带来的氧化损伤，从而免受应激伤害。此外，MDA含量的变化能反应生物体内脂质过氧化程度，脂质过氧化被认为是细胞氧化损伤的重要标志之一(Zhang et al, 2018)。本研究发现，珍珠龙胆石斑鱼机体MDA含量与养殖密度呈正相关，这与陶俊合(2023)对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)以及宋志飞(2015)对俄罗斯鲟的研究结果一致。这也进一步说明了密度胁迫在一定程度上导致了珍珠龙胆石斑鱼氧化应激反应。
3.4 密度胁迫对珍珠龙胆石斑鱼HPI轴的影响CRH是下丘脑在应激胁迫下释放的一种多肽，刺激垂体产生ACTH，ACTH又刺激肾上腺产生CORT，CORT是鱼类应激状态下HPI轴中分泌的一种重要的应激相关激素，其含量会在外界环境刺激下迅速升高(张伟等, 2014)。已有研究表明，在密度、盐度、低氧、重金属暴露、细菌感染等各种环境应激因素作用下，硬骨鱼体内CRH、ACTH和CORT的含量及mRNA表达水平均显著增加(Craig et al, 2005; Bernier et al, 2012; Madison et al, 2013; Choi et al, 2015; Hou et al, 2019)。在本研究中，珍珠龙胆石斑鱼的CRH、ACTH和CORT分泌水平随着养殖密度的增加而显著上升，这与对花斑溪鳉(Kryptolebias marmoratus)的研究结果一致(Amano et al, 2022)。此外，Jia等(2016)报道大菱鲆血浆中CRH、ACTH和CORT水平随着氨氮胁迫时间和浓度的增加而上升，说明大菱鲆的HPI轴被激活。这些结果表明，密度胁迫会导致珍珠龙胆石斑鱼应激激素的合成与分泌，从而激活了HPI轴，导致了机体氧化应激。
CRH受体主要有crhr1和crhr2两种不同基因编码的亚型组成，其中，crhr1基因在中枢神经系统表达丰富，能够调动机体各系统应答应激，介导CRH对ACTH分泌的刺激作用，诱导ACTH释放入血，最终导致糖皮质激素分泌(Aguilera et al, 2004)。crh-bp基因对CRH发生的应激反应活性起着重要负调节作用(Seasholtz et al, 2002)；nr3c1和nr3c2基因有维持糖皮质激素合成的作用(罗应杰等, 2017)。在本研究中，HD组珍珠龙胆石斑鱼crhr1、nr3c1和nr3c2表达量均显著性上调，crh-bp基因表达量显著下调，这与对塞内加尔鳎的研究结果相似(Yvette et al, 2011)。此外，斑马鱼(Danio rerio)在急性应激状态下crhr基因表达显著上调(Gabriele et al, 2012)。类似的研究表明，HD组在应激状态下，CRH和CORT分泌旺盛，crhr1作为中央神经系统中ACTH的主要受体之一(Vaughan et al, 1995)，其基因表达量随之显著上调，诱导ACTH释放入血，调动机体各系统增加机体能量应对应激环境。nr3c1和nr3c2基因作为糖皮质激素的主要受体基因，能调控CRH的持续产生(张岫竹等, 2005)。本研究中，HD组由于长期受密度胁迫影响，HPI轴被激活，血液中CORT水平远高于其他组，因此，HD组珍珠龙胆石斑鱼nr3c1和nr3c2基因表达量显著上调。CRH-BP作为CRH的抑制剂，能够阻断由CRH介导的ACTH在小鼠垂体前叶细胞中的分泌以保持其内分泌轴的稳定(Potter et al, 1991)，本研究中，crh-bp表达量的下调可能是由于长时间的应激干扰了CRH-BP的反馈机制，导致了HPI轴相关激素分泌及相关基因表达的紊乱。
4 结论综上所述，密度胁迫不仅会导致珍珠龙胆石斑鱼饵料系数升高、生长性能降低、个体之间体重差异扩大，还会引发一系列的生理变化，主要表现为消化酶活性降低、代谢酶活性升高、氧化应激加剧和HPI轴激活。本研究结果可为工厂化循环水养殖珍珠龙胆石斑鱼养殖密度的制定提供理论参考。
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