2. 中国农业科学院 北京 100081
2. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
水产养殖集约化与多样化为养殖动物病毒性疾病的暴发提供了便利条件，在过去20年里，重大和新发虾类传染病的传播对全球对虾养殖业构成了严重威胁。其中，由传染性肌坏死病毒(infectious myonecrosis virus，IMNV)引发的传染性肌坏死(infectious myonecrosis，IMN)于2020年传入我国境内引发疫情(Wan et al, 2023)，导致北方沿海养殖对虾遭受了严重产量损失。
IMN最早发生于2002年巴西东北部皮奥伊州的凡纳对虾养殖场，患病对虾腹节骨骼肌出现局部或弥散状白色坏死病灶，部分对虾坏死的肌肉会变红，坏死肌肉内主要的病理变化为肌肉组织中出现凝固状坏死、血细胞浸润和淋巴器官球状体异位等，其时美国亚利桑那大学研究者对这种新疾病进行了跟踪研究，并证实该病的病原体为IMNV (Tang et al, 2005)。2006年，印度尼西亚多地养殖凡纳对虾出现腹节肌肉不透明和发白等类似IMN的症状，随后被证实为IMNV感染(Senapin et al, 2007)。此后，IMN在印度尼西亚的东爪哇岛、巴厘岛和西爪哇岛等主要对虾养殖地区被报道(Taukhid et al, 2009)。2016—2021年间，IMNV先后传入印度和埃及，并引起当地养殖凡纳对虾发病(Sahul Hameed et al, 2017; Aly et al, 2021)。IMNV的传播、扩散开始引起全球主要对虾养殖国家的广泛关注，目前该病已被世界动物卫生组织(WOAH)收录为需通报的疾病。
IMNV粒子为二十面体，直径约为40 nm，在氯化铯中浮力密度为1.366 g/mL (Poulos et al, 2006)，病毒具有一个等轴衣壳，该衣壳由120个亚单位组成(Tang et al, 2008)。病毒基因组由一个7 561~8 230 bp的双链RNA分子组成(闫冬春等, 2009; Poulos et al, 2006)，病毒基因组中有2个非重叠开放阅读框架(ORFs) (Tang et al, 2008)：ORF1前半部分编码一个RNA结合蛋白，后半部分编码一个分子质量约为106 kDa的衣壳蛋白；ORF2编码一个RNA依赖的RNA聚合酶(Senapin et al, 2007)。
IMNV的主要易感宿主包括凡纳对虾、虎纹对虾(P. esculentus)、墨吉对虾(P. merguiensis)和南方褐虾(Farfantepenaeus subtilis) (Coelho et al, 2009)。另外，斑节对虾(P. monodon)、细角滨对虾(P. stylirostris)为IMNV的疑似易感宿主，但目前有关这2种对虾满足WOAH《水生动物法典》中对易感宿主定义的资料尚不完整(Tang et al, 2005)。卤虫是确认的IMNV传播媒介生物(Iunes et al, 2021)，双壳类和多毛动物被认为是IMNV传播的可能媒介载体(AAHED Advisory, 2019)。IMNV在海鸟肠道和粪便中可能仍有传染性，并通过海鸟粪便或病虾残体在养殖场内和养殖场之间传播(Vanpatten et al, 2004)。迄今为止，IMNV仅在养殖对虾中被报道，其在野生种群中的存在尚未得到证实(WOAH, 2021)。不同生长阶段的对虾，包括早期幼体、幼体、仔虾以及生长期对虾等均可被IMNV感染。IMNV还可与罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)共同感染凡纳对虾(Oktaviana et al, 2014)，且不同病毒之间会发生竞争，如感染WSSV的对虾体内IMNV的载量较低(de Freitas et al, 2024)。IMNV可通过患病个体间的蚕食行为或经病原污染的水体进行水平传播，自然感染IMNV的雄性对虾个体的精子细胞存活率低，且感染IMNV的雌虾卵巢阳性率为100%，因此，通常认为母本是IMNV垂直传播的源头(Jha et al, 2021)。
Utomo等(2023)开展了益生菌防控IMNV感染研究，发现应用益生菌合成制剂可增强对虾对IMNV感染的抵抗能力。但从实践角度看，对虾疾病发生后的治疗效果往往不佳，而开展广泛流行病学调查，查明病原分布和流行规律，在此基础上研发可检测所有株系的检测方法进行早期检测和预警，可能才是应对包括IMNV在内的对虾病原扩散和危害的高效策略(Chaivisuthangkura et al, 2013)。
作者实验室通过系统调查研究发现，IMNV变种(CN-20-1)可能经由被染病的IMNV亲体自泰国传入我国，2020年导致辽宁对虾养殖遭受了IMN冲击(Wan et al, 2023)。为查明IMNV在我国养殖对虾中流行的趋势，本研究2022—2023年间开展沿海省市养殖对虾IMNV流行病学调查，对采集来自山东、江苏、浙江、海南、天津、广西、福建、河北等地的829份样品进行分子生物学与组织病理学分析，以期为我国养殖对虾IMN防控提供第一手的流行病学基础资料。
1 材料与方法 1.1 样品采集对于虾类样品，在养殖现场用一次性解剖刀将虾类头胸部沿着中心均分切成2份，取1/2头胸部和尾节肌肉保存在4%多聚甲醛溶液(4% PFA)中用于后续组织病理学分析，剩余头胸部与尾部肌肉切碎混匀保存于RNA Later固定液(天根生物，中国)中，用于IMNV分子生物学检测。
对于其他物种样品，用一次性解剖刀将其切碎后取组织混样，并保存于RNA Later固定液中，用于IMNV分子生物学检测。
养殖用水样品则采用便携式eDNA采样器(Smith-Root，美国)进行抽滤，其中滤膜的孔径大小为0.45 μm，抽滤结束后，将滤膜保存于RNA Later固定液中，用于IMNV分子生物学检测。
1.2 RNA提取和纯化用无菌的镊子或牙签取出保存于RNA Later中的样品组织，放入1.5 mL的无菌无酶离心管中用RNase-free H2O清洗，用吸水纸吸去多余水分后采用RNAiso plus (TaKaRa，中国)法抽提样本的总RNA；最后，利用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific，美国)测量所制备RNA的浓度和纯度。
保存于RNA Later固定液的滤膜用QiaGen公司的Allprep DNA/RNAMini Kit进行RNA提取，RNA浓度和纯度的检测方法同上。
1.3 利用TaqMan RT-qPCR方法检测样品中IMNV采用WOAH《水生动物诊断试验手册》(2021)中IMNV的TaqMan RT-qPCR的引物与探针(表 1)检测样品中的IMNV。反应体系为20 μL。各组分及用量如下：一步法预混液15.04 μL (立见生物，中国)，引物IMNV-412F (10 μmol/L) 0.4 μL，引物IMNV-545R (10 μmol/L) 0.4 μL，探针IMNV-p1(10 μmol/L) 0.4 μL，RNA-free H2O 2.76 μL，核酸模板1 μL。在冰上配制反应体系。利用QuantStudio3实时荧光定量PCR仪进行TaqMan RT-qPCR扩增，扩增前模板95~100 ℃加热3~5 min。反应程序：50 ℃保温5 min进行反转录；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，变性延伸共40个循环。病毒拷贝数根据此前建立的标准曲线公式计算(赵文秀, 2023)。
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表 1 IMNV TaqMan RT-qPCR的引物和探针序列 Tab.1 Primer and probe sequences of IMNV TaqMan RT-qPCR |
不同年份不同地区样品中IMNV阳性检出率计算公式为：
| $ \frac{\text { 某年份某地区IMNV阳性的样品数 }}{\text { 该年份该地区的总样品数 }} \times 100 \% $ |
不同年份不同种类样品中IMNV阳性检出率计算公式为：
| $ \frac{\text { 某年份某种类IMNV阳性的样品数 }}{\text { 该年份该种类的总样品数 }} \times 100 \% $ |
选取TaqMan RT-qPCR检测呈阳性的样品进行组织切片病理学观察。具体步骤：样品置于4% PFA组织固定液中固定12~24 h，然后转移至70%乙醇中，按照组织样本处理标准流程，对样本进行脱水、包埋和切片处理，制备组织病理切片(Bell et al, 1988)。根据常规组织切片染色方法(Zhang et al, 2005)对切片进行苏木精–伊红(HE)染色，随后利用Nikon Eclipse E80i显微镜(Nikon，德国)对组织切片进行观察和拍照。
1.6 原位杂交分析参照Wan等(2023)报道的方法制备IMNV的RNA探针，并利用IMNV的RNA探针和组织切片进行组织原位杂交(ISH)和显色，对原位杂交显色后的切片进行核固红复染和封片，然后，在Nikon Eclipse E80i显微镜下进行观察(Liu et al, 2017)。
2 结果与分析 2.1 样品采集情况|
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表 2 样品采集省市及数量信息 Tab.2 The distribution of sampling sites and amount of samples |
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表 3 虾类样品种类及数量信息 Tab.3 The information of the type and number of shrimp samples |
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表 4 水产经济物种生物种类及数量信息 Tab.4 The information of other seafood organism species and population |
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表 5 样品采集月份及数量信息 Tab.5 Information on the month and number of samples collected |
2022年从山东、江苏、浙江、海南、天津和广西及其临近海域共采集样品367份(表 2、表 5)，其中凡纳对虾、罗氏沼虾、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、鹰爪虾(Trachypenaeus curvirostris)和斑节对虾等虾类样品276份(表 3)，其他生物包括对虾饵料生物，如环节动物门的双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)；近海海洋动物，如脊索动物门的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、木叶鲽(Pleuronichthys cornutus)、海鲢(Elops saurus)、小黄鱼(Larimichthys polyactis)以及软体动物门的菲律宾帘蛤(Ruditapes philippinarum)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、贻贝(Mytilus edulis)、魁蚶(Anadara broughtonii)、红皱岩螺(Rapana venosa)、短蛸(Octopus ocellatus)、中国枪乌贼(Loligo chinensis)等样品91份(表 4)。
2023年从山东、海南、天津、福建和河北等地及其临近海域共采集462份样品(表 2、表 5)，其中凡纳对虾、日本对虾、中国对虾、鹰爪虾、斑节对虾与虾蛄(Oratosquilla oratoria)等虾类样品356份(表 3)，其他生物包括对虾饵料生物，如节肢动物门的中华卤虫(Artemia sinica)、环节动物门(Annelida)的双齿围沙蚕、原腔动物门(Protocoelomata)的褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)；近海海洋动物，如脊索动物门的银鲳(Pampus argenteus)、绿鳍鱼Chelidonichthys kumu)，节肢动物门的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、赤甲红(Charybdis japonica)，软体动物门的强肋锥螺(Turritella fortilirata)、猫眼蝾螺(Turbo petholatus)、贻贝、文蛤(Meretrix meretrix)、毛蚶(Scapharca kagoshimensis)、菲律宾帘蛤、太平洋牡蛎、皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、红皱岩螺、缢蛏(Sinonovacula constricta)、真蛸(Octopus vulgaris)、中国枪乌贼，以及海水等样品共计106份(表 4)。
2.2 凡纳对虾IMNV感染临床症状图 1是采集自河北黄骅对虾养殖场的凡纳对虾，TaqMan RT-qPCR检测显示，图 1A凡纳对虾个体为IMNV阴性，图 1B凡纳对虾个体为IMNV阳性。如图 1所示，图 1A的凡纳对虾无明显的IMNV感染临床症状，图 1B的凡纳对虾个体腹节肌肉弥散状坏死(图 1B，白色箭头处)且尾节肌肉发白坏死，呈现明显的IMNV感染临床症状。
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图 1 患IMN凡纳对虾临床症状
Fig.1 Clinical symptoms of IMNV infection in P. vannamei
A：患病凡纳对虾(样品编号：20230227007)外观图片；B：患病与健康凡纳对虾对比图：样品编号：上20230227006(患病)、中20230227016(健康)、下20230227007(患病)。 图A凡纳对虾腹节(含尾节)肌肉呈弥散状坏死。图B上下2尾凡纳对虾尾节(白色箭头处)肌肉坏死，呈现发白症状。图B中间位置的凡纳对虾的腹节及尾节(黄色箭头处)透明，无明显的临床症状。 A: External image of diseased P. vannamei (Sample No: 20230227007); B: Comparing images of healthy and diseased P. vannamei: Sample No: Upper 20230227006(diseased), Middle 20230227016 (healthy), Lower 20230227007 (diseased). In Fig.A, the abdominal segment (including the telson) muscles of the shrimp show diffuse necrosis, with the muscles at the white arrow appearing distinctly white and necrotic. In contrast, the P. vannamei at the top and bottom sites in Fig.B exhibit a pale body color, with the tail segment (white arrow) having white, opaque muscle tissue, showing a diffuse pattern of necrosis. In the middle shrimp in Fig.B, the tail segment of P. vannamei (yellow arrow) is transparent, with no apparent clinical symptoms. |
对流行病学调查中所采集的样品进行TaqMan RT-qPCR检测，并将样品检测结果按照采样年份和区域进行分析，结果如图 2所示。2022年不同省市样品中IMNV阳性检出率分别为：天津16.95% (10/59)、山东10.66% (13/122)、江苏0.00% (0/50)、浙江0.00% (0/48)、海南0.00% (0/52)和广西0.00% (0/36)；2023年不同省市样品中IMNV阳性检出率分别为：河北23.64% (13/55)、天津26.09% (12/46)、山东14.83% (47/317)、福建0.00% (0/23)和海南4.76% (1/21)。
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图 2 2022—2023中国不同省份IMNV阳性检出率 Fig.2 The IMNV positive detection rates in different provinces of China in 2022–2023 |
从不同地理区域来源样品的检测结果看，河北、天津和山东等环渤海省市主要对虾养殖地区2022年IMNV的阳性检出率为16.83%(17/101)，而2023年1—4月该病毒阳性检出率增长为59.54% (78/131)，这说明IMNV已在环渤海对虾养殖地区普遍流行。同时，2023年采集自海南的对虾样品中开始出现IMNV阳性检出。
2.4 IMNV流行物种分析对流行病学调查中所采集的样品进行TaqMan RT-qPCR检测，将样品检测结果按照所采集的虾类品种进行分析，结果如图 3所示。2022年多种虾类样品的IMNV阳性检出率如下：凡纳对虾13.77% (23/167)、罗氏沼虾0.00% (0/91)、脊尾白虾0.00% (0/7)和鹰爪虾0.00% (0/7)；2023年多种虾类品种样品中IMNV阳性检出率如下：凡纳对虾13.85% (45/325)、日本对虾87.50%(7/8)、中国对虾66.67% (4/6)和鹰爪虾0.00%(0/5)。
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图 3 2022—2023多种虾类品种IMNV阳性检出率 Fig.3 The IMNV positive detection rates for multiple shrimp species in 2022–2023 |
对流行病学调查中所采集的样品进行TaqMan RT-qPCR检测，将样品检测结果按照生物分类学进行分类后分析，结果如图 4所示。2022年多种水产品样品中IMNV阳性检出率均为0.00%的样品种类，包括环节动物门(0/20)、脊索动物门(0/32)、软体动物门(0/39)。其中环节动物门的样品种类为双齿围沙蚕(0/20)，脊索动物门的样品种类包括半滑舌鳎(0/5)、木叶鲽(0/6)、海鲢(0/15)和小黄鱼(0/6)，软体动物门的样品种类包括红皱岩螺(0/7)、贻贝(0/6)、魁蚶(0/6)、菲律宾帘蛤(0/6)、太平洋牡蛎(0/6)、短蛸(0/6)和中国枪乌贼(0/2)。
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图 4 2022—2023多种水产经济物种IMNV阳性检出率 Fig.4 The IMNV positive detection rates for multiple fish products in 2022–2023 |
2023年多种水产品样品中IMNV阳性检出率如下：节肢动物门33.33% (5/15)、海水80.00% (12/15)，其余样品的IMNV阳性检出率均为0.00%，包括环节动物门(0/3)、原腔动物门(0/1)、脊索动物门(0/4)、软体动物门(0/68)。其中，节肢动物门的样品种类为中华卤虫66.67%(2/3)、三疣梭子蟹42.86%(3/7)和赤甲红0.00% (0/5)，环节动物门的样品种类为双齿围沙蚕(0/3)，原腔动物门的样品种类为轮虫(0/1)，脊索动物门的样品种类为银鲳(0/2)、绿鳍鱼(0/2)，软体动物门的样品种类为锥螺(0/5)、猫眼蝾螺(0/5)、红皱岩螺(0/3)、贻贝(0/14)、文蛤(0/5)、毛蚶(0/5)、菲律宾帘蛤(0/6)、太平洋牡蛎(0/5)、皱纹盘鲍(0/3)、缢蛏(0/10)、真蛸(0/2)和中国枪乌贼(0/5)。
2.5 患病对虾的组织病理学观察及原位杂交分析对在TaqMan RT-qPCR检测中呈IMNV阳性的虾类样品进行组织病理和原位杂交分析。组织病理切片经HE染色的结果显示，患病凡纳对虾尾节肌肉组织发生凝固状样坏死(图 5A、B)，并伴随有核固缩现象(图 5B)；ISH分析结果显示，在肌肉坏死病灶部位可观察到大量IMNV探针的蓝紫色杂交信号(图 5C、D)。
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图 5 凡纳对虾尾节肌肉的组织病理及原位杂交图片 Fig.5 Histopathology and in situ hybridization (ISH) analysis of the caudal ganglion muscles of P. vannamei A：凡纳对虾(样品编号：20230227007)尾节肌肉的组织病理切片(HE染色)；B：图A中方框内肌肉严重坏死区域局部放大5倍后的图片，可见肌肉呈现凝固状坏死(白色箭头)和核固缩现象(黄色长箭头)；C：凡纳对虾尾节肌肉组织的原位杂交图片，蓝紫色示IMNV探针的杂交信号；D：图C中方框内肌肉严重坏死区域局部放大5倍后的图片，可见肌肉坏死区域有大量蓝紫色IMNV探针的阳性杂交信号。 A: Histopathological sections of P. vannamei (Sample No: 20230227007) tail segment muscle (HE staining); B: Local magnification (5×magnification) of the severely necrotic area of the muscle in Fig.A, the muscle shows coagulated necrosis (white arrow) and nuclear pyknosis (long yellow arrow).; C: ISH images of P. vannamei tail segment muscle tissue; D: Local magnification (5×magnification) of the severely necrotic area of the muscle in Fig.C, shows positive hybridisation signals of the blue-violet IMNV probe in the area of muscle necrosis. |
在过去的十多年里，随着养殖规模的快速扩张，我国养殖虾类新疫病不断出现。包括病毒性偷死病(VCMD)(Zhang et al, 2014)[也称作持续性死亡综合征(running mortality syndromes，RMS)]、急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)(黄桂仙等, 2024)虾肝肠胞虫病(Enterocytozoon hepatopenaei disease，EHPD)(刘珍等, 2016；余星潼等, 2024)、十足目虹彩病毒病1 (decapodiridescent virus 1，DIV1，早期被称作shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)(Srisala et al, 2021; Qiu et al, 2017)玻璃苗弧菌病(translucent post-larvae disease，TPD)(Zou et al, 2020)等在内的新发疫病先后在我国养殖对虾中出现，给养殖对虾业绿色高质量发展造成了严重影响。但截至2020年初，我国养殖对虾中尚未见有IMN发生或危害的报道(Wan et al, 2023)。
IMN最早在南美洲养殖对虾中发生，其病原IMNV目前已传播至美洲、亚洲和非洲的多个对虾养殖国家并引发严重IMN疫情，使当地养殖对虾遭受重大经济损失。IMNV在巴西出现后，当地养殖对虾产量下降了40% (de Andrade, 2016)；2006年扩散至印度尼西亚后，在当地对虾养殖规模不断扩张的情况下，也引起对虾总产量下降了38% (De Andrade, 2016)。2016年以来，巴西的帕拉州、马拉尼昂州、皮奥伊州、塞拉州、北里奥格兰德州、阿拉戈亚州、塞尔吉普州和巴伊亚州等地养殖对虾出现了新的IMNV毒株，相比于早期IMNV毒株，其导致患病对虾更快死亡且死亡率更高(累积死亡率可达80%) (Andrade et al, 2022)。2016年，印度西孟加拉邦、泰米尔纳德邦等对虾养殖地区发生了较大规模的IMN疫情，患病对虾呈现典型IMN症状，发病池塘对虾死亡率为20%~50% (Suryakodi et al, 2022)；2019年，印度安得拉邦和泰米尔纳德邦的患病对虾在套式PCR第1轮检测中即呈现IMNV强阳性，患病对虾呈现典型IMN症状(Jithendran et al, 2021)。2020年，辽宁丹东市一对虾养殖场被证实发生了严重的IMN病害，这是我国养殖凡纳对虾中首次出现IMN疫情(Wan et al, 2023)。2021年，IMNV被证实已传播到了非洲，埃及毗邻地中海沿岸的2个省(Damietta和North Sinai)的多个对虾养殖场患病对虾表现出典型的IMN症状(Aly et al, 2021)。IMNV在全球的广泛传播，给多个对虾养殖国家带来严重的水生生物安全威胁，开始引起世界主要对虾养殖国家和地区的重视。
本研究针对我国主要虾类养殖地区的IMNV流行病学调查结果表明，采集自环渤海地区包括山东、河北和天津等省市的水产动物样品中可以检测出IMNV，除环渤海地区外，采集自海南的对虾样品中也检测到IMNV阳性。作者实验室前期研究发现，截至2021年底我国境内IMNV尚未在除辽宁外的对虾养殖区大范围扩散(Wan et al, 2023)。本研究的结果表明，IMNV在环渤海地区已扩散至河北、天津和山东等地，并在海南养殖对虾中流行和存在，说明IMNV已在环渤海对虾养殖地区普遍流行。作者在流行病学现场调查中发现，2022—2023年IMN在河北、天津和山东等省市多地持续发生，如2022年冬，河北和天津海水工厂化养殖凡纳对虾中IMN发生率超过90%；2023年春夏季受IMN疫情冲击，山东东营海水工厂化对虾养殖场IMN发生率超过80%，当年大部分海水工厂化对虾养殖场转产或停产。IMNV在环渤海地区的广泛传播和危害，使该地区1 333 km2以上养殖对虾面临巨大的IMN疫情暴发风险。尽管本研究未在2022—2023年采集自江苏、浙江、福建和广西等省市的样品中检测到IMNV阳性，但考虑到河北、天津和山东对虾育苗企业规模不断扩张，该病毒通过苗种销售扩散至我国沿海和内陆其他对虾养殖地区的风险仍不容忽视。
本研究的结果显示，2022年所采集的样品中IMNV阳性检出率为6.27% (23/367)，2023年所采集的样品中IMNV阳性检出率为15.80% (73/462)。相较于2022年，2023年的IMNV阳性检出率显著升高，这说明IMNV仍在快速传播，未来其流行范围可能会进一步扩大，流行率也可能会持续上升。从不同种类样品中IMNV的阳性检出率来看，2022年IMNV主要在凡纳对虾中检出13.77% (23/167)，2023年情况发生了明显变化，日本对虾和中国对虾中阳性检出率最高，分别为87.50% (7/8)和66.67% (4/6)，凡纳对虾样品中IMNV阳性检出率仍维持在13.85% (45/325)。除了对虾外，重要海水养殖甲壳类如三疣梭子蟹以及重要饵料生物中华卤虫中也有IMNV阳性检出，考虑到三疣梭子蟹的生态位以及中华卤虫在甲壳类生产中的重要作用，二者携带进而传播IMNV的风险不容忽视。
调查中发现，山东、河北和天津等地海水工厂化养殖对虾IMN的发生与渤海近岸海水被IMNV污染有密切关系。本研究通过对渤海湾海水的检测，发现养殖用水在IMNV检测中呈现阳性。2022年夏秋季，渤海毗邻的山东滨州和东营养殖对虾中开始出现IMN疫情，到2023年4月初，渤海毗邻滨州、东营的近岸海水(养殖场进水口)中IMNV浓度约在371拷贝/μL RNA (折合14.8拷贝/mL海水)—58 100拷贝/μL RNA (折合2 324拷贝/mL海水)之间。调查中还了解到，山东滨州和东营使用渤海近岸海水的对虾工厂化养殖场发生IMN疫情的比例超过80%，而使用地下水的对虾工厂化养殖场发生IMN疫情的比例不到20%。上述检测和调查结果说明，海水(或其浮游生物、悬浮物等)中可能有残留的活性IMNV能引起对虾感染。联合国粮农组织(Tang et al, 2019)印发的《对虾IMNV防控手册》中指出，IMN发病池塘养殖水体需要经过50 mg/L氯制剂消毒方可向环境中排放，避免IMNV随水体排放到环境中造成扩散。本研究关于养殖海水中IMNV高拷贝检出的结果以及联合国粮农组织指导意见表明，我国对虾养殖从业者也需要高度关注对虾养殖废水排放所导致的IMNV传播扩散风险。
本研究还在用作凡纳对虾饵料的中华卤虫样本中检测到IMNV阳性，这表明IMNV有较大的可能感染中华卤虫或被其携带；中华卤虫是重要的对虾饵料，中华卤虫样品中IMNV阳性检出提醒养殖从业者将来也需关注中华卤虫传播IMNV的风险。对鱼类、贝类以及螺类样品进行IMNV的TaqMan RT-qPCR检测发现，这些样品中均未检测到IMNV阳性，初步判断这些种类不是IMNV传播扩散的重要媒介。
综上所述，IMNV已扩散到环渤海主要对虾养殖省市以及海南省，导致养殖对虾遭受了重要经济损失，使我国对虾养殖生物安全面临新的威胁。为遏制IMN疫情快速传播势头，最大限度降低IMN对我国养殖对虾产业的影响，保障对虾种业和养殖过程安全，建议渔业主管部门和养殖从业者强化IMNV检测与监测预警，注意养殖用水消毒处理，防止海水以及饵料生物传播IMNV所致的IMN疫情扩散和持续流行危害风险。
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