凡纳对虾(Penaeus vannamei)俗名南美白对虾，1988年从美国夏威夷引入我国(张伟权, 1990)，1992年，其人工繁殖技术实现了突破，随后，其养殖在全国范围内得到推广。2022年，我国海水对虾养殖总产量达153.18万t，包括凡纳对虾、斑节对虾(P. monodon)、中国对虾(P. chinensis)和日本对虾(P. japonicus)，其中，凡纳对虾产量为134.03万t，占海水养殖总产量的87.50% (农业农村部渔业渔政管理局等, 2023)。近年来，由于养殖规模的不断扩大，养殖环境遭到破坏，病害问题层出不穷，已严重制约我国凡纳对虾养殖业的发展。其中，急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是近年来造成灾难性经济损失的主要对虾疾病之一，对世界对虾养殖业造成的经济损失估计高达430亿美元(Kumar et al, 2021)。

AHPND最初被命名为对虾早期死亡综合征(early mortality syndrome, EMS)。已报道的可引起对虾AHPND的弧菌种类包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、欧文斯氏弧菌(V. owensii)和坎贝氏弧菌(V. campbellii)等(贾丹等, 2018)。目前，普遍认为对虾AHPND是由致病性弧菌携带的pVA1-like质粒编码毒力蛋白PirAB^Vp (PirA^Vp和PirB^Vp)导致(Kumar et al, 2021; Lightner et al, 2012; Tran et al, 2013)。对虾患病后，常表现出厌食、空肠空胃、肝胰腺肿大、质地松软等症状(Lee et al, 2015)。在对其基本病理研究中发现，Vp_AHPND附着在对虾的胃中，然后将致病的PirAB^Vp毒素分泌到肝胰腺(靶器官)，导致上皮细胞的分离和分解，使其成为细菌复制的底物，最终破坏肝胰腺的功能(Lai et al, 2015)。Soonthornchai等(2015)对斑节对虾感染Vp_AHPND后的胃、中肠和后肠进行扫描电镜(SEM)检查，发现Vp_AHPND可以通过口饲感染，经过胃到达中肠部位附着、增殖并造成组织损伤。

探究病原感染宿主的不同途径以及感染后在宿主体内各组织的分布及增殖特点是病理研究的基础(汪开毓等, 2007)，也是育种工作中科学制定抗性测试方法、准确获取抗性性状测试数据的重要参考依据。目前，关于AHPND的研究多为关于防范与治疗，如在水体中添加噬菌体杀灭弧菌(González-Gómez et al, 2023)、在饲料中添加生物制剂及植物提取物提高免疫力(Wanvimonsuk et al, 2023; Mantaring et al, 2024)、通过转录组学技术手段找到相关免疫通路(Miao et al, 2023)等。该病原在对虾体内分布及增殖特点方面，陈蒙蒙等(2018)通过浸浴方式，探究感染后濒死的凡纳对虾仔虾Vp_AHPND在对虾各组织内的分布及变化情况，发现鳃、肝胰腺、肌肉、肠均能检测到PirA^Vp基因，且总体呈先上升后下降的趋势。张倩(2022)对凡纳对虾[(5.15±1.6) g]进行注射感染AHPND，在0、1、2、3、8和12 d检测不同组织中的病原菌载量，发现肝胰腺的病原载量动态变化呈先上升后下降的趋势，而鳃与肌肉组织的病原载量动态变化无明显趋势。关于Vp_AHPND在对虾体内分布情况及扩增特点方面的研究仅集中在仔虾和幼虾阶段，且多使用浸泡、注射等感染方式。而在遗传育种中心的无特定病原(specific pathogen free, SPF)环境下，保种成虾更容易通过摄入外源饲料和添加剂等方式感染AHPND，针对这种口饲感染，尤其是摄食不同浓度病原的条件下，在不同时间下，各主要组织、器官病原的分布和增殖特点还未见系统研究的报道。

本研究以自主选育的高抗品系凡纳对虾为研究对象，通过课题组已建立的一套定量口饲感染的方式进行Vp_AHPND感染，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等技术手段，研究相对高、低浓度摄菌量的情况下，弧菌质粒在不同组织、不同时间的分布和增殖特点。研究结果可以更全面解析Vp_AHPND在对虾体内各组织的分布情况，为准确获取抗性测试数据的测试方法提供重要参考，同时可以为活体保种过程中准确检测采样组织、规范保种的防病监测提供基础数据支撑。

本实验所用凡纳对虾来自农业农村部海水养殖遗传育种中心(中国水产科学研究院黄海水产研究所鳌山基地)自主选育的某高抗品系9月龄保种亲虾，平均体重为(35±2) g。从核心群体中随机选取230尾个体，运至中国水产科学研究院黄海水产研究所对虾性状测试车间(山东青岛)作为感染实验材料。

感染实验前，随机采集10尾对虾进行病原检测。参照OIE(2023)水生动物疾病诊断手册(https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/aquatic-manual-online-access/)进行病原检测，检测病原包括白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vp_AHPND)、肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾血细胞虹彩病毒(shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV)、对虾偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus, CMNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus, IMNV)。以确保避免其他病原对实验结果造成干扰。

毒饵制备实验所用菌种来自自然资源部第三海洋研究所，于–80 ℃冰箱保存。毒饵制备参考田吉腾等(2023)(专利号CN202310391807.1)制备2种浓度含量的饲料，单颗粒(湿重5 mg)携菌量分别为10⁴ CFU、10⁶ CFU量级。每次投喂结束后，使用同批次毒饵进行涂板检测，以精确测定其病原浓度。

为了避免因养殖环境变化对数据造成影响，提前将测试对虾放入抗病测试防逃逸分隔装置(孔杰等, 2023)(专利号CN202320811114.9)进行3 d暂养。具体暂养条件：每2尾放入一个10 cm×15 cm×35 cm的亚克力盒中，每尾虾中间用隔板隔开；暂养温度从21 ℃开始，每天升温2 ℃，至(27.0±0.5) ℃；暂养期间每天上午吸底、换水，换水量为养殖水体的40%；10:00和22:00进行普通商品饲料的投喂，投喂量为体重的3%。

感染测试分为对照组、相对低摄菌量组(L组)、相对高摄菌量组(H组)，将对照组、L组、H组分别放置在3个车间以避免意外或交叉感染。选取180尾活力正常的对虾进行感染测试，2个实验组均设3个重复，每个重复30尾，分放至15个亚克力盒子中；另选取20尾作为对照组，放入10个亚克力盒子中。同组测试个体的水环境相通。

暂养结束后，对实验个体饥饿处理72 h以排空对虾肠胃，确保其对毒饵的摄入。针对L组和H组的实验个体，进行2次毒饵逐尾投喂，每尾虾投喂50 mg毒饵，第1次与第2次投喂间隔24 h。L组2批毒饵的病原含量经检测分别为4.76×10⁵ CFU/尾和1.76×10⁵ CFU/尾，H组2批毒饵的病原含量经检测分别为3.84×10⁷ CFU/尾和1.68×10⁷ CFU/尾。对照组投喂的饲料为常规培养液浸泡后的商品颗粒饲料，养殖条件与实验组保持一致。实验在不满足取样时终止。

样本采集及定量PCR从第2次投喂后的6 h开始计时，分别于3、6、9、24和48 h选取2个实验组活力较好的6尾个体进行取样，取样组织为鳃、胃、肠道、眼柄、肌肉、肝胰腺、第5游泳足(从基部剪取整只游泳足)、腹部神经和第2触角鞭(剪取基部1 cm段)。对照组同时取样。将组织样品经1×PBS冲洗后放入装有95%乙醇的1.5 mL无菌冻存管中，置于–20 ℃冰箱保存。使用酚–氯仿方法进行各组织DNA的提取，并用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，后统一稀释至20 ng/μL。通过RT-qPCR方法检测各组织中PirA^Vp基因拷贝数作为pVA1-like质粒拷贝数，代表弧菌变化情况。引物序列参考Han等(2015) (表 1)。RT-qPCR程序设置：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s；40个循环。

表 1(Tab.1)

表 1 VpAHPND PirAVp基因实时荧光定量PCR的引物和探针序列 Tab.1 The primers and probe sequence of the RT-qPCR for PirAVp gene of VpAHPND 基因Gene 引物Primer 引物序列Sequence of primers (5′~3′) 产物长度Length of the product/bp PirA PirA-F TTGGACTGTCGAACCAAACG 135 PirA-R GCACCCCATTGGTATTGAATG Probe AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGAA

表 1 VpAHPND PirAVp基因实时荧光定量PCR的引物和探针序列 Tab.1 The primers and probe sequence of the RT-qPCR for PirAVp gene of VpAHPND

在绝对定量检测过程中，需制备已知浓度的目标DNA或RNA(标准品)的标准曲线，用于确定病原体的绝对数量。其原理是将不同浓度的标准品与荧光信号强度相关联，使得可以从未知样本中的荧光信号强度推算出目标分子的拷贝数(Rutledge et al, 2003)。本实验标准品来自蔚来生物公司合成的PirA^Vp基因片段，确定其浓度后梯度稀释使用。

使用SPSS 26作为数据分析的软件，对各组织PirA^Vp拷贝数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，比较各组数据之间的差异，用Tukey′s-b检测法进行多重比较，用皮尔逊相关性分析(Pearson correlation coefficient)检测组织间PirA^Vp拷贝数的相关性。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

感染实验前的实验用虾病原检测结果显示，WSSV、Vp_AHPND、EHP、SHIV、CMNV和IMNV均为阴性，IHHNV为阳性。将已知浓度的PirA^Vp基因片段标准品(10⁸定量数值)进行梯度稀释，以稀释的梯度溶液为模板进行RT-qPCR扩增，标准曲线如图 1所示，其R²=0.998，回归方程为：

图 1(Fig. 1)

图 1 副溶血弧菌pVA1-like质粒PirAVp基因标准曲线 Fig.1 Standard curve for PirAVp gene of V. parahaemolyticus pVA1-like plasmid

式中，$N$为拷贝数，Ct为循环数。

感染测试共计持续78 h，2个实验组在各时间点死亡情况见图 2。对照组在实验过程中死亡2尾。L组不同重复平均死亡(15.2±2.6)尾，累计死亡46尾，死亡率为51.11%。H组不同重复平均死亡(16.6±2.5)尾，累计死亡50尾，死亡率为55.56%。2个实验组死亡数量无显著差异(P > 0.05)。从2个实验组的死亡数量累计图中可看出死亡曲线特点一致。在每个时间点，死亡率均无显著差异(P > 0.05)。2个实验组在计时后的3~6 h达到死亡高峰期，此后死亡数量呈下降趋势。

图 1(Fig. 1)

图 2 H组和L组死亡数量累计 Fig.2 The cumulative number of deaths in groups H and L

2个实验组各组织在不同时间点PirA^Vp拷贝数变化见图 3。在发病后48 h内，根据各组织PirA^Vp拷贝数变化趋势分为随时间先增加后降低状况的单峰趋势与波动趋势。L组有6个组织的质粒拷贝数呈单峰趋势，分别是鳃、眼柄、肌肉、第5游泳足、腹部神经和第2触角鞭(图 3L-1)；3个组织的质粒拷贝数呈波动趋势，分别是胃、肠道和肝胰腺(图 3L-2)。L组各组织质粒拷贝数达到最高的时间为9 h和24 h左右。其中，9 h质粒拷贝数达到最高的组织包括鳃[(348.5± 44.2) copies/ng]、胃[(228.2±29.9) copies/ng]、眼柄[(478.1±67.8) copies/ng]、肌肉[(247.3±37.1) copies/ng]和第2触角鞭[(395.8±45.4) copies/ng]；24 h质粒拷贝数达到最高的组织有肠道[(501.1±99.7) copies/ng]、肝胰腺[(314.8±46.9) copies/ng]、第5游泳足[(316.7± 24.4) copies/ng]、腹部神经[(549.8±90.3) copies/ng]。

图 1(Fig. 1)

图 3 L组、H组不同组织PirAVp拷贝数随时间变化 Fig.3 The PirAVp copy number of different tissues in groups L and H changed with time L-1：低摄菌量实验组单峰变化的组织质粒拷贝数；L-2：低摄菌量实验组双峰变化的组织质粒拷贝数；H-1：高摄菌量实验组单峰变化的组织质粒拷贝数；H-2：高摄菌量实验组双峰变化的组织质粒拷贝数 L-1: Single-peak tissue plasmid copy number in L group; L-2: Bimodal plasmid copy number of tissues in L group; H-1: Single-peak tissue plasmid copy number in H group; H-2: Bimodal plasmid copy number of tissues in H group.

H组有2个组织的质粒拷贝数变化呈单峰趋势，分别为胃和第5游泳足(图 3H-1)；有7个组织的质粒拷贝数变化呈波动趋势，分别为鳃、肠道、眼柄、肌肉、肝胰腺、腹部神经和第2触角鞭(图 3H-2)。H组不同组织的质粒拷贝数达到最高的时间分别为3、6、9和48 h。其中，在3 h腹部神经质粒拷贝数[(730.9± 78.9) copies/ng]达最高；在6 h第5游泳足质粒拷贝数[(464.8±50.9) copies/ng]达到最高；在9 h质粒拷贝数达到最高的组织为鳃[(957.9±206.8) copies/ng]、胃[(932.7±277.3) copies/ng]、肠道[(1 017.2±185.4) copies/ng]、眼柄[(486.9±57.3) copies/ng]、肌肉[(664.1± 91.0) copies/ng]、第2触角鞭[(444.6±55.5) copies/ng]；在48 h肝胰腺组织质粒拷贝数[(596.5± 103.4) copies/ng]达到最高。结果表明，不同摄菌量会影响各组织弧菌载量及随时间的变化特点。

同一时间点各组织间PirA^Vp拷贝数比较结果见图 4。在3 h，9个组织的质粒拷贝数H组均高于L组，且除胃和肠道外，均具有极显著性差异(P < 0.01)。在6 h，H组有7个组织的质粒拷贝数高于L组，且除鳃和第2触角鞭外，均有极显著性差异(P < 0.01)。在9 h，除眼柄与第2触角鞭外，H组有7个组织的质粒拷贝数为高于L组，均有极显著性差异(P < 0.01)。在24 h，H组有6个组织的质粒拷贝数高于L组，除肠道、肝胰腺和第2触角鞭外，均有极显著性差异(P < 0.01)，L组第5游泳足和腹部神经的质粒拷贝数高于H组，且第5游泳足有极显著性差异(P < 0.01)。在48 h，H组有9个组织的质粒拷贝数极显著高于L组(P < 0.01)。在所有组织不同时间点的比较中，H组极显著高于L组的有32个；1个H组显著高于L组；1个L组极显著高于H组；11个H组、L组无显著差异。以上结果表明，不同的摄菌量显著影响致病质粒的拷贝数，高摄菌量组在大部分时间点、大多数组织中质粒拷贝数高于低摄菌量组。

图 1(Fig. 1)

图 4 L组、H组的相同组织PirAVp拷贝数对比 Fig.4 Comparison of PirAVp copy numbers between L and H groups 1：鳃；2：胃；3：肠道；4：眼柄；5：肌肉；6：肝胰腺；7：第5游泳足；8：腹部神经；9：第2触角鞭。*为P < 0.05显著差异，**为P < 0.01极显著差异。 1: Gill; 2: Stomach; 3: Intestine; 4: Eyestalk; 5: Muscle; 6: Hepatopancreas; 7: Fifth pleopod; 8: Abdominal nerve; 9: Second antennae flagellum. *: Significant difference, P < 0.05; **: Highly significant difference, P < 0.01.

低摄菌量组(L组)与高摄菌量组(H组)各组织不同时间点质粒拷贝数均值见表 2。L组所有时间点不同组织中平均质粒拷贝数范围为97.3~269.9 copies/ng；H组所有时间点不同组织平均质粒拷贝数范围为250.9~507.2 copies/ng。H组比L组同种组织质粒拷贝数高1.9~4.9倍。将各组织质粒拷贝数平均值由高到低进行排序，L组顺序为腹部神经、肠、肝胰腺、第5游泳足、眼柄、肌肉、鳃、第2触角鞭、胃；H组顺序为腹部神经、肠、鳃、胃、肌肉、肝胰腺、眼柄、第5游泳足、第2触角鞭。结果表明，PirA^Vp拷贝数在对虾体内各组织分布特点不同，其中，腹部神经和肠在L组和H组排名均位于前列。

表 2(Tab.2)

表 2 L组与H组各组织质粒拷贝数均值排名 Tab.2 Average ranking of plasmid copy numbers in groups L and H 低摄菌量组L group 高摄菌量组H group 组织 Tissue 平均值Mean /(copies/ng) 组织 Tissue 平均值Mean /(copies/ng) 腹部神经Abdominal nerve 269.9±80.2 腹部神经Abdominal nerve 507.2±65.7 肠Intestine 261.2±69.6 肠Intestine 490.7±167.8 肝胰腺Hepatopancreas 207.6±58.7 鳃Gill 485.2±143.2 第5游泳足Fifth pleopod 190.3±37.5 胃Stomach 474.8±175.7 眼柄Eyestalk 175.2±83.4 肌肉Muscle 407.1±93.0 肌肉Muscle 149.1±47.5 肝胰腺Hepatopancreas 373.0±64.3 鳃Gill 136.0±36.2 眼柄Eyestalk 365.0±89.7 第2触角鞭Second antennae flagellum 119.4±97.1 第5游泳足Fifth pleopod 364.5±50.0 胃Stomach 97.3±38.6 第2触角鞭Second antennae flagellum 250.9±77.7

表 2 L组与H组各组织质粒拷贝数均值排名 Tab.2 Average ranking of plasmid copy numbers in groups L and H

2个实验组不同组织间弧菌质粒变化相关性见表 3和表 4。L组肌肉与第5游泳足、第5游泳足与腹部神经、鳃与第2触角鞭的弧菌质粒变化有显著相关性(P < 0.05)，皮尔逊相关系数分别为0.946、0.944和0.928；眼柄与鳃、眼柄与第2触角鞭的弧菌质粒变化有极显著相关性(P < 0.01)，皮尔逊相关性分别为0.976和0.974。H组肌肉与第2触角鞭的弧菌质粒变化有极显著相关性(P < 0.01)，皮尔逊相关性为0.960。弧菌在各组织变化关联性在不同摄菌量下表现不同。2个实验组均未发现质粒拷贝数与死亡率、摄菌时间有显著相关性。

表 3(Tab.3)

表 3 L组各组织弧菌质粒变化相关性 Tab.3 Correlation between plasmid changes of Vibrio in various tissues of Group L 时间 Time 死亡率 Mortality 鳃 Gill 胃 Stomach 肠 Intestine 眼柄 Eyestalk 肌肉 Muscle 肝胰腺 Hepato-pancreas 第5游泳足 Fifth pleopod 腹部神经 Abdominal nerve 第2触角鞭 Second antennae flagellum 时间 Pearson correlation 1 -0.545 -0.429 -0.576 -0.236 -0.242 0.155 0.042 0.309 0.2 -0.232 Time Sig.(2-tailed) 0.342 0.471 0.309 0.702 0.694 0.803 0.946 0.612 0.747 0.708 死亡率 Pearson correlation -0.545 1 0.54 0.1 -0.104 0.362 0.167 0.581 0.134 0.006 0.19 Mortality Sig.(2-tailed) 0.342 0.347 0.873 0.868 0.549 0.788 0.304 0.83 0.992 0.76 鳃 Pearson correlation -0.429 0.54 1 0.794 0.431 0.967" 0.669 0.143 0.427 0.282 0.928* Gill Sig.(2-tailcd) 0.471 0.347 0.108 0.468 0.007 0.217 0.819 0.473 0.646 0.023 胃 Pearson correlation -0.576 0.1 0.794 1 0.629 0.788 0.433 -0.291 0.146 0.167 0.867 Stomach Sig.(2-tailed) 0.309 0.873 0.108 0.256 0.113 0.467 0.635 0.815 0.789 0.057 肠 Pearson correlation -0.236 -0.104 0.431 0.629 1 0.553 0.707 0.249 0.645 0.802 0.563 Intestine Sig.(2-tailed) 0.702 0.868 0.468 0.256 0.333 0.182 0.686 0.24 0.102 0.323 眼柄 Pearson correlation -0.242 0.362 0.967** 0.788 0.553 1 0.809 0.152 0.585 0.448 0.975** Eyestalk Sig.(2-tailed) 0.694 0.549 0.007 0.113 0.333 0.097 0.807 0.3 0.449 0.005 肌肉 Pearson correlation 0.155 0.167 0.669 0.433 0.707 0.809 1 0.509 0.946* 0.861 0.738 Muscle Sig.(2-tailed) 0.803 0.788 0.217 0.467 0.182 0.097 0.381 0.015 0.061 0.155 肝胰腺 Pearson correlation 0.042 0.581 0.143 -0.291 0.249 0.152 0.509 1 0.692 0.666 -0.055 Hcpatopancrcas Sig.(2-tailcd) 0.946 0.304 0.819 0.635 0.686 0.807 0.381 0.195 0.22 0.93 第5游泳足 Pearson correlation 0.309 0.134 0.427 0.146 0.645 0.585 0.946* 0.692 1 0.944* 0.48 Fifth pleopod Sig.(2-tailed) 0.612 0.83 0.473 0.815 0.24 0.3 0.015 0.195 0.016 0.414 腹部神经 Pearson correlation 0.2 0.006 0.282 0.167 0.802 0.448 0.861 0.666 0.944* 1 0.364 Abdominal nerve Sig.(2-tailed) 0.747 0.992 0.646 0.789 0.102 0.449 0.061 0.22 0.016 0.547 第2触角鞭 Pearson correlation -0.232 0.19 0.928* 0.867 0.563 0.975** 0.738 -0.055 0.48 0.364 1 Second antennae flagellum Sig.(2-tailed) 0.708 0.76 0.023 0.057 0.323 0.005 0.155 0.93 0.414 0.547 注：*为p<0.05显著差异，**为P<0.01极显著差异。下表同。 Note: *: Significant difference, P<0.05; **: Highly significant difference, P<0.01. The same below.

表 3 L组各组织弧菌质粒变化相关性 Tab.3 Correlation between plasmid changes of Vibrio in various tissues of Group L

表 4(Tab.4)

表 4 H组各组织弧菌质粒变化相关性 Tab.4 Correlation between plasmid changes of Vibrio in various tissues of Group H 时间 Time 死亡率 Mortality 鳃 Gill 胃 Stomach 肠 Intestine 眼柄 Eyestalk 肌肉 Muscle 肝胰腺 Hepato-pancreas 第5游泳足 Fifth pleopod 腹部神经 Abdominal nerve 第2触角鞭 Second antennae flagellum 时间 Pearson correlation 1 -0.545 0.113 -0.548 -0.179 0.546 -0.13 0.854 -0.775 -0.213 -0.367 Time Sig.(2-tailed) 0.342 0.857 0.339 0.774 0.341 0.835 0.065 0.123 0.73 0.544 死亡率 Pearson correlation -0.545 1 -0.274 0.809 0.042 -0.733 -0.462 -0.636 0.491 -0.69 -0.38 Mortality Sig.(2-tailed) 0.342 0.656 0.097 0.946 0.159 0.433 0.248 0.401 0.198 0.528 鳃 Pearson correlation 0.113 -0.274 1 0.335 0.442 0.794 0.875 0.606 0.169 0.319 0.726 Gill Sig.(2-tailed) 0.857 0.656 0.582 0.456 0.108 0.052 0.278 0.786 0.601 0.165 胃 Pearson correlation -0.548 0.809 0.335 1 0.333 -0.259 0.118 -0.319 0.633 -0.411 0.132 Stomach Sig.(2-tailed) 0.339 0.097 0.582 0.584 0.674 0.851 0.601 0.251 0.492 0.833 肠 Pearson correlation -0.179 0.042 0.442 0.333 1 0.052 0.356 0.057 -0.215 0.03 0.321 Intestine Sig.(2-tailcd) 0.774 0.946 0.456 0.584 0.933 0.556 0.927 0.729 0.962 0.598 眼柄 Pearson correlation 0.546 -0.733 0.794 -0.259 0.052 1 0.747 0.877 -0.174 0.474 0.562 Eyestalk Sig.(2-tailed) 0.341 0.159 0.108 0.674 0.933 0.147 0.051 0.78 0.42 0.325 肌肉 Pearson correlation -0.13 -0.462 0.875 0.118 0.356 0.747 1 0.382 0.306 0.727 0.960** Muscle Sig.(2-tailed) 0.835 0.433 0.052 0.851 0.556 0.147 0.526 0.617 0.164 0.009 肝胰腺 Pearson correlation 0.854 -0.636 0.606 -0.319 0.057 0.877 0.382 1 -0.526 0.066 0.124 Hepatopancreas Sig.(2-tailed) 0.065 0.248 0.278 0.601 0.927 0.051 0.526 0.363 0.916 0.843 第5游泳足 Pearson correlation -0.775 0.491 0.169 0.633 -0.215 -0.174 0.306 -0.526 1 0.194 0.454 Fifth pleopod Sig.(2-tailed) 0.123 0.401 0.786 0.251 0.729 0.78 0.617 0.363 0.754 0.443 腹部神经 Pearson correlation -0.213 -0.69 0.319 -0.411 0.03 0.474 0.727 0.066 0.194 1 0.819 Abdominal nerve Sig.(2-tailed) 0.73 0.198 0.601 0.492 0.962 0.42 0.164 0.916 0.754 0.09 第2触角鞭 Pearson correlation -0.367 -0.38 0.726 0.132 0.321 0.562 0.960** 0.124 0.454 0.819 1 Second antennae flagellum Sig.(2-tailed) 0.544 0.528 0.165 0.833 0.598 0.325 0.009 0.843 0.443 0.09

表 4 H组各组织弧菌质粒变化相关性 Tab.4 Correlation between plasmid changes of Vibrio in various tissues of Group H

在对某性状进行人工选育之前，需要首先评估目标性状是否具有选育潜力，进一步通过精准的性状测试和配种方案，通过大规模家系选育的方式进行新品系/种的培育。本课题组刘绵宇(2023)、刘杨(2023)等通过AHPND浸浴感染法、梯度浸浴感染法发现，凡纳对虾不同品系间、同品系不同家系间具有显著存活差异；抗AHPND性状有中低水平的遗传力，具有多世代抗性选育潜力。因此，探究合适的致病方式和病原在体内变化规律是制定精准的感染、测试方案的基础。本团队建立了一种采用菌液浸泡商品颗粒饲料口饲毒饵式感染，与反向管饲感染法(Lee et al, 2015)、注射感染法(Maralit et al, 2018)相比，可有效降低对虾的应激反应，避免表皮损伤与应激式蜕皮(Saulnier et al, 2000)；同时，相较于使用病死对虾的肌肉进行口饲感染(Angthong et al, 2017)、单次浸泡感染(Boonchuen et al, 2018)和梯度浸泡感染(Ng et al, 2018)等方式更精确地控制了对虾弧菌摄入量。在开展本实验所在的农业农村部海水养殖遗传育种中心SPF环境中，保种的种虾通过水体感染AHPND的风险较低，而饲料及添加剂中含有AHPND的风险较高，对虾容易通过摄食的方式感染此病原，故口饲感染法是更接近保种群体感染的方式。在实验材料方面，前人均使用养殖行业商品规格成虾、幼虾或仔虾(20 g以下)作为实验材料，而在体重较大的种虾中研究较少。在各组织部位病原量检测方面，前人的研究多数聚焦于对虾的鳃、胃、肝胰腺、肠道和肌肉(陈蒙蒙等, 2018; 张倩, 2022)，本研究除了以上5个组织，还增加了第2触角鞭、腹部神经、眼柄和第5游泳足4种组织。

本研究设置相对高、低2个不同摄菌量实验组，虽然两组的摄菌量差别为10²数量级，且组织定量结果验证了体内质粒含量的差异(H组比L组同种组织平均质粒拷贝数高1.9~4.9倍)，但研究结果显示，两组的累计死亡率和死亡速度并无统计学显著差异，这与Yang等(2021)发现的不同浓度弧菌胁迫死亡率结果不一致。这可能是由以下几点原因造成的：首先，本研究中L组的摄菌量(10⁵ CFU/尾)可能已达到能够引发明显病理反应的阈值。已有研究表明，Vp_AHPND感染存在一个阈值，在某个感染浓度下，即使进一步提高感染浓度，也可能不会对死亡率产生更大的影响(张倩, 2022)；同时，预实验发现，摄食1.7×10⁴ CFU数量级毒饵的对虾在48 h未有明显发病的迹象，因此推测，通过口饲方式感染凡纳对虾成虾的发病浓度可能在10⁴~10⁵ CFU/尾之间，但是否存在一个具体的发病浓度阈值还需进一步研究。其次，虽然2个实验组在弧菌摄入量上存在10²量级显著差异，但体内的质粒拷贝数差异量级并没有达到该量级。这暗示摄菌量的增加并不一定会导致体内质粒拷贝数等比例增加。因此，后续还需要进一步探究增加毒饵的摄入量与提高体内质粒拷贝数的关系，进而了解对虾的死亡速度与弧菌胁迫浓度的关系。

预实验发现，商品颗粒饲料最大携菌量受浸泡菌液浓度与颗粒饲料大小限制，本实验所用颗粒饲料最大携菌量为10⁶ CFU/粒，为避免毒饵携菌量因对虾摄食过程中的海水浸泡造成与测量值产生显著差异，本研究选择投喂10粒(湿重50 mg)毒饵。因虾体规格过大，无法满足单次投喂即可发病，经不断摸索发现，在投喂2次、每次摄菌量超过10⁵ CFU/尾后，第2次投喂后6 h产生AHPND发病症状。根据以上综合考虑，确定了本研究感染方式与病原感染量。AHPND具有发病时间短、致死迅速等特点(Tran et al, 2013)，预实验结果发现在48 h即可达到半数致死。根据前人研究(张倩, 2022; Chandran et al, 2023; Tang et al, 2020)及在实验材料数目限制条件下，本研究选择3、6、9、24和48 h作为取样时间点。在48 h后由于样品剩余数目的原因不适合继续取样，故本实验的测试及取样在48 h终止。本研究实验材料经全病原暴露(all pathogen exposed, APE)方式选育，目标品系虽携带IHHNV病毒但并不发病，且IHHNV病毒具有垂直传播的特点(Yu et al, 2021)，故本实验对虾携带IHHNV病原并不影响AHPND的感染与发病规律。

陈蒙蒙等(2018)使用浸浴感染方式探究对虾AHPND发病情况与质粒拷贝数关系，通过组织切片与RT-qPCR联合分析，发现在整个实验过程中(24、48和72 h)，濒死和存活对虾质粒拷贝数无显著差异。Tinwongger等(2016)同样使用浸浴感染方式感染对虾，利用Western Blotting和RT-qPCR手段证实了副溶血弧菌分泌PirAB^Vp毒力蛋白数量与发病情况具有显著性关系，而质粒拷贝数与死亡率、发病情况无关联。在本研究不同组织质粒拷贝结果中，2个实验组均未发现各组织质粒拷贝数与死亡率、摄菌时间有显著相关性，说明质粒拷贝数虽能证实其发病，但不能通过质粒含量推测死亡速率及累计死亡量。L组各组织质粒拷贝数变化趋势中，6个组织呈单峰形态，3个组织呈波动形态；H组中2个组织呈单峰形态，7个组织呈波动形态，2个实验组同组织载菌量变化不具有相似性。L组和H组各组织间PirA^Vp拷贝数差异结果显示，不同的摄菌量会影响各组织载菌量及分布特点；L组与H组组织间弧菌质粒变化相关性显示，L组有3对组织(肌肉与第5游泳足、第5游泳足与腹部神经、鳃与第2触角鞭)弧菌质粒变化有显著相关性，2对组织(眼柄与鳃、眼柄与第2触角鞭)弧菌质粒变化有极显著相关性；而在H组中，仅有1对组织(肌肉与第2触角鞭)弧菌质粒变化有极显著相关性。这与梁箫等(2018)和杨千元等(2021)发现的生物各组织部位免疫能力与病原含量、酶活性等因素有关，进而造成各组织部位弧菌变化情况不具有联系的结论一致。综上结果表明，本研究质粒拷贝数不能预测死亡数量情况。不同摄菌量不仅会影响病原在体内的初始分布情况，且在体内变化情况也有所不同，说明病原在体内的变化情况不仅是极其复杂的过程，同时病原各组织变化不具有关联性，这与Kim等(2014)高、低不同的病原菌攻毒浓度会影响宿主产生不同的免疫应答进而影响各组织病原含量结论相一致。关于凡纳对虾抗AHPND的免疫机理仍需进一步研究。

在整体实验中，2个实验组各时间点所有组织均能检测出PirA^Vp，腹部神经与肠道平均检测量高于其他组织，说明腹部神经与肠道均为适宜弧菌附着增殖的组织，这与Soonthornchai等(2015)发现Vp_AHPND可以通过口饲感染，经过胃到达中肠部位附着、增殖结论一致。后续可进一步探究腹部神经在感染后的作用。根据FAO AHPND治理手册(Tang et al, 2020)，目前关于AHPND病原检测的材料为水质、粪便和对虾组织(肌肉、肝胰腺和鳃)。水质和粪便的病原检测准确性较低，而对虾组织病原检测虽然准确性较高，但需要将检测个体解剖，不适用于活体对虾的检测。筛选病原检测准确性高且对虾体伤害小的组织，并对保种成虾常态化活体病原监测有着重要意义。本研究发现，第5游泳足与第2触角鞭平均PirA^Vp拷贝数虽不是最高水平，但能稳定检测到PirA^Vp质粒，因此，游泳足与第2触角鞭可作为对虾活体AHPND检测的适宜组织。

综上，本研究表明，口饲毒饵式感染可作为一种稳定的感染AHPND方式。弧菌的摄入量不同会影响pVA1-like质粒在各组织的分布与变化，但弧菌在各组织中的含量变化不具有相关性。质粒拷贝数在一定范围内仅能说明对虾病原侵染情况，不能推测其死亡量及死亡速度。腹部神经和肠道是弧菌含量最高的组织。游泳足和第2触角鞭可作为对虾活体AHPND检测的适宜材料。