2. 海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071;
3. 大连海洋大学水产与生命学院辽宁 大连 116023;
4. 中国海洋大学水产学院 山东 青岛 266001
2. State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China;
3. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China;
4. Fisheries College, Ocean University of China, Qingdao 266001, China
凡纳对虾(Penaeus vannamei)是我国养殖产量最高的对虾品种，具有生长速度快、营养价值和出肉率高等优点，占据水产品市场重要地位(Xu et al, 2022)。由于养殖密度大、投饵量高，水体富营养化逐渐成为对虾养殖面临的主要问题之一(张树等, 2017)。浮游植物的结构和分布会影响整个水体的生态系统(陈学杨等, 2024)，其中，蓝藻由于喜肥耐污等特性，极易在氮磷水平高的水环境中大量繁殖，引发藻华(李媛, 2023)。蓝藻水华往往能够产生有毒的代谢物，其中，微囊藻毒素(microcystins，MCs)是威胁最大的一种(张紫馨等, 2023)。养殖水体中的MCs含量已成为评价池塘水质和水产品质量安全的重要指标(常孟阳等, 2019)。目前发现了多种MCs的异构体，分布最广泛和毒性最强的是微囊藻毒素-LR (MC-LR)。诸多研究表明，MC-LR对鱼、虾、蟹等水生生物有巨大的致毒效应，并可通过直接接触、饮用水、食物链等方式影响陆地生物及人体健康，造成食品安全风险(陈妍妍, 2016; 娄厚顺, 2018)。
肝胰腺是甲壳类动物应对不良环境进行解毒代谢的关键器官，在机体免疫反应过程中发挥重要作用(Rőszer, 2014)。MCs具有嗜肝性，进入机体后会在肝胰腺中高度积累(Chen et al, 2005)。在病理组织学研究中，MC-LR会引起肝胰腺细胞破裂、肝小管萎缩、结缔组织消失等病变，导致肝功能受损(汪艳昭等, 2022)。同时，MC-LR能够刺激氧化应激、诱导细胞凋亡、影响免疫酶活性，给对虾肝胰腺造成多种损伤(曹清晟等, 2020; 黄兰英等, 2022a; 贾滢暄等, 2023)。许多学者已经从多个方面阐述了MC-LR的毒理作用，但其潜在的分子生物学过程仍然十分复杂，在凡纳对虾中可能涉及多个信号通路的改变。
近年来，基因组学和生物信息学飞速发展，高通量测序技术越来越成熟，科研人员利用转录组学分析复杂的分子响应机制也越来越普遍，这也为深入阐明MCs对甲壳动物的毒理学机制提供了有效的技术手段。傅一鸣等(2015)采用Illumina Hiseq 2500测序平台，对凡纳对虾注射MC-LR前后进行了基因的表达和基因功能富集分析，发现对虾细胞免疫在染毒过程中起到了重要作用；Zhang等(2020)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)应对MC-LR胁迫进行了转录组分析，筛选到23个免疫相关基因和21个氧化还原相关基因；Chi等(2022)通过检测差异表达的基因，初步揭示了MC-LR胁迫对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肝脏脂质代谢、免疫和细胞凋亡等方面的分子机制。但迄今为止，利用转录组全面分析MC-LR胁迫下凡纳对虾响应机制的文献报道依然较少。
目前的诸多对虾急性染毒实验，大都采用血窦注射或肌肉注射的方法(邓义佳等, 2018; 黄兰英等, 2022b)，但这些方法可能会给对虾造成不同程度的组织创伤，引起基因表达的显著变化。有研究显示，凡纳对虾肌肉注射染菌后，大量血细胞会聚集于伤口部位，且注射部位的溶菌酶表达量会在早期显著升高，并且持续至少48 h (Burge et al, 2007)。血细胞是甲壳动物细胞免疫反应的主要场所，其功能作用包括吞噬作用、产生活性氧中间体以及创伤修复等(Fontaine et al, 1973; Martin et al, 1996; Muñoz et al, 2000)，因此，部分免疫指标可能由于注射损伤引起变化。Aranguren等(2010)报道了一种适用于感染对虾攻毒实验的标准化新技术：肠道灌注法，在检测对虾群体坏死性肝胰腺炎的研究中，学者将带有病原菌的接种物与红色食用染料混合，并用移液枪从肛门缓慢滴入对虾肠道中，使其进入中肠至肝胰腺。另外，此方法还被用于肠道细菌群落与对虾抗病性的因果关系研究(Guo et al, 2023)。在自然水体中，鱼类摄入MCs后，会进入肠道被上皮细胞吸收，再转运至肝脏中。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)在暴露于微囊藻藻液后，鳃丝中MC-LR的累积量最高，其次是消化道，再次为肝胰腺，这也说明摄食是对虾受到MCs胁迫的重要途径(王鑫, 2018)。因此，肠道灌注除了可以将接种物直接作用到肝胰腺，也可以更好地模拟自然条件下引发毒性反应的过程。目前尚未有学者用肠道灌注的方式对凡纳对虾进行MCs染毒，本研究首次选用肠道灌注法，并利用转录组测序技术，筛选MC-LR处理下的凡纳对虾肝胰腺组织的差异表达基因以及相关的信号通路和代谢途径，以期为揭示MC-LR的毒理机制提供基础数据，并为对虾染毒实验提供一种可行的参考方法。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用健康的凡纳对虾由山东中朗海洋科技有限公司提供，平均体重为(4.03±0.50) g，平均体长为(7.09±0.40) cm。运输至中国水产科学研究院黄海水产研究所实验室，经检测无常见病原后，饲养于盛有400 L消毒灭菌海水的PVC塑料养殖桶中。正式实验前暂养1周，连续充氧保证水中溶解氧充足，投喂凡纳对虾专用配合饲料，4次/d，每2 d清污换水1次。MC-LR购自北京普华仕科技发展有限公司，规格为固态5 mg，纯度≥95%。红色可食用染料购自广西聚力恒生物科技有限公司。
1.2 肠道灌注及样品采集正式实验开始前24 h停止饲喂对虾，确保空肠状态，将健康的对虾随机分为2组，即对照组(Ctrl)和实验组(MC)，每组设3个重复，分别放入含30 L海水的塑料养殖箱(60 cm×40 cm×30 cm)，20尾/箱，持续充氧。肠道灌注开始前先配制灌注工作液，配制方法如下：将5 mg固态MC-LR充分溶解于适量的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入150 μL红色食用染料，再转移至50 mL容量瓶中，定容至刻度线，得到浓度为0.1 mg/mL的MC-LR工作液。对照组工作液中无MC-LR。在预实验中对凡纳对虾进行MC-LR工作液浓度为0.05~0.2 mg/mL的染毒实验，其中0.1 mg/mL浓度下对虾48 h死亡率为33.3%，认为此浓度适宜用于正式实验。正式实验时，先使用10 μL自动移液枪头插入对虾肛门抽取肠道残余内容物后，用新的10 μL无菌枪头将工作液由对虾肛门缓慢注入肠道，直至观察到红色的工作液进入肝胰腺处。肠道灌注处理24 h后，分别从实验组和对照组中随机挑选3尾虾，迅速解剖分离肝胰腺，经液氮冷冻后，–80 ℃保存备用。再分别从两组中取2尾虾的完整肝胰腺，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后制备石蜡切片，并用HE染色，进行病理学观察。
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图 1 对虾肠道灌注前后示意图 Fig.1 Schematic diagram of shrimp before and after reverse‑gavage a：灌注前；b：灌注后。 a: Before reverse gavage; b: After reverse gavage. |
按QI AzolLysis Reagent说明书(Qiagen，德国)从每尾虾的肝胰腺组织样品中提取总RNA，并用超微量分光光度计(NanoDrop 2000，美国，Thermo Fisher Scientific)对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent5300 (Agilent，美国)测定RIN值。测定RNA总量1 μg，浓度≥30 ng/μL，RIN > 6.5，OD260 nm/OD280 nm介于1.8~2.2之间，确保RNA质量。将总RNA送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序平台为Illumina NovaSeq 6000 (Illumina，美国)。
对测序获得的大量原始序列数据进行统计及相关质量评估，包括碱基含量、质量、错误率分布统计。使用fastp软件(https://github.com/OpenGene/fastp)过滤原始数据，获得高质量的测序数据并再次进行统计以及质量评估。将质控后的原始数据与参考基因组比对，同时对该次转录组测序的比对结果进行质量评估，主要包括测序饱和度、基因覆盖度、Reads在参考基因组不同区域分布以及Reads在不同染色体的分布分析(使用软件：HiSat2，http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)。
1.4 表达量及表达差异分析使用RSEM软件(http://deweylab.github.io/RSEM/)分别对基因和转录本的表达水平进行定量分析，用于后续分析不同样本间基因的差异表达情况。使用DESeq 2软件(http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2)进行样本间基因的表达差异分析，鉴定出样本间差异表达的基因(differentially expressed gene, DEG)。显著差异表达基因的筛选标准为：FDR < 0.05和|log2FC|≥1。
1.5 功能注释和通路富集分析利用GO (gene ontology)数据库(http://geneontology.org/)，将基因按照它们参与的生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)进行分类，并对差异表达基因进行GO注释。利用KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库(https://www.genome.jp/kegg/)，将基因按照通路或功能分类，并对差异表达基因进行KEGG注释。使用软件Goatools (https://github.com/tanghaibao/GOatools)进行GO富集分析，使用Python scipy软件包(https://scipy.org/install/)进行KEGG通路富集分析，使用Fisher精确检验进行计算，并进行多重检验。当经过校正的P≤0.05时，认为存在显著富集。
1.6 实时荧光定量PCR分析(RT-qPCR)随机选取10个表达差异显著的基因，以β-actin作为内参基因，用Premier 5.0软件设计特异性引物(表 1)，通过RT-qPCR验证结果的可靠性。分别使用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒和SGExcel FastSYBR Master预混液(生工生物，上海)进行逆转录和RT-qPCR。通过2–ΔΔCt法计算基因的相对表达量。为减少实验误差，每个样品采用3个生物学重复，每个反应进行3次技术重复。
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表 1 RT-qPCR分析引物 Tab.1 Primers for RT-qPCR analysis |
Ctrl组虾肝胰腺组织结构完整，无明显病理损伤，肝胰腺小管布局有序，管腔清楚，上皮细胞形态正常且胞质充盈；MC组肝胰腺小管管腔异常(呈不规则星形或多边形形态)、结构破损，上皮细胞破裂、核质外溢(图 2)。
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图 2 凡纳对虾肝胰腺组织切片 Fig.2 Hepatopancreas tissue sections of P. vannamei 红色箭头指向肝胰腺小管管腔，黑色箭头指向肝胰腺小管上皮细胞。 The red arrow points to the lumen of the hepatopancreas tubule, and the black arrow points to the epithelial cells of the hepatopancreas tubule. |
利用Illumina Novaseq 6000高通量测序平台对所有样本进行转录组测序，每个样本的原始数据和质控后数据情况见表 2。本次测序共获得48.68 Gb clean data，各样品clean data均达到7.36 Gb以上，Q30碱基百分比在95.28%以上，分别将各样品的clean reads与指定的参考基因组进行序列比对，比对率从88.69%到91.08%不等。以上数据表明，转录组测序数据质量和比对率都较高，可为后续数据分析和实验验证提供可靠的原始数据。
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表 2 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾的数据测序统计 Tab.2 Data sequencing statistics of P. vannamei under microcystins-LR challenge |
利用GO、KEGG、EggNOG、NR、Swiss-Prot、Pfam六大数据库对凡纳对虾转录组数据进行基因功能注释，结果见表 3。经过比对，共注释到19 784个基因，其中19 259个基因注释到数据库。在各数据库中，NR数据库注释比例最高，达97.24% (19 237个)，KEGG数据库注释比例最低，仅54.57% (10 796个)。
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表 3 基因注释结果 Tab.3 Gene annotation results |
与对照组相比，MC-LR胁迫下的凡纳对虾肝胰腺组织共发现1 994个差异表达基因，其中1 164个表达上调，830个表达下调(图 3)。根据P值从胁迫后表达的差异基因中，筛选出差异表达最显著的前10个基因(表 4)。
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图 3 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾差异表达基因的火山图分析 Fig.3 Volcano diagram analysis of differentially expressed genes in P. vannamei under microcystin-LR challenge |
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表 4 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾差异表达最显著的前10个基因 Tab.4 The top 10 genes with the most significant differential expression in P. vannamei under microcystin-LR challenge |
GO数据库将基因按照它们参与的生物学过程、细胞组分和分子功能进行分类。对MC-LR胁迫下的差异表达基因进行GO功能分类统计，共有33个功能条目得以注释。其中，生物学过程涉及的功能条目有12个，参与细胞过程和代谢过程的差异基因数量最多，其次是生物调控。细胞组分涉及的功能条目有13个，参与细胞部分和膜部分的差异基因数量最多，其次是细胞器。分子功能涉及的功能条目有8个，参与结合和催化活性的差异基因数量最多，其次是转运活性。图 4显示了按照基因数总体取值后丰度前20的条目。KEGG数据库代谢通路分析结果显示，凡纳对虾转录组差异基因被注释到代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、生物体系统和人类疾病6类共计240条代谢通路中，主要代谢通路包括脂类代谢、翻译、信号转导、运输和分解代谢、内分泌系统等(图 5)。
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图 4 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾差异表达基因的GO分类 Fig.4 GO classification of differentially expressed genes in P. vannamei under microcystin-LR challenge |
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图 5 微囊藻毒素-LR处理下凡纳对虾差异表达基因的KEGG分类 Fig.5 KEGG classification of differentially expressed genes in P. vannamei under microcystin-LR challenge |
GO功能富集分析结果显示，差异表达基因共富集到288个功能条目下。在富集程度排名前35的分类结果中显示，在细胞组分中，差异表达基因仅富集到核仁和伴侣复合物2个条目中；在生物过程中，差异基因富集到蛋白质折叠、rRNA加工、RNA代谢过程、ncRNA代谢过程、小分子代谢过程5个条目；在分子功能中，差异表达基因富集到催化活性、杂环化合物结合、有机环状化合物结合等28个条目中(图 6)。在KEGG富集程度排名前20的通路中，核糖体生物合成通路显著富集，脂质和动脉粥样硬化、核糖体生物合成、内质网中的蛋白质加工等通路中富集到的差异基因数较多，注释到的差异基因数量分别为12、11和10个(图 7)。
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图 6 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾显著富集的GO功能富集图 Fig.6 GO functional enrichment map of significant enrichment of P. vannamei under microcystin-LR challenge |
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图 7 微囊藻毒素-LR胁迫下凡纳对虾前20个KEGG富集通路 Fig.7 The top 20 significantly enriched KEGG pathways in P. vannamei under microcystin-LR challenge |
RT-qPCR检测结果显示，MC-LR胁迫后凡纳对虾肝胰腺内LOC113800061、LOC113800113、LOC113800933、LOC113802074和LOC113801326基因相对表达量较对照组上调；LOC113800223、LOC113801336、LOC113802232、LOC113802033和LOC113800547基因相对表达量较对照组下调。RT-qPCR检测结果与转录组测序结果的表达水平变化趋势基本相同(图 8)，说明转录组测序数据可靠。
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图 8 差异表达基因的转录组测序结果与RT-qPCR检测结果的比较 Fig.8 Comparison of transcriptome sequencing results and RT-qPCR results of differentially expressed genes |
甲壳动物响应MCs胁迫作用是一个复杂的过程，需要调动体内大量的基因来应对，研究MCs诱导凡纳对虾肝损伤的分子机制，对于优化对虾养殖管理策略、建立有害藻毒素防控技术、保障对虾养殖生产稳定具有重要意义。在已有的相关文献中，学者采用的方法多为血窦注射以及藻毒素浸浴(贾滢暄等, 2023; Chen et al, 2017)。注射法可以方便地控制和调整剂量，快速引起毒性反应，但操作误差较大，易给对虾造成局部损伤，使部分实验指标受到炎症反应的影响。浸浴法被用于研究藻毒素对对虾的亚慢性毒性作用，此方法较符合在自然水体中的染毒过程，但高浓度条件下毒素用量大，实验成本较高。选用一种合理有效的染毒方法既可以节省成本，又有利于后续研究的开展。Mai等(2020)进行了凡纳对虾虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)攻毒方法的比较研究，包括肌肉注射、口服、共栖、肝胰腺注射和肠道灌注5种方法，结果表明，肠道灌注是一种可以快速感染对虾并更有优势的方法。Andriawan等(2023)用肠道灌注法研究了黄芪(Radix scutellaria)水提物对罗氏沼虾免疫功能的调节作用，证实了此方法行之有效，并且可以精确地比较不同剂量下罗氏沼虾相关的免疫应答机制。本研究中的组织切片结果显示，MC组出现明显的肝胰腺组织病变，进一步证明肠道灌注MC-LR有切实的效果，同时也为转录组分析排除了操作导致的干扰。
本研究从1 994个差异基因中筛选了10个表达差异最显著的基因，其中包括XV组磷脂酶A2-like、G蛋白信号调节因子2-like、锌指蛋白761-like等。其中，锌指蛋白家族的多个基因表达都存在显著差异，如锌指蛋白609-like、锌指蛋白143-like、锌指蛋白205-like和锌指蛋白260-like，且这些基因的表达量都呈显著下调。锌指蛋白基因是响应逆境胁迫过程中的一类重要基因(张丽丽等, 2010)，其广泛存在于生物体内，是调控炎症反应的关键物质。研究发现，锌指蛋白Znf 395在斑马鱼(Danio rerio)先天抗病毒免疫中起着促进免疫基因表达、抑制病毒复制的积极作用，同时也作用于免疫基因的表达节律，调控免疫基因的昼夜表达差异，从而影响抗病毒能力(付亚东, 2022)。在低盐胁迫下，刺参体腔液中的锌指蛋白基因做出快速反应，在6 h内迅速增加，之后开始下降，以更好地适应盐度变化(傅意然等, 2014)。Zuo等(2018)从凡纳对虾中鉴定出一种含有单个C4型锌指结构域的蛋白质，并进一步研究了其在免疫中的作用。该蛋白主要定位于细胞质中，也少量存在于细胞核，在细菌感染过程中，其能正向调控各种抗菌肽的表达，可能主要参与抗菌反应。目前，对于动植物中锌指蛋白家族的功能和表达研究较为广泛，且大多集中在机体免疫炎症等方面，但针对水产生物的研究较少。本研究表明，MC-LR胁迫会显著降低凡纳对虾的锌指蛋白基因表达量，推测锌指蛋白基因在对虾的保护机制中起到一定的作用，而MC-LR影响了这种稳态，破坏了凡纳对虾的免疫系统，但锌指蛋白在凡纳对虾中的免疫保护作用以及与MC-LR胁迫的相关性还需要进一步验证和研究。
核糖体是合成蛋白质的重要细胞器(钱丽丽等, 2020)，其生物合成是一个需要大量ATP (adenosine triphosphate)的过程，需要多种酶和加工因子协调表达(Buszczak, 2023)。已有研究表明，核糖体产生的动态调控是细胞维持平衡以应对不断变化的环境条件和急性应激的主要机制(Ni et al, 2023)。核糖体的稳态依赖于分子、细胞、生物水平上的各种因素，本研究的KEGG富集结果显示，核糖体生物合成通路显著富集，推测MC-LR打破了对虾机体中核糖体合成的平衡，凡纳对虾肝胰腺细胞需要调节核糖体数量以应对MC-LR的胁迫。内质网是调控蛋白质合成与转运的关键场所(Schwarz et al, 2016)。目前，学者们探究了MCs引发的水生生物内质网毒性，如在MC-LR暴露条件下，斑马鱼的内质网应激途径相关基因及其下游标志性基因呈现上调趋势，且使用应激抑制剂(牛磺熊去氧胆酸)可以显著缓解(张丹丹等, 2023)。毒性损伤能够导致内质网中的蛋白质异常积聚(Hotamisligil, 2010)。本研究中的KEGG富集结果显示，较多差异基因富集在内质网中的蛋白质加工通路，推测MC-LR引发了凡纳对虾的内质网应激。同时，宋玉峰(2016)研究表明，内质网应激与肝脂肪变性之间存在密切联系，且在脂质代谢和平衡中起着重要作用。张丹丹(2020)研究认为，MC-LR引起的内质网应激进一步破坏了与脂质合成相关的类固醇调节元件蛋白因子srebf1以及未折叠蛋白反应途径相关因子(atf6、atf4b1、ern1、xbp1s和hspa5)的表达。已有研究表明，MCs会引发水生生物脂质代谢异常。Duan等(2022)研究表明，MC-LR诱导凡纳对虾脂肪分解生成等相关基因表达水平的增加，并使甘油磷脂、鞘脂和胆固醇水平升高，磷脂酰肌醇和甘油三酯水平降低。MCs也同样能够改变中华绒螯蟹肝胰腺、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏、斑马鱼肝脏等的脂质代谢过程(Chi, et al, 2022; 林长高等, 2022; 张丹丹等, 2023)。本研究中的KEGG分类结果也显示，较多差异基因注释到了脂质代谢通路中，这与前人研究相对应，进一步推测，MC-LR引起凡纳对虾的内质网应激与脂质代谢之间也可能存在相互作用关系，但仍有待研究。
对虾的肠道和肝胰腺、胃部连通，肠道灌注法在针对一些肝毒性和肠道微生物的研究中或许可以采用，本研究也表明了该方法的可行性。简而言之，本研究结果可为对虾染毒实验方法提供参考，也为揭示凡纳对虾应对MC-LR的分子调控机制提供了基础数据，但肠道灌注的方法有待进一步标准化，不同染毒方式的方法学也有待继续研究比较，才能更好地明确肠道灌注方法的优势与不足。同时，也需要进一步验证这些差异表达基因和富集通路是否与凡纳对虾应对MC-LR胁迫密切相关，这样才能更深入地探索和完善凡纳对虾的毒理学机制研究。
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