溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)的无芽孢、无荚膜的嗜盐、嗜温厌氧性革兰氏阴性细菌，广泛分布于海水、入海口和水产养殖环境中，对多种水产动物和人有致病性(Ahmed et al, 2016)。近几年，溶藻弧菌是引起水产动物育苗期和养成期死亡的主要病原之一(Zhang et al, 2023)，溶藻弧菌感染鱼类可导致出血、溃疡或败血症(赖迎迢等, 2014)，感染虾类可致虾苗细菌性玻化症(bacterial vitrified syndrome, BVS) (王印庚等, 2021)或对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease)(陈蒙蒙等, 2018)、黑鳃烂鳃(Vera et al, 1992)或白便综合征(Sandaruwan Kumara et al, 2017)，感染螃蟹(Portunus tritubercularus)可致“牛奶病” (黄增荣, 2006)或牙膏病(陈萍等, 2009)，感染海参(Apostichopus japonicus)可致腐皮综合征(skin ulcerative syndrome, SUS)(张文泽等, 2015)。此外，溶藻弧菌感染还能引起贝类发病(Yang et al, 2021; 郑玉东等, 2024)，给海水养殖业造成巨大的经济损失。因此，开发绿色高效的抗弧菌病药物已成为当前海水养殖动物疾病防治研究的热点之一。

本课题组曾以分离自患有细菌性玻化症虾苗的溶藻弧菌和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为研究对象，开展了50味中药的抗菌活性研究，结果显示，诃子(Chebulae fructus)、五倍子(Galla chinensis)、石榴皮(Granati pericarpium)、地榆(Sanguisorbae radix)等中药的抑菌效果相对较好，以诃子为主药的处方[诃子30 g、五味子(Schisandra chinensis) 20 g、香附(Cyperi rhizome) 20 g]对溶藻弧菌人工感染虾苗致细菌性玻化症的治疗效果也较好(赵伟志等, 2024)。鞣质是诃子(阳小勇等, 2012; 杨武杰等, 2023)、五倍子(杨寒冰等, 2016)、石榴皮(邓永等, 2021)和地榆(刘海英, 2009)等中药中非常重要的多酚类活性成分，它是由没食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其他多元醇)酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及二者混合共同组成。已有报道证明，没食子酸(gallic acid, GA)具有较好的抗菌(Rangel-López et al, 2022)、抗炎(Pandurangan et al, 2015; Zhao et al, 2024)、抗氧化(王荣等, 2023)、保护肝脏(吕云龙等, 2022)和提高免疫功能(Choubey et al, 2018)等多种药理作用，其可能成为一种潜在的防病保健兽药或饲料添加剂使用。

中药可通过抑制细菌生物膜的形成和发育、破坏细菌的细胞壁和细胞膜、影响菌体蛋白质和遗传物质核酸的合成、促进氧化应激的产生以及抑制毒力因子的表达等方面的作用来抑制或杀灭细菌。虽然没食子酸已被报道对多种细菌有良好的抗菌作用，但尚未报道其对溶藻弧菌的抗菌活性和可能的作用方式。本研究探讨没食子酸对溶藻弧菌的抗菌活性及其作用机制，为筛选和研发防治水产动物弧菌感染性疾病的药物提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 实验菌液的制备

溶藻弧菌：菌株实验室编号为P4A，分离自患BVS对虾养殖场的凡纳对虾(Penaeus vannamei)虾苗，保存于中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖病原库。将冻存的溶藻弧菌复苏后，以TSB固体培养基活化纯培养，挑取单菌落接种于TSB培养基，于28 ℃、180 r/min恒温振荡过夜培养至对数生长期。

1.2 药液的制备

没食子酸：纯度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。以PBS将没食子酸配制成16 mg/mL的药液，过滤除菌，并用PBS倍比稀释制成不同浓度的没食子酸溶液，4 ℃保存备用。

1.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

采用二倍稀释法测定。取对数生长期的溶藻弧菌，用TSB培养基稀释至1×10⁶ CFU/mL。分别取100 μL不同浓度的没食子酸溶液加入96孔板，并加入等量的1×10⁶ CFU/mL菌液，再以菌液加等量PBS为阳性对照组，TSB培养基加等量PBS为空白对照组。实验组和对照组分别加入氯化三苯四氮唑(TTC) 10 μL，以检验细菌是否生长。每组设3个平行。将96孔板置于28 ℃恒温培养箱中培养，当阳性对照组变红时，记录没食子酸的抑菌效果，实验组变色孔的上一个孔所对应的浓度即为MIC。从未变红的实验组各孔取样100 μL，分别涂布于TSB琼脂平板，28 ℃恒温培养箱培养24 h，观察结果。琼脂平板上细菌菌落数少于5且药液浓度最低的，即为MBC。

1.4 生长曲线测定

测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生长的影响。按1.3中的方法配制菌液。取1×10⁶ CFU/mL溶藻弧菌菌液100 μL，分别加入不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC和1/4MIC。以菌液加等量PBS为阳性对照组，TSB加等量PBS为空白对照组，每组设3个平行。在全自动微生物生长曲线测定仪中28 ℃培养24 h，每隔2 h在600 nm波长下测定各组吸光值。

1.5 碱性磷酸酶(AKP)活性测定

参考张凯睿等(2021)的方法测定不同浓度没食子酸溶液在不同时间对溶藻弧菌细胞壁的影响。取对数生长期的溶藻弧菌5 000 r/min离心5 min，用PBS重悬配制成1×10⁶ CFU/mL的菌悬液。实验组为在10 mL 1×10⁶ CFU/mL溶藻弧菌菌液中分别加入10 mL不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS为阳性对照组。每组设3个平行。溶藻弧菌在28 ℃、180 r/min摇床振荡培养，分别在0、2、4、6、8 h时各组的每个平行取样1 mL，在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液备用，使用AKP试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)测定上清液在520 nm波长下的吸光值，并按说明书计算各组AKP活性。

1.6 电导率测定

参考赵君微等(2023)的方法测定不同浓度没食子酸在2 h时对溶藻弧菌细胞膜的影响。各组处理方法参照1.5。溶藻弧菌在28 ℃、180 r/min摇床振荡培养2 h，各组分别取样9 mL，在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，用酶标仪在450 nm波长下测定菌体培养液的电导率。

1.7 生物被膜的形成

参考Kang等(2018)实验方法，采用结晶紫染色法测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响。菌液配制方法参照1.3。分别取100 μL不同浓度的没食子酸溶液加入到96孔板中，并加入等量的1×10⁶ CFU/mL菌液，使没食子酸溶液的终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS为阳性对照组。每组设3个平行。溶藻弧菌在28 ℃静置培养24 h后，将孔中液体吸出，并用无菌PBS冲洗去除浮游细菌，添加200 μL甲醇固定15 min，加入200 μL 0.5%的结晶紫溶液，室温静置20 min，吸出结晶紫溶液，无菌蒸馏水冲洗并风干。加入200 μL 33%的醋酸溶液溶解，静置15 min后，用酶标仪测定595 nm条件下的吸光值，以33%醋酸溶液为空白对照。

1.8 生物被膜的清除

参考李芬等(2020)采用结晶紫染色法测定不同浓度没食子酸溶液对成熟生物被膜清除的影响。菌液配制方法如1.3。在96孔板各孔中分别加入200 μL 1×10⁶ CFU/mL菌液。28 ℃静置培养24 h后，将孔中液体吸出，并用无菌PBS轻柔冲洗2次，晾干后得到成熟生物被膜。在形成生物被膜的各孔中，分别各添加200 μL 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC的没食子酸溶液作为实验组，添加200 μL PBS作为对照组。每组设3个平行。28 ℃静置培养24 h后将孔中液体吸出，并用无菌PBS冲洗2次，200 μL甲醇固定15 min，加入200 μL 0.5%的结晶紫溶液，室温静置20 min，吸出结晶紫溶液，无菌蒸馏水冲洗并风干。用200 μL 33%醋酸溶液溶解，15 min后用酶标仪测定595 nm处的吸光值，以33%醋酸溶液为空白对照。

1.9 泳动能力测定

参考余生玲等(2022)测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌泳动能力的影响。按1.3中的方法配制菌液。配制含浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC没食子酸的0.3%琼脂LB半固体平板。含等量PBS的0.3%琼脂LB半固体平板作为对照组。取2 μL 1×10⁶ CFU/mL的菌液接种于平板中心，28 ℃静置培养24 h后，采用十字交叉法测定细菌运动直径大小。

1.10 聚集能力测定

参考唐玉霞(2015)的方法测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌的聚集能力的影响。按1.3中的方法配制菌液。实验组为取10 mL 1×10⁶ CFU/mL溶藻弧菌菌液，分别加入等量不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。阳性对照组为在菌液中加入等量PBS。每组设3个平行。28 ℃培养24 h。待培养结束，在静止状态下，各管分别吸取3 mL菌液测定其在600 nm处的吸光度，再将各管剩余菌液振荡悬浮，测定其在600 nm处的吸光度。计算公式为：

$ 聚集能力= \frac{\text{ }悬浮{\text{OD}}_{600\text{nm}}-静止{\text{OD}}_{600\text{nm}}}{\text{ }悬浮{\text{OD}}_{600}{}_{\text{nm}}} ×100% $

2 结果 2.1 没食子酸对溶藻弧菌的抑菌作用

采用二倍稀释法和平板计数法测定没食子酸对溶藻弧菌的抑菌效果。实验结果显示，没食子酸对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为4 mg/mL和8 mg/mL。不同浓度的没食子酸对溶藻弧菌生长的影响效果见图 1。2MIC和1MIC的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌生长，OD值显著低于不加药物的阳性对照组。1/2MIC的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌生长，菌株在8 h左右达到平台期，平台期菌液浓度明显低于阳性对照组。1/4MIC的没食子酸对溶藻弧菌生长无明显影响。综上所示，1/2MIC以上浓度的没食子酸对溶藻弧菌生长有良好的抑制作用，且抑制效果随浓度增加逐渐增强。

2.2 没食子酸对溶藻弧菌细胞壁完整性的影响

细胞壁是细菌维持形态、保护菌体的重要结构。AKP位于细胞壁和细胞膜之间，在细胞壁未受损时，胞外无法检测到AKP，当细胞壁被破坏受损时，AKP从细胞中漏出(Cao et al, 2019)，AKP可以作为评价细胞壁通透性的指标。不同浓度没食子酸对溶藻弧菌细胞壁的影响见图 2。结果显示，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC处理组的细菌培养液中AKP含量前2 h迅速上升，之后呈逐渐稳定上升的趋势。结果表明，1、2、4、8 mg/mL浓度的没食子酸在2 h内均能破坏溶藻弧菌细胞壁或增加细胞壁的通透性，导致AKP渗出。没食子酸溶液浓度越高、作用时间越长，对溶藻弧菌细胞壁的破坏程度越大。与处理组相比，阳性对照组的AKP含量始终处于较低水平，且无明显变化。其在4~8 h的含量上升，推测可能是细菌正常生命活动过程中的裂解死亡所致。

2.3 没食子酸对溶藻弧菌电导率的影响

细胞膜是细菌强有力的保护屏障，而细胞膜的导电性是细胞膜通透性的重要指标，当细菌细胞膜完整性被破坏，渗透性增加，细胞中的Na⁺、K⁺泄漏，导致上清液的电导率变大。不同浓度的没食子酸对溶藻弧菌电导率影响结果见图 3。结果显示，1/2MIC、1MIC和2MIC处理组的细菌培养液在2 h时，OD_{450 nm}显著高于对照组(P < 0.05)；1/4MIC处理组的细菌培养液在2 h时，OD_{450 nm}与对照组无显著差异(P＞0.05)。1/2MIC以上浓度的没食子酸可显著增强溶藻弧菌细胞膜的通透性，且其作用强度随没食子酸浓度增加而增强。

2.4 没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响

生物膜是细菌重要的生存策略，具有抵抗外界环境压力、提供营养支持、促进表面粘附和传导信号等作用(Wang et al, 2023)。不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响如图 4所示。与阳性对照组相比，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜的形成均有显著抑制作用(P < 0.05)，抑制率分别为16.61%、32.37%、77.80%和83.26%。结果表明，没食子酸能有效抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，抑制作用随其浓度的增加而增强。

2.5 没食子酸对溶藻弧菌生物被膜的清除作用

不同浓度没食子酸对溶藻弧菌成熟生物被膜清除的影响如图 5所示。与对照组相比，1/2MIC、1MIC和2MIC的没食子酸溶液能显著清除成熟的溶藻弧菌生物被膜(P < 0.05)，清除率分别为54.5%、67.54%和68.01%。结果表明，1/2MIC以上浓度的没食子酸对溶藻弧菌成熟的生物被膜清除作用明显，且清除作用随其浓度的增加而增强。

2.6 没食子酸对溶藻弧菌泳动能力的影响

没食子酸对溶藻弧菌泳动的影响如图 6、7所示。1/2MIC和1/4MIC浓度的没食子酸对溶藻弧菌泳动能力有显著的抑制作用(P < 0.05)，较对照组分别减少60.41%(P < 0.05)和51.78%(P < 0.05)，2MIC和1MIC浓度的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌的生长，平板上未见细菌生长。结果表明，1/4MIC以上浓度的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌的泳动能力，且抑制作用随浓度的增加而增强。

2.7 没食子酸对溶藻弧菌聚集能力的影响

不同浓度没食子酸对溶藻弧菌聚集能力的影响如图 8所示。阳性对照组细菌间的聚集能力为44.08%，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC浓度的没食子酸能显著降低溶藻弧菌的聚集能力，聚集能力分别被降至37.41%、25.70%、19.19%和18.68%，与对照组相比差异显著(P < 0.05)。

3 讨论

随着生活水平的提高，人们对于食品安全的关注度越来越高，2021年1月农业农村部印发了《关于加强水产养殖用投入品监管的通知》，其中指出开展水产养殖用兽药、饲料和饲料添加剂相关违法行为三年专项整治，在全国试行水产养殖用投入品使用白名单制度。但目前合规的水产动物疾病防治药物较少，加之养殖模式和病原区系特征的不断变化，寻找绿色高效的防治药物成为当前水产病害防治的研究热点之一。

没食子酸作为一种多酚类化合物，广泛存在于植物中，也可通过生物或化学合成方式大量获得，具有较好的抗菌活性。郑曙明等(2010)研究证实，没食子酸对迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等4种水产动物致病菌的抑菌圈直径可达25~30 mm。徐臻(2023)研究结果显示，没食子酸对副溶血弧菌的MIC为3 mg/mL。本研究结果显示，没食子酸对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为4 mg/mL和8 mg/mL，MBC/MIC为2，说明没食子酸对溶藻弧菌具有良好的杀菌作用(O′Neill et al, 2004)；生长曲线测定结果表明，4 mg/mL以上浓度的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌生长，2 mg/mL的没食子酸明显抑制溶藻弧菌的快速生长，生长平台期菌液浓度明显低于阳性对照组，提高没食子酸药物浓度可缩短药物的抑菌作用时间，说明没食子酸对溶藻弧菌的抑制效果呈剂量依赖性，因此，选用没食子酸抑制溶藻弧菌生长时，应选用4 mg/mL及以上浓度方能达到良好的抑菌作用。

当细菌的细胞壁和细胞膜遭到破坏时，细胞膜通透性增高，细胞内容物流出，细菌胞外的AKP活性和电导率会显著升高。张雅丽等(2013)研究发现，没食子酸能使高敏感菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)出现凹陷、破损、细胞原生质泄漏。地榆提取物能破坏多重耐药大肠埃希氏菌(multidrug-resistant Escherichia coli)的细胞壁，显著提高胞外的AKP含量(张凯睿等, 2021)。本研究中1、2、4、8 mg/mL浓度的没食子酸能在2 h内破坏溶藻弧菌的细胞壁，导致AKP漏出；没食子酸能使溶藻弧菌培养物的电导率增加，说明没食子酸也可破坏溶藻弧菌细胞膜的完整性，导致通透性增加，且破坏程度呈剂量依赖性。

生物被膜是由细菌分泌的胞外多聚物(EPS)组成，如蛋白质、胞外多糖、脂质和细胞外DNA(周文渊等, 2014)，生物被膜有利于微生物黏附，能提高细菌对外界不良坏境的抵抗能力，同时增加细菌对抗菌药物的抗性。多项研究指出，细菌的运动性和聚集能力在细菌早期粘附、生物被膜形成和细菌定殖过程中发挥着重要作用(Harshey, 2003; Zhu et al, 2013)，细菌通过运动相互聚集，借助EPS粘附更多的游离菌，从而更加有利于生物被膜的形成，同时细菌间的聚集可促进其粘附，使生物被膜结构更加坚固。研究发现，多酚类物质能通过破坏细胞壁和细胞膜、减少生物被膜形成(Vazquez-Armenta et al, 2023)、干扰细菌运动(McCall et al, 2013)和聚集能力等发挥对细菌的抑制效果。没食子酸可诱导大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物被膜特性发生不可逆变化(Li et al, 2019)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和肉桂醛衍生物能抑制副溶血弧菌的运动能力和生物被膜形成(Faleye et al, 2021; Wang et al, 2022)。虾壳壳聚糖–表没食子儿茶素没食子酸酯共聚物(COS-EGCG) 0.256 mg/mL能显著抑制单增李斯特菌的泳动和群集(Buatong et al, 2023)。本研究中，1 mg/mL和2 mg/mL的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌的运动性，降低溶藻弧菌的聚集能力，且没食子酸溶液浓度越高，溶藻弧菌的运动性和聚集能力越低；同时，没食子酸能高效抑制生物被膜的形成，4 mg/mL和8 mg/mL浓度的没食子酸对溶藻弧菌生物被膜的形成的抑制率可达77.80%和83.26%，对成熟溶藻弧菌生物被膜的清除率分别为67.54%和68.01%，表明没食子酸可能通过抑制溶藻弧菌的运动和聚集能力来抑制生物被膜的形成。生物被膜消除后，细菌对抗菌药物的抵抗力将显著下降，当没食子酸与抗生素联用时，可增加后者在大肠埃希氏菌菌体内累积而表现出抗生素增效剂作用(Tian et al, 2022)。没食子酸也可通过破坏细胞膜完整性和调控ica基因家族而发挥抗菌作用，这种独特的抗菌机制几乎不会诱导细菌耐药性的产生(Lu et al, 2016; Liu et al, 2017)。因此，没食子酸不仅可作为一种抗菌效果较好的药物添加剂使用，还可能作为一种抗菌增效剂联合抗生素进行疾病的治疗。

4 结论

没食子酸对溶藻弧菌的抑菌效果较好，可以通过破坏溶藻弧菌细胞壁，增加细胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，通过抑制溶藻弧菌的运动和聚集能力抑制或杀灭溶藻弧菌，此研究结果将为水产动物弧菌感染性疾病的防治提供新的思路。