虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是世界重要的养殖冷水鱼，在我国甘肃、青海和新疆等地区也有大范围养殖。近年来，随着虹鳟养殖规模的扩大和产量的提升，病害问题也逐步成为产业发展的重要限制因素，严重影响了我国虹鳟养殖业的健康发展。其中，传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是虹鳟的2种重要病原(所兴, 2014)。

IHNV主要引起鲑鳟类传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis, IHN)，导致鱼类的肾脏、脾脏和造血组织坏死，死亡率在90%以上(LaPatra, 1996, Dixon et al, 2016)，给全球的鲑鳟养殖业造成了巨大的经济损失。IHNV基因组编码了5种结构蛋白和1种非结构蛋白NV (McAllister et al, 1975; Kurath et al, 1985)。其中，糖蛋白又称G蛋白，是该病毒仅有的表面蛋白，也是主要的抗原决定簇，能刺激机体产生中和抗体，诱导产生细胞免疫，在病毒致病性和免疫应答等方面发挥重要作用，目前针对IHNV基因工程疫苗的研究多以G蛋白为主(Dancho et al, 2009)。

杀鲑气单胞菌隶属于气单胞菌属(Aeromonas)，是一种兼性厌氧型革兰氏阴性短杆菌(Colwell et al, 1986)，可导致多种鱼类发生疖疮病或溃疡病(Valderrama et al, 2019)。目前，国际上商业化的鲑鳟类杀鲑气单胞菌油乳化灭活疫苗技术已非常成熟，而我国尽管多次发现杀鲑气单胞菌感染(晋怀远等, 2023; 刘静静等, 2023)，但仍缺乏可用的疫苗产品。

因此，为解决上述2种主要病原对虹鳟养殖业的威胁，本研究以杀鲑气单胞菌作为载体，表达IHNV G蛋白，构建针对IHNV和杀鲑气单胞菌2种病原的多联疫苗，并对其免疫保护效果进行分析，以期为我国虹鳟健康养殖提供技术支持。

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种菌株SC18032201由本实验室鉴定和保存(Lin et al, 2020)，大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α和蛋白表达质粒pGEX-4T-1为本实验室保存，IHNV购买自深圳海关，单层胖头上皮细胞(epithelioma papulosum cyprinid，EPC)由中国水产科学研究院长江水产研究所赠送。健康虹鳟购买自山东潍坊临朐一虹鳟养殖场，体重为(53±6.84) g，养殖于1 t水体的循环水系统中，每日循环量20次，水温为14~16 ℃，溶氧为8~10 mg/L，投喂率为1.2%，实验前随机取40尾鱼，进行细菌分离和IHNV检测，确保实验鱼未感染病原。

根据J型IHNV G蛋白基因序列(序列号：MT242597)，以杀鲑气单胞菌基因组密码子偏好性进行密码子优化并合成[生工生物工程(上海)股份有限公司]。利用Primer 5.0设计优化后的IHNV-G蛋白基因片段的引物序列，上游引物IHNV-of-pGEX-4T-1-for：5′-CGCGTGGATCCCCGG CAGACCGTCCCGCCGGATAC-3′，下游引物IHNV-of-pGEX-4T-1-rev：5′-GTCGACCCGGGAATT TTATCAAGATGATGGTGGTGATGATGCAAGC-3´由派森诺公司合成。

以密码子优化后的基因作为PCR模板。选择引物IHNV-of-pGEX-4T-1-for、IHNV-of-pGEX-4T-1-rev扩增IHNV-G蛋白基因，扩增程序：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s；58 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，35个循环；72 ℃充分延伸7 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测、回收并连接到pGEX-4T-1载体和测序验证，得到IHNV G蛋白表达质粒pGEX-4T-1-G。用电转化法将重组质粒pGEX-4T-1-G转入感受态细胞SC18032201，得到转化成功的阳性转化子SC18032201-G。

以含有空载体pGEX-4T-1质粒的SC18032201-pGEX和野生菌株SC18032201作为阴性对照，进行蛋白诱导表达检测。将诱导表达后的包涵体用8 mol/L尿素溶解，将处理后的蛋白上清液和包涵体进行12% SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后转移至PVDF膜上，以小鼠抗6×His单克隆抗体作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，对重组蛋白进行Western Blotting检测。采用单因素法探究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度对蛋白质表达量的影响并进行优化，每次只设1个变量。以终浓度为0.1 mmol/L的IPTG分别于20、24、28、32 ℃诱导培养12 h，取样进行Western Blotting检测优化诱导温度；以终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，28 ℃，分别诱导4、8、12、16、20 h，取样进行Western Blotting检测优化诱导时间；以终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L的IPTG，28 ℃诱导8 h，取样进行Western Blotting检测优化IPTG浓度。

在最佳诱导表达条件下诱导SC18032201-G表达重组蛋白，使用5‰的甲醛灭活24 h，进行平板涂布检测灭活情况。完全灭活的菌液用PBS稀释至终浓度约1×10⁹ cell/mL，以Montanide™ ISA 763A VG为佐剂，制备油乳化疫苗，按照同样的方法制备PBS对照组。将100尾健康虹鳟随机分为2组，免疫组50尾，腹腔注射SC18032201-G二联疫苗；对照组50尾，腹腔注射等剂量的PBS。在免疫后45 d，从各组中随机挑选10尾虹鳟进行尾静脉采血收集血清。剩余免疫组和对照组虹鳟随机分为2组，每组20尾。浸泡感染1×10⁶ CFU/mL杀鲑气单胞菌SC18032201，连续观察30 d，统计累积死亡数，并计算相对免疫保护率(relative percent survival, RPS)。RPS=[1–(接种疫苗鱼的死亡率/未接种疫苗鱼的死亡率)]×100%。

将IHNV原液用细胞维持液(MEM培养基+2%胎牛血清+1%双抗)连续稀释并分别接种到单层EPC。15 ℃ CO₂恒温培养箱内孵育1 h后弃去含有病毒的培养液，每孔更换为100 μL细胞维持液，于15 ℃静置培养，每天观察所有孔病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)情况并连续7 d记录结果，使用Reed-Muench法计算TCID₅₀ (50% tissue culture infective dose)结果(Lapatra et al, 1993)。将1.2.4中的血清样品用细胞维持液进行连续2倍系列稀释(1∶2~1∶256)后，与100 TCID₅₀的IHNV液以1∶1的比例混合，置于15 ℃ CO₂培养箱中孵育1 h，接种于96孔板单层EPC细胞，于15 ℃ CO₂培养箱孵育1 h后弃去细胞培养液，更换为每孔100 μL的细胞维持液。将96孔板置于15 ℃静置培养，连续观察7 d，记录病变及未病变孔数，以抑制50%细胞病变的血清最高稀释度作为血清中和效价，按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。

用引物IHNV-of-pGEX-4T-1-for、IHNV-of-pGEX-4T-1-rev扩增IHNV糖蛋白基因，得到1 341 bp糖蛋白基因目的片段(图 1)，与酶切后pGEX-4T-1质粒用无缝克隆试剂盒连接，转化DH5α感受态细胞后进行PCR和测序鉴定(图 2)，表明pGEX-4T-1-G重组质粒构建成功。将重组质粒pGEX-4T-1-G电击转化至杀鲑气单胞菌SC18032201感受态细胞中，PCR扩增并测序验证，确定SC18032201-G载体构建成功(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 1 HNV-G蛋白基因PCR扩增产物 Fig.1 PCR products of IHNV G protein gene M：DNA分子量标准DL2000，下同；1：阴性对照；2~4：G基因PCR扩增产物。 M: DNA marker DL2000, the same below; 1: Negative control; 2−4: PCR product of G gene.

图 1(Fig. 1)

图 2 重组质粒菌液PCR鉴定 Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid 1~4：重组质粒pGEX-4T-1-G PCR扩增产物。 1−4: PCR Product of recombinant plasmid pGEX-4T-1-G.

图 1(Fig. 1)

图 3 重组质粒pGEX-4T-1-G电转化杀鲑气单胞菌的鉴定结果 Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pGEX-4T-1-G in A. salmonicida 1~4：杀鲑气单胞菌SC18032201-G PCR扩增产物。 1−4: PCR product of SC18032201-G.

将重组菌SC18032201-G于28 ℃ IPTG诱导12 h后，取菌体细胞破碎、Western Blotting分析，并以含有pGEX-4T-1质粒的杀鲑气单胞菌SC18032201-pGEX和野生型株菌SC18032201作为对照。结果显示，SC18032201-G细胞破碎液中出现了特异性的结合条带(78 kDa)，而含有pGEX-4T-1质粒的SC18032201-pGEX和野生型株菌SC18032201细胞破碎产物并未出现特异性条带(图 4)。Western Blotting结果表明，IHNV G蛋白在SC18032201-G中成功表达。

图 1(Fig. 1)

图 4 重组蛋白的Western Blotting鉴定 Fig.4 Western Blotting of recombinant proteins M：彩虹130广谱蛋白分子量标准(15~130 kDa)，下同；1~3：SC18032201-G、SC18032201-pGEX、野生株SC18032201诱导后上清液；4~6：SC18032201-G、SC18032201-pGEX野生株SC18032201诱导后沉淀。 M: Rainbow 130 broad-spectrum protein marker (15~130 kDa), the same below; 1–3: Supernatant of induced SC18032201-G, SC18032201-pGEX and wild strain SC18032201; 4–6: Precipitation of induced SC18032201-G, SC18032201-PGEX, wild strain SC18032201.

将重组菌SC18032201-G于20、24、28、32 ℃诱导12 h后的Western Blotting结果显示，20 ℃未能诱导目的蛋白成功表达，24 ℃能诱导目的蛋白少量表达，28 ℃和32 ℃都能诱导蛋白大量表达，但32 ℃超出杀鲑气单胞菌的最适生长温度(图 5)。故选择28 ℃为蛋白诱导表达的最适温度。进一步对诱导时间进行优化，重组菌SC18032201-G诱导4、8、12、16、20 h后的Western Blotting结果显示，目的蛋白诱导4 h时表达量最低，8 h时表达量最高，8 h时后随着时间的延长，表达量几乎不变(图 6)。故选取8 h作为蛋白诱导表达的最适时间。重组菌SC18032201-G分别用终浓度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L的IPTG于28 ℃诱导8 h后的Western Blotting结果显示，目的蛋白诱导经0.2 mmol/L IPTG诱导时表达量最高，其余浓度IPTG诱导，表达量几乎一致(图 7)。故选取作0.2 mmol/L为蛋白诱导表达的最适IPTG浓度。因此，重组菌SC18032201-G的最佳蛋白诱导条件为0.2 mmol/L IPTG、28 ℃诱导表达8 h。

图 1(Fig. 1)

图 5 重组菌在不同温度下蛋白表达 Fig.5 Protein expression in recombinant strains at different temperatures 1~4：20、24、28、32 ℃诱导后上清液；5~8：20、24、28、32 ℃诱导后沉淀。 1–4: Supernatant induced at 20, 24, 28, and 32 ℃; 5–8: Precipitate induced at 20, 24, 28, and 32 ℃.

图 1(Fig. 1)

图 6 重组菌在不同时间下蛋白表达 Fig.6 Protein expression in recombinant strains at different times 1、2、3、4、5：诱导4、8、12、16、20 h后上清液；6、7、8、9、10：诱导4、8、12、16、20 h后沉淀。 1, 2, 3, 4, 5: Supernatant induced after 4, 8, 12, 16, 20 h; 6, 7, 8, 9, 10: Precipitation induced after 4, 8, 12, 16, 20 h.

图 1(Fig. 1)

图 7 重组菌在不同IPTG浓度下蛋白表达 Fig.7 Protein expression of recombinant strains at different concentration of IPTG 1~5：0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L IPTG诱导后上清液；6~10：0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L IPTG诱导后沉淀。 1–5: Supernatant induced by IPTG of 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, and 0.8 mmol/L; 6–10: Precipitates induced by IPTG of 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, and 0.8 mmol/L.

将IHNV液以不同的稀释倍数在EPC细胞中培养7 d后观察CPE变化情况，根据Read-Muench方法计算，IHNV的滴度为10^–5.79 TCID₅₀/mL。测定免疫组和对照组各10尾虹鳟血清IHNV中和抗体效价，其中免疫组中和抗体效价为54.95±6.76，对照组未检出IHNV中和抗体，免疫组中和抗体效价与对照组间差异极显著(P < 0.01)。

疫苗腹腔注射免疫虹鳟45 d后，分别对免疫组和对照组进行浸泡攻毒，每天记录死亡数量，对照组的死亡率分别为35%和40%，免疫组未发生死亡情况，疫苗对杀鲑气单胞菌感染的相对免疫保护率为100% (表 1)。

表 1(Tab.1)

表 1 载体疫苗的免疫保护力 Tab.1 Immune protection of recombinant vaccine 组别Group 攻毒后Post infection 免疫保护率Relative percent survival /% 死亡数/总鱼数Number of deaths/total number of fish 累计死亡率Cumulative mortality /% 免疫1组Immunization group 1 0/20 0% 100% 免疫2组Immunization group 2 0/20 0% 100% 对照1组Control group 1 8/20 40% / 对照2组Control group 2 7/20 35% /

表 1 载体疫苗的免疫保护力 Tab.1 Immune protection of recombinant vaccine

疫苗是预防虹鳟疾病的最有效手段，在国际上针对虹鳟疾病的各种商业疫苗已广泛使用，如IHNV的DNA疫苗(Alonso et al, 2013)、IPNV的亚单位疫苗(Dadar et al, 2015)、传染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmon anaemia virus, ISAV)的重组疫苗(Adams, 2013)和杀鲑气单胞菌的油佐剂疫苗(Villumsen et al, 2015)等。由于鲑鳟类面临多种病原的威胁，以植物油或矿物油为佐剂的多联疫苗是其商业疫苗的主要类型(Villumsen et al, 2015)。而目前IHNV仅有一款DNA疫苗上市，以水剂的形式肌肉注射免疫(Alonso et al, 2013)，无法作为抗原之一加入多联疫苗，从而给IHNV疫苗的应用带来很大困难。

目前已报道的IHNV疫苗类型包括DNA疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等。如Ballesteros等(2015)将IHNV和VHSV的G基因分别连接到pcDNA 3上，成功构建了2株DNA疫苗，免疫保护率达到96%和94%。Wu等(2023)以CpG序列为佐剂，构建了IHNV G基因的DNA疫苗，在感染初期Mx-1和IFN-γ的表达量显著上调，刺激鱼体产生特异性IgM抗体和中和抗体。Lin等(2022)以Montanide GEL 02 PR为胶体佐剂，制备了IHNV灭活疫苗，免疫保护周期可达285 d以上，具有广泛的应用潜力。在重组蛋白疫苗方面，IHNV的蛋白疫苗主要以表面糖蛋白为主。Sun等(2022)利用虹鳟鱼CK 6趋化因子蛋白和IHNV截短型G蛋白构建分泌型重组干酪乳杆菌口服疫苗，相对免疫保护率为66.67%。王艳雪(2019)对IHNV-G蛋白基因片段进行截短重组表达制备了重组亚单位疫苗，相对保护率为60%。本研究也利用IHNV表面G蛋白作为抗原，首次利用致病性的杀鲑气单胞菌作为表达载体进行重组表达。实验结果显示，IHNV G蛋白可以在重组菌SC18032201-G中获得表达，优化表达后的疫苗载体不但可以抵抗杀鲑气单胞菌的感染，也产生了IHNV的特异性中和抗体。

中和抗体是评价病毒疫苗免疫保护效果的重要指标之一，Traxler等(1999)研究表明，可通过检测接种虹鳟鱼的血清抗体水平来评估IHNV疫苗的功效。如以腺病毒作为载体构建的IHN-IPN二联疫苗免疫虹鳟后，免疫组中和抗体水平持续升高(Li et al, 2020、2023)。Zhao等(2017)利用酵母表面展示技术成功地将IHNVG蛋白展示在酿酒酵母表面制成口服疫苗，免疫虹鳟后血清抗IHNV中和抗体效价显著高于对照组。本研究也选择了中和抗体作为IHNV疫苗的评价指标，实验结果显示，免疫组虹鳟血清中IHNV中和抗体效价显著高于对照组，具有对IHNV的中和能力。

综上所述，本研究以杀鲑气单胞菌杀鲑亚种SC18032201菌株为表达载体，异源表达IHNV表面抗原G蛋白，构建的二联载体疫苗不但可以保护虹鳟免受杀鲑气单胞菌的感染，而且能够产生IHNV中和抗体，并可以油乳化疫苗的形式免疫，能够与目前应用最为广泛的鲑鳟类疫苗制成多联疫苗，在鲑鳟类的疾病防控中具有重要的应用价值。