动物的性别决定是指个体发育成雌性或雄性的机制，主要取决于遗传型性别决定(genetic sex determination, GSD)、环境型性别决定(environmental sex determination, ESD)以及二者的共同作用(Hayes, 1998)。性别分化则是以性别决定为前提，从未分化性腺发育成成熟精巢或卵巢的过程(Piferrer et al, 2008)。在脊椎动物中，鱼类处于性别进化过程中的原始阶段，其性别决定与分化机制较为复杂。其中，GSD又可以分为染色体决定机制(chromosomal SD)和多基因决定机制(polygenic SD)两种类型。其中，XX/XY型、ZZ/ZW型、ZO/ZZ和XX/XO型等均是染色体决定机制中的常见类型；除此之外，还有部分鱼类，如斑马鱼(Danio rerio)等的性别是由基因组上多个基因联合，或由1对染色体上的多个等位基因累积效应所决定，因此称为多基因性别决定(Liew et al, 2012)。由此可见，鱼类的性别决定不仅受到性染色体控制，同时也可能受到常染色体的影响(童金苟等, 2003)。环境型性别决定类型中，温度、光照及pH等均会对鱼类的性别产生直接或间接的影响。例如，温度会影响牙鲆(Paralichthys lethostigma)幼鱼的表型性别，当温度接近23 ℃时雌性比例最高，而高温(> 27 ℃)则会使牙鲆产生雄性偏向的性别比例(雄性比例高达94%) (Honeycutt et al, 2019)；将鲷科(Sparidae)鱼类(Pelvicachromis pulcher)受精卵置于不同pH的水箱内处理30 d，随后将pH恢复到标准值(pH 6.0)再饲养330 d，pH 5.5处理后的雄性性别比例显著高于pH 6.5组，表明pH变化亦能够改变养殖群体性别比例(Reddon et al, 2013)。

近年来，随着各类生物技术的不断发展，已成功筛选并鉴定出部分与鱼类性别决定与分化相关的基因，例如Dmrt1作为目前已知的最保守的性别分化基因，是唯一同时参与脊椎和无脊椎动物性别决定的基因(Raymond et al, 1998)；Sox9基因是Sox家族的一员，与鱼类雄性性别分化和精巢发育密切相关(路畅等, 2014)；Amh (Liu et al, 2022)、Cyp19 (Tchoudakova et al, 1998)、Gdf6 (Reichwald et al, 2015)等基因参与鱼类性别决定、性别分化和胚胎发育等过程。

军曹鱼(Rachycentron canadum)属鲈形目(Perciformes)、军曹鱼科(Rachycentridae)、军曹鱼属(Rachycentron)，广泛分布于热带和亚热带水域，其生长速度快，具有广温广盐性，是我国南方重要的海水网箱养殖鱼类之一(Joan Holt et al, 2007)。然而，目前关于军曹鱼性别决定与分化研究报道较为有限，在繁育过程中难以依靠外部形态对雌雄军曹鱼亲鱼进行性别鉴别，因此，亟需针对上述问题开展深入研究。已有研究表明，军曹鱼染色体核型中未发现异形性染色体(刘楚吾等, 2008)，且其在生命周期中无性反转情况发生。此外，本团队亦针对军曹鱼早期性腺发育规律开展了系统研究，并检测了vasa (Ma et al, 2022)、dnd (邝杰华等, 2022)等生殖细胞标记基因在性腺分化与发育过程中的表达情况。本研究基于前期获取的军曹鱼全基因组信息，从中查找出部分已报道的鱼类性别决定与分化相关基因，首先对其进行染色体定位和系统发育分析，随后利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测这些基因在军曹鱼成鱼的组织表达分布及其在不同发育期的性腺组织中的表达水平，旨在筛选出性别特异性表达的基因，为进一步探讨军曹鱼的性别决定及分化机制提供研究素材，并为军曹鱼性别标记的筛选提供参考。

实验用军曹鱼取自广东恒兴饲料实业股份有限公司863基地，实验用鱼经麻醉剂(丁香酚)麻醉后，首先进行生物学指标测量，随后立即解剖取出两叶性腺组织分开保存。同一尾鱼的其中一叶性腺放入冻存管后立即放入液氮罐中，随后转移至–80 ℃超低温冰箱保存，用于qRT-PCR检测；另一叶性腺放入4%多聚甲醛(PFA)中固定48 h后转入75%酒精中保存于–20 ℃冰箱，用于组织切片、HE染色以进行性别和性腺分期鉴定。性腺分期的鉴定参照刘筠(1993)对鱼类性腺发育时期的划分标准。从中选取性腺发育时期为Ⅲ~Ⅴ期的雄鱼[体重为(1 753.31±575.02) g，体长为(55.41±5.71) cm]和雌鱼[体重为(2 167.07±1 254.63) g，体长为(58.72±5.10) cm]各9尾，用于性别决定与分化相关基因在军曹鱼性腺发育过程中的表达模式分析。此外，分别采集性腺发育为Ⅲ期的3尾雌鱼和3尾雄鱼，解剖并分离肝脏、脑、肌肉、皮肤、鳃、眼睛、头肾、体肾、胃、脾脏、心脏和肠道组织于液氮中速冻，随后转移至–80 ℃超低温冰箱，用于qRT-PCR检测各基因的组织表达分布情况。

组织样品在液氮中快速研磨后，以Trizol法抽提总RNA，通过超微量核酸蛋白测定仪(Biochrom)检测总RNA的浓度和纯度，并用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。分别以提取的总RNA各3 μg为模板，采用EasyScript One-step cDNA Synthesis试剂盒(北京全式金生物有限公司)反转录合成第一链cDNA。

从课题组前期获得的军曹鱼全基因组数据(PRJNA634421)中筛选出5个鱼类性别决定与分化候选基因(Cyp19a1b、Dmrt1、Amh、Gdf6a/6b和Sox9a/9b)，经NCBI数据库Blast比对及PCR产物测序验证后，利用Premier Primer 6.0设计用于qRT-PCR的特异性引物(表 1)，产物片段为80~200 bp。

表 1(Tab.1)

表 1 5个性别决定与分化相关基因的特异性引物 Tab.1 Specific primers for five genes related to sex determination and differentiation 基因名Gene name 引物序列Primer sequence (5′~3′) 产物大小Product size/bp Cyp19a1b ACACTCTGTCCATCAGCCTCTTC AGCGTTCATCTCCTCCACTATCC 89 Dmrt1 CGGAGGTGATGGTGAAGAACGAAG TGGAGGACGACGCTGAGTGAC 129 Amh CCAGAGCAGACCCCAGTAAC TTGATGTTGGCGGTGTTTGG 106 Sox9a CCGGACTACAAGTACCAGCC ATTGGGGGAAATGTGCGTCT 96 Sox9b CTGAGCCCCAGTCACTACAG TGAGCCTTGACCATGCG 177 Gdf6a GGGTCACTCTGGGCAAATCA GCTTCCTCCTTCTCTCCGAC 187 Gdf6b GATCTCCACCACTTCGCTTTG TCTGTCGATGGAAGCTGGC 174 β-actin AGGGAAATTGTGCGTGAC AGGCAGCTCGTAGCTCTT 100

表 1 5个性别决定与分化相关基因的特异性引物 Tab.1 Specific primers for five genes related to sex determination and differentiation

基于军曹鱼全基因组测序数据获取5个性别决定与分化相关基因的染色体定位信息，利用TBtools软件对其进行染色体定位。从NCBI数据库中下载XX/XY型的日本青鳉(Oryzias latipes)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、ZZ/ZW型的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、多基因性别决定的斑马鱼的全基因组和基因注释文件，利用TBtools软件中的MCScanX插件对军曹鱼及上述鱼类的5个性别决定与分化相关基因进行物种间共线性分析。

利用DNAMAN软件分别将5个基因的核酸序列翻译为氨基酸序列，使用NCBI数据库上的Protein BLAST对氨基酸序列进行比对，分别下载其他硬骨鱼类及高等脊椎动物的氨基酸序列，利用MEGA 11软件，以邻接法(neighbour-joining, NJ)构建系统进化树，针对进化树各分支结点均进行1 000次重复计算检验。

以军曹鱼成鱼不同组织和各期性腺的cDNA为模板，以β-actin为内参基因，qRT-PCR实验体系及流程按照SYBR^® Premix Ex Taq^TM试剂盒(北京全式金生物有限公司)说明书进行操作。其中，qRT-PCR反应体系10 μL，PCR程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45个循环，每个实验样品设置3个重复，使用实时荧光定量PCR仪(Light Cycler96^®, Roche)检测各基因在不同组织和各期性腺中的表达水平。依据每个样本的Ct值，采用2^–ΔΔCt方法对数据进行处理，计算各基因的相对表达量，数据结果均以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

军曹鱼性腺组织切片如图 1所示，精巢处于Ⅲ期时(图 1a)，精巢呈白色长条状，精小叶散布于整个精巢中，精小囊内可见大量初级精母细胞和次级精母细胞；Ⅳ期(图 1b)，精巢白色长条状，精小叶的形状逐渐变得狭长，呈块状密集分布，精小囊以次级精母细胞为主，精小叶腔中充斥精细胞，部分精细胞已开始变态为精子；V期(图 1c)，精巢体积达到最大，精小叶变得更为狭长，从精巢中央向边缘呈辐射状分布，大部分精细胞已变态为精子，可观察到密集的精细胞与成熟精子充满整个精小叶腔。

图 1(Fig. 1)

图 1 军曹鱼性腺组织学观察 Fig.1 Histological observations on the gonads of R. canadum PSC：初级精母细胞；SSC：次级精母细胞；ST：精细胞；SP：精子；NU：核仁；OD：油滴；FM：滤泡膜；Ⅲ：第Ⅲ时相卵母细胞；Ⅳ：第Ⅳ时相卵母细胞；Ⅴ：第Ⅴ时相卵母细胞 PSC: Primary spermatocyte; SSC: Secondary spermatocyte; ST: Spermatid; SP: Spermatozoa; NU: Nucleolus; OD: Oil droplet; FM: Follicular membrane; Ⅲ: Oocyte at Stage Ⅲ; Ⅳ: Oocyte at Stage Ⅳ; Ⅴ: Oocyte at Stage Ⅴ

卵巢处于Ⅲ期时(图 1d)，卵巢呈微黄的粗棒状，表面可见密布的血管，此时卵巢中出现Ⅲ时相的卵母细胞，细胞膜内缘出现液泡并向细胞核逐渐充满细胞质，细胞核边缘出现油滴，并向细胞质外缘扩增，卵母细胞已经具有两层滤泡膜；Ⅳ期(图 1e)，卵巢淡黄色，以Ⅳ时相卵母细胞为主，卵母细胞体积不断增大，细胞质中逐渐充满卵黄颗粒，油滴充满于细胞质中，核膜逐渐内褶直至消失；V期(图 1f)，细胞核出现极化现象，移向动物极，随后核膜破裂，核物质分散在细胞质中，细胞核分解消失，细胞内充满卵黄颗粒和油滴，卵巢以富含卵黄物质的第V时相卵母细胞为主。

如图 2所示，军曹鱼Amh、Cyp19a1b和Dmrt1分别位于Chr7、Chr10和Chr8上，Gdf6a和Gdf6b分别位于Chr4和Chr16上，Sox9a和Sox9b分别位于Chr21和Chr19上。

图 1(Fig. 1)

图 2 5个性别决定与分化相关基因在军曹鱼染色体上的定位 Fig.2 Localization of five genes related to sex determination and differentiation on the chromosomes of R. canadum

共线性分析结果如图 3所示，军曹鱼Gdf6a、Amh、Cyp19a1b与XX/XY型的日本青鳉和尼罗罗非鱼、ZZ/ZW型的半滑舌鳎和奥利亚罗非鱼、多基因性别决定的斑马鱼等鱼类存在共线性关系。其中，位于军曹鱼Chr4上的Gdf6a与斑马鱼(Chr16和Chr19)、日本青鳉(Chr11和Chr16)、尼罗罗非鱼(Chr11和Chr22)、半滑舌鳎(Chr13和Chr18)、奥利亚罗非鱼(Chr11和Chr22)存在共线性关系；位于军曹鱼Chr7上的Amh与斑马鱼Chr22、日本青鳉和尼罗罗非鱼Y染色体、半滑舌鳎Chr2、奥利亚罗非鱼Chr23存在共线性关系；位于军曹鱼Chr10上的Cyp19a1b与日本青鳉Chr6、尼罗罗非鱼Chr7、半滑舌鳎Chr6和奥利亚罗非鱼的Chr7存在共线性关系。

图 1(Fig. 1)

图 3 5个性别决定与分化相关基因在军曹鱼与其他硬骨鱼类基因组间的共线性分析 Fig.3 Analysis of covariance of five sex determination and differentiation-related genes between genomes of R. canadum and other teleosts

由于军曹鱼Amh基因与XX/XY型鱼类(尼罗罗非鱼和日本青鳉)存在共线性(并且该基因位于Y染色体上)，因此，对军曹鱼与尼罗罗非鱼和日本青鳉的染色体进行共线性分析(图 4)，结果表明，军曹鱼的Chr7与2种XX/XY型鱼的Y染色体具备同源性。

图 1(Fig. 1)

图 4 军曹鱼与XX/XY型鱼类(尼罗罗非鱼与日本青鳉)染色体间共线性分析 Fig.4 Analysis of covariance between the chromosome of R. canadum and XX/XY-type fishes (O. niloticus and O. latipes)

系统进化分析结果显示，5个基因各自聚为一簇(Sox9a和Sox9b聚为一簇，Gdf6a和Gdf6b聚为一簇)，各基因簇中硬骨鱼类均形成单独分支，独立于其他高等脊椎动物之外(图 5)。军曹鱼Amh、Dmrt1、Cyp19a1b和Gdf6a与䲟鱼(Echeneis naucrates)的亲缘关系最近，Gdf6b与日本花鲈(Lateolabrax japonicus)的亲缘关系最近，Sox9a和Sox9b与高体(Seriola dumerili)的亲缘关系最近。

图 1(Fig. 1)

图 5 基于NJ法构建的系统进化树 Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on the neighbor-joining (NJ) method 图中不同颜色表示不同基因，星号表示军曹鱼基因 Different colors in the diagram indicate different genes, and asterisks indicate genes in the R. canadum

如图 6所示，5个基因在军曹鱼Ⅲ~Ⅴ期卵巢中的表达量极低，在精巢中的表达量均显著高于同时期卵巢(P < 0.01)。在性腺成熟过程中，Cyp19a1b、Amh、Sox9a、Gdf6a、Gdf6b和Dmrt1的表达量均在Ⅳ期显著升高至最大值后显著降低(P < 0.05)，Sox9b的表达量则持续显著降低(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 6 性别决定与分化相关基因在军曹鱼Ⅲ~Ⅴ期性腺中的表达情况 Fig.6 Expression of sex-determination and differentiation-related genes in stage Ⅲ~Ⅴ gonads of R. canadum 上标不同字母表示同一基因在性腺发育不同时期的表达量具有显著性差异(P < 0.05)，其中，卵巢用大写字母，精巢用小写字母。 Different letters in the superscript indicate significant differences in gene expression at different stages of gonad development (P < 0.05), where the ovaries are in capital letters and the spermathecae in lower case letters.

5个基因在14个不同组织的表达分布情况如图 7所示，军曹鱼Amh和Dmrt1仅在精巢中特异性表达，其他3个基因在性腺之外的其他组织，如心脏、脑和皮肤等组织有不同程度的表达。例如，Gdf6a在精巢中的表达量最高，其次为皮肤；Gdf6b在皮肤中的表达量最高，其次为精巢；Cyp19a1b在脑中表达量最高，其次是心脏；Sox9a在心脏中表达量最高，其次是皮肤，Sox9b在脑中表达量最高，其次是皮肤和心脏。

图 1(Fig. 1)

图 7 性别决定与分化相关基因在军曹鱼不同组织中的表达情况 Fig.7 Expression of sex-determination and differentiation-related genes in different tissues of R. canadum

军曹鱼与其他不同染色体核型的硬骨鱼类基因共线性分析结果显示，5个性别决定与分化相关基因中，仅有军曹鱼Amh的共线性基因定位于XX/XY型鱼类的Y染色体上，其他基因均定位于常染色体。共线性是指在一个物种的基因组中相互连锁的基因，在另一物种的基因组中也是连锁关系，而且在2个物种的遗传图上的位置也是相同的。在XX/XY型鱼类如尼罗罗非鱼的研究中，Amh/Amhy是尼罗罗非鱼的主性别决定基因，Amh基因的Ⅱ型受体(AmhrⅡ)也是尼罗罗非鱼雄性性别决定的关键因子，与同为XX/XY型的青鳉存在明显的共线性关系，二者存在相似的基因座位(赵九娥, 2015)。为了探索军曹鱼Chr7上的Amh与Y染色体之间的关系，本研究对军曹鱼和2种XX/XY型鱼类(尼罗罗非鱼与日本青鳉)进行染色体间的共线性分析，结果表明，军曹鱼Chr7与XX/XY型鱼类Y染色体之间具备同源性。

5个性别决定与分化相关基因中，Amh与鱼类的生殖细胞增殖和生殖能力有关，并且在性腺中高表达(Liu et al, 2022)。本研究显示，军曹鱼Amh仅在精巢中特异性表达，这一结果与双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrostum)(王且鲁等, 2016)和牙鲆(Wang et al, 2020)中的研究结果相似，进一步证实了Amh可能在无性染色体鱼类雄性性腺发育中的调控作用。对于具有性染色体的鱼类如XX/XY型的大口黑鲈(Micropterus salmoides)(李兵部等, 2023)和ZZ/ZW型的半滑舌鳎(刘姗姗, 2013)中，Amh分别位于Y染色体和Chr2上，且该基因在精巢的表达量显著高于其他组织；对于无异型性染色体的鱼类如斑马鱼，Amh位于其Chr22上，具有抑制精原细胞过度增殖、促进生殖细胞分化的功能(林桥洪, 2020)。军曹鱼Amh位于Chr7，该染色体与上述Amh定位的染色体之间均存在共线性，表明该基因在各性别决定类型鱼类的精巢分化和发育均具有重要作用。

已有研究表明，Dmrt1在鱼类雄性性别决定及精巢发育过程中具有重要作用。例如：对于具有性染色体的鱼类如XX/XY型的金钱鱼(Scatophagus argus) (Mustaphha et al, 2018)、ZZ/ZW型的半滑舌鳎(孙业盈等, 2008)及无异型性染色体的斑马鱼(郭一清, 2006)等鱼类，Dmrt1分别位于Y、Z染色体和Chr5上且在精巢中特异性高表达；此外，Dmrt1作为胡子鲇(Clariasfuscus)(邓思平等, 2012)精巢特异性表达基因，已被证明可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关；相似地，军曹鱼Dmrt1在精巢中特异性表达，且定位于Chr8。综上推测，Amh和Dmrt1在军曹鱼的精巢发育过程中具有重要作用，可作为后续性腺发育调控机制研究的目标基因。

Gdf6基因是生长和分化因子家族(GDFs)中的一员，又称为骨形态发生蛋白13(BMP13)，Gdf6在Y染色体上的复制基因Gdf6y为鳉鱼(Nothobranchius furzeri)(Reichwald et al, 2015)的性别决定候选基因；而Gdf6a是丝尾鳠(Hemibagrus wyckioides)(魏文玉, 2023)的雄性偏向表达基因，在精巢中具有较高的表达水平，可能参与调节丝尾鳠的性腺分化和发育过程；尼罗罗非鱼成鱼8个组织的转录组测序结果表明，Gdf6b主要在精巢中表达(龙娟, 2019)。本研究中，军曹鱼Gdf6a/6b在精巢中的表达量显著高于其他组织，由此可推测，Gdf6a/6b作为雄性偏向表达基因可能参与调节军曹鱼精巢的分化及发育。

Sox9基因与上述Amh和Dmrt1相比，其在鱼类的各组织中具有更为广泛的表达分布。例如，在金钱鱼中，Sox9在各组织中均有表达，其中，在脑、鳍和精巢中有较高的表达量(陈建华等, 2015)；在半滑舌鳎中，Sox9在雄鱼的脑、垂体和精巢中的表达量均显著高于雌鱼(Dong et al, 2011)；圆斑星鲽(Verasper variegatus) Sox9基因同样具有较广泛的组织表达分布，且精巢中的表达量显著高于卵巢(张乐乐等, 2018)。同样地，军曹鱼Sox9a/9b在脑、心脏和皮肤中具有较高的表达量，且精巢中的表达量显著高于卵巢。由此可推测，Sox9除了可能参与雄性性别分化和精巢发育(路畅等, 2014)之外，还有可能在神经分化和发育中发挥作用。

本研究结果表明，Amh和Dmrt1仅在军曹鱼精巢中特异性表达，其他3个基因在精巢中的表达量亦显著高于卵巢，由此可推测，上述基因在军曹鱼的精巢发育过程中可能具有重要作用。

军曹鱼精巢发育过程可分为6个时期，分别为Ⅰ期(精原细胞增殖期)、Ⅱ期(精母细胞增长期)、Ⅲ期(精母细胞成熟期)、Ⅳ期(精细胞变态期)、Ⅴ期(精子成熟期)、Ⅵ期(精子退化吸收期)(邝杰华, 2021)。本研究中，军曹鱼Cyp19a1b、Amh、Sox9a、Gdf6a、Gdf6b和Dmrt1在Ⅳ期精巢(精细胞变态期)的表达量最高，表明其可能参与调控精巢的成熟过程。此外，其他鱼类中也发现相似的结果。例如，在胡子鲇精巢发育过程中，Dmrt1在Ⅳ期中的表达量显著高于Ⅲ期和Ⅴ期(邓思平等, 2012)。此外，性别决定与分化基因在鱼类性腺发育各时期表达水平的显著差异也多有报道。如，许氏平鲉(Sebastes schlegeli) Cyp19a1b在Ⅳ~Ⅴ期精巢中的表达量显著高于其他时期(杨艳平等, 2012)；牙鲆Amh仅在Ⅰ~Ⅳ期精巢中高表达，显示Amh可能参与调节精巢的早期发育(Wang et al, 2020)；在黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)中，Sox9a1在Ⅱ期精巢的表达量显著高于Ⅳ期和Ⅴ期(徐跑, 2006)；本研究中，军曹鱼Sox9b在Ⅲ期(精母细胞成熟期)的表达量显著高于Ⅳ期和Ⅴ期。由此可推测，上述基因可能在性腺发育过程中的特定阶段发挥更为显著的作用。