刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的海水养殖种类，2022年全国刺参增养殖面积为25.04万hm²，产量达到24.85万t (农业农村部渔业渔政管理局等, 2023)。随着刺参养殖产业规模的扩大，病害问题日益凸显。前期已报道的刺参疾病病原以细菌为主，兼有霉菌、寄生虫和敌害生物，且细菌性疾病是造成产业损失的最主要因素，寄生性疾病暴发范围和损失相对较少(王印庚等, 2014; 廖梅杰等, 2021)。然而，近年来刺参病害的流行病学调查发现，以唇形后口虫(Boveria labialis)为病原的寄生性后口虫病发生率在90%以上，成为影响刺参健康养殖的主要病害之一。

唇形后口虫的分类地位为纤毛动物门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、盾纤亚纲(Scuticociliatia)、吸触目(Thigmotrichida)、半旋虫科(Hemispeiridae)、后口虫属(Boveria)。已报道的后口虫有3种：亚桶形后口虫(Boveria subcylindrica) (Stevens, 1901)，唇形后口虫(Ikeda et al, 1918)和Boveria teredinidi (Nelson, 1923)。唇形后口虫的精准检测技术是分析该虫在养殖系统中的分布和传播途径的关键。目前，对于该种类寄生虫的主要检测方法是镜检，即刺参解剖后，取出呼吸树制作为水浸片，然后，通过显微镜进行唇形后口虫的观察和计数。Zhan等(2018)使用荧光原位杂交的方法来检测唇形后口虫包囊。镜检和荧光原位杂交检测方法可以对唇形后口虫进行定性分析，但无法进行定量研究。另外，水样、泥样和附着物等养殖环境因子中的唇形后口虫难以通过镜检发现，因此，亟需建立一种高效、快速、定量的检测方法。本研究基于测序获得的唇形后口虫线粒体基因组序列设计特异性引物，建立该寄生虫的SYBR GreenⅠ荧光检测方法，并基于该技术分析工厂化、池塘、网箱和吊笼4种刺参主要养殖模式中养殖系统各部分唇形后口虫的载量，相关研究结果可为唇形后口虫的快速检测和传播途径解析及病害防控提供参考。

用于质粒构建的唇形后口虫样品分离自山东省青岛市某养殖场池塘(2023年4月采集自发病池塘，水温为16~18 ℃)中刺参呼吸树。剖取刺参呼吸树并镜检确定其唇形后口虫的丰度，选取唇形后口虫载量大的呼吸树组织为样本来源。将呼吸树组织置于装有过滤灭菌海水的培养皿内并剪碎释放唇形后口虫，吸取含有游离的唇形后口虫的上清液至离心管，2 000×g离心后富集虫体，至虫体密度高于100只/mL，利用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取游离虫体DNA。用于特异性检验的海洋尾丝虫(Uronema marinum)、贪食纤口虫(Chaenea vorax)、僧帽肾形虫(Colpoda cucullus)和多小核草履虫(Paramecium multi-micronuleatum)的DNA来自中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所进化基因组学实验室，刺参体壁取自用于分离唇形后口虫的刺参，利用Mollusc DNA Kit (Omega Bio-Tek，美国)提取样品基因组DNA。

将实验室前期测序获得的唇形后口虫线粒体基因组序列与NCBI中其他纤毛虫线粒体序列比对后，选取与其他纤毛虫基因序列同源差异大的nad10基因的部分DNA区段设计引物，并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。分别以唇形后口虫、海洋尾丝虫、贪食纤口虫、僧帽肾形虫和多小核草履虫的DNA和ddH₂O (空白对照)为模板，退火温度设置为50~70 ℃，温度间隔设置为2 ℃，与上述引物进行普通PCR检测，根据凝胶电泳条带的特异性和亮度确定唇形后口虫引物及PCR的退火温度(T_m)。

以所提取的唇形后口虫DNA为模板，用所筛选的引物扩增目的片段，目的基因扩增产物经SteadyPure DNA凝胶回收试剂盒(艾科瑞生物工程有限公司，湖南)纯化后与pMD^TM19-T载体(宝日医生物技术有限公司，北京)连接，转化至大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞(宝日医生物技术有限公司，北京)，构建重组质粒。涂板培养后进行蓝白斑筛选，并挑取单克隆菌落扩增培养，使用SteadyPure质粒DNA提取试剂盒(艾科瑞生物工程有限公司，湖南)提取菌液中的质粒，并将经PCR鉴定为阳性的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，使用超微量分光光度计(NanoDrop 1000, 美国)检测并记录质粒浓度，选择A₂₆₀/A₂₈₀在1.8~2.0之间的重组质粒作为标准品，根据公式：拷贝数(copies/µL)=[6.02×10²³×质粒浓度(ng/µL)×10^–9]/[DNA长度(bp)×660]，计算重组质粒标准品的拷贝数。

唇形后口虫实时荧光定量PCR (RT-qPCR)体系参照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(诺唯赞医疗科技有限公司，南京)说明书推荐的20 μL反应体系，其中包含2× Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix，引物终浓度梯度分别设置为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol/L，4.05×10⁷ copies/µL的重组质粒标准品为模板。使用QuantStudio™ 3实时荧光定量PCR系统进行扩增，程序为预变性阶段95 ℃ 30 s，循环反应阶段95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s进行40次循环。对不同的引物浓度扩增效果进行对比，应用QuantStudio™ Design and Analysis Software Version 1.5.1分析最佳引物终浓度。

将制备好的重组质粒标准品原液用ddH₂O进行10倍梯度稀释，以获得的终浓度为4.05×10⁰~4.05× 10⁹ copies/µL的10个浓度梯度为模板，每个梯度设置3个平行，按照优化后的反应体系进行RT-qPCR扩增，绘制标准曲线，分析目的基因拷贝数与C_t值的线性关系和熔解曲线的特异性。

选择重组质粒标准品10倍梯度稀释的终浓度为4.05×10⁰~4.05×10⁹ copies/µL的10个浓度梯度，以其为模板，进行RT-qPCR检测，以4.05×10¹~ 4.05×10⁸ copies/µL的8个浓度梯度为模板，进行普通PCR检测，确定该方法的检测灵敏度。通过比较扩增曲线和PCR凝胶电泳成像结果来对比2种检测方法对质粒标准品的最低检出限。

分别以海洋尾丝虫、贪食纤口虫、僧帽肾形虫、多小核草履虫的DNA、质粒标准品(阳性对照)、刺参体壁基因组DNA(阴性对照)和ddH₂O(空白对照)为模板，利用本研究建立的RT-qPCR方法进行检测，每个样品3个重复，验证该方法的特异性。

选取浓度为4.05×10³、4.05×10⁵、4.05×10⁷ copies/µL的重组质粒标准品为模板，分别对所建立SYBR GreenⅠRT-qPCR检测方法进行重复性实验。设置批内和批间实验，批内重复性实验以上述3个不同梯度的标准品为模板，在同一次实验中进行SYBR GreenⅠRT-qPCR检测；批间重复性实验利用选取的3组标准品为模板进行3次SYBR GreenⅠRT-qPCR检测，每隔7 d进行一次。计算批内和批间C_t值的平均值、标准差和变异系数(coefficient of variation, CV)，评定该方法的可重复性。

采集池塘养殖、工厂化养殖、网箱养殖、吊笼养殖4种养殖模式系统中的环境、饲料与刺参样品，每个位点采集3个平行样本，池塘养殖与工厂化养殖模式采集海水、底泥和饲料样品，网箱养殖与吊笼养殖模式采集海水、附着物和饲料样品，具体采样位点和样品信息见表 1。同时，采集相应检测点的养殖刺参，制作呼吸树水浸片，于光学显微镜(Nikon E800，日本)下镜检，在目镜×物镜放大倍数为40倍下判断寄生虫载量，具体的判别依据：制备的呼吸树组织水浸片，每片随机计数10个视野，获得每个视野内的虫体平均数量，未感染为“–”，感染1~200个为轻度，计为“+”；感染200~500个为中度，计为“++”；感染500个以上为重度，计为“+++”。

表 1(Tab.1)

表 1 用于唇形后口虫检测的样品来源 Tab.1 Samples information table for B. labialis detection 模式Culture pattern 编号Number 位点Location 养殖阶段Culture stage 刺参体重Sea cucumber weight/g 采样时间Time for sampling 采集的样品类型Sample type 池塘Pond P1 山东省青岛市即墨区 养成Grow-out 30~80 2023-10 水样、泥样 P2 辽宁省锦州市凌海市 养成Grow-out 30~116 2023-11 水样、泥样、配合饲料 P3 山东省青岛市黄岛区 养成Grow-out 6~21 2023-12 水样、泥样 工厂化Factory I1 山东省青岛市黄岛区 育苗Seed production 0.1~1.5 2023-10 水源水、车间用处理水、鲜海泥、投喂的预制饲料 I2 山东省青岛市黄岛区 育苗Seed production 0.1~2.0 2023-12 水源水、车间用处理水、鲜海泥、投喂的预制饲料 I3 山东省烟台市莱州市 养成Grow-out 40~70 2023-12 水样、泥样、配合饲料、投喂的预制饲料 网箱Net cage N1 山东省烟台市芝罘区 养成Grow-out 25~50 2023-12 水样、网衣附着物 N2 山东省威海市荣成区 养成Grow-out 50~80 2023-12 水样、网衣附着物、配合饲料 吊笼Cage C1 福建省宁德市霞浦县溪南镇东安海域 养成Grow-out 50~80 2024-01 水样、吊笼附着物、海带原料 C2 福建省宁德市霞浦县溪南镇沙湾海域 养成Grow-out 50~80 2024-01 水样、吊笼附着物、海带原料 C3 福建省宁德市霞浦县下浒镇雷江海域 养成Grow-out 50~80 2024-01 水样、吊笼附着物、海带原料、混合粘性饲料

表 1 用于唇形后口虫检测的样品来源 Tab.1 Samples information table for B. labialis detection

不同养殖模式不同地点海水样品采集后立即过滤，原样过滤500 mL海水到0.22 μm滤膜，所有样品置于–20 ℃冷冻保存。利用土壤基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取不同养殖区养殖系统各部分样品DNA。使用已建立的SYBR GreenⅠRT-qPCR方法对养殖系统样品进行检测。根据已获得的C_t值计算拷贝数，进一步计算原始样本目的基因拷贝数，计算公式为：海水原始样品目标基因拷贝数(copies/L)=[拷贝数(copies/µL)×基因组DNA体积]/样本抽滤体积；其他原始样品目标基因拷贝数(copies/g)=[拷贝数(copies/µL)×基因组DNA体积]/样本抽提重量。利用Excel软件绘制4个柱形图，显示不同养殖模式下采集样本中唇形后口虫DNA的载量。使用SPSS Statistics 25软件对同种养殖模式单个位点中相同单位的样本进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD和Duncan法进行多重比较，检验其是否存在显著性差异，相关性分析采用双变量Person检验(若P < 0.05则表示差异有统计学意义)。根据系统各部分唇形后口虫载量与呼吸树内寄生唇形后口虫量的相关性推测唇形后口虫的传播途径。

基于凝胶电泳结果条带的特异性和亮度综合判断，最终选择H8-1F和H8-1R (表 2)作为用于建立SYBR GreenⅠRT-qPCR检测方法的引物，62 ℃为退火温度。利用H8-1F和H8-1R对重组质粒进行RT-qPCR扩增，经过1%琼脂糖凝胶电泳验证产物，出现约为100 bp的条带(图 1)，与预期相符。重组质粒经过测序后结果比对正确，证明成功构建了质粒标准品。质粒DNA提取试剂盒提取的重组质粒经超微量分光光度计测得质量浓度为90.71 ng/μL，根据公式计算获得重组质粒拷贝数为4.05×10¹⁰ copies/µL。

表 2(Tab.2)

表 2 用于唇形后口虫RT-qPCR检测的引物序列 Tab.2 Primers for detection of B. labialis using RT-qPCR detection 引物名称Primer name 序列Primer sequence (5′~3′) 目的基因大小Target gene size/bp H8-1F 5′-GGTGGGCAACCTGGTACATA-3′ 105 H8-1R 5′-GGGAAGTTGTGCTAATGGAGGA-3′

表 2 用于唇形后口虫RT-qPCR检测的引物序列 Tab.2 Primers for detection of B. labialis using RT-qPCR detection

图 1(Fig. 1)

图 1 唇形后口虫检测用PCR退火温度优化结果 Fig.1 Optimization results of annealing temperature for PCR detection of B. labialis M：DNA相对分子量标准；BC：空白对照；1：4.05×107 copies/µL重组质粒标准品；2：海洋尾丝虫；3：贪食纤口虫；4：僧帽肾形虫；5：多小核草履虫。 M: DL2000; BC: Blank control; 1: 4.05×107 copies/µL recombinant plasmid standard; 2: Uronema sp.; 3: Chaenea sp.; 4: Colpoda sp.; 5: Paramecium sp..

通过对比不同引物浓度下相应模板扩增结果可以看出，在62 ℃退火温度下，引物H8-1F和H8-1R在反应体系中的最佳浓度为0.2 μmol/L，此浓度下的平均C_t值最小(图 2)。20 µL RT-qPCR体系中包含2× Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 µL，终浓度为0.2 μmol/L的H8-1F和H8-1R各0.4 µL，质粒模板1.0 µL，ddH₂O 8.2 µL。确定SYBR GreenⅠRT-qPCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，40个循环。

图 1(Fig. 1)

图 2 唇形后口虫检测用RT-qPCR引物浓度优化结果 Fig.2 Optimization results of primer concentration for RT-qPCR detection of B. labialis

以4.05×10⁰~4.05×10⁹ copies/µL 10个浓度梯度的重组质粒标准品为模板，根据已建立的扩增体系与最佳反应条件进行RT-qPCR扩增，并以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标，以C_t值为纵坐标，构建SYBR GreenⅠRT-qPCR标准曲线。应用QuantStudio™ Design and Analysis Software Version 1.5.1软件分析结果，获得相应的荧光定量标准曲线和熔解曲线(图 3)，质粒标准模板在4.05×10¹~ 4.05×10⁹ copies/µL范围内有明显扩增，标准曲线的线性关系式为y= –3.272x+36.152，相关系数R² = 0.997，表明重组质粒拷贝数对数值与C_t值之间呈良好的线性关系，9个浓度梯度的重组质粒标准品的T_m值均为76.9 ℃左右，熔解曲线呈现单一峰，表明无引物二聚体或非特异性扩增。

图 1(Fig. 1)

图 3 唇形后口虫检测用SYBR GreenⅠRT-qPCR标准曲线(A)与熔解曲线(B) Fig.3 Standard curve (A) and melting curve (B) of SYBR GreenⅠRT-qPCR detection of B. labialis

以4.05×10⁰~4.05×10⁹ copies/µL 10个浓度梯度的重组质粒标准品为模板，进行SYBR GreenⅠRT-qPCR检测，以4.05×10¹~4.05×10⁸ copies/µL 8个浓度梯度的重组质粒标准品为模板进行普通PCR检测。结果显示，本研究建立的SYBR GreenⅠRT-qPCR的最低可检测到的重组质粒标准品拷贝数为40.5 copies/µL (图 4)，普通PCR最低可检测到的标准品质粒拷贝数为4.05×10⁴ copies/µL(图 5)，本研究的检测灵敏度达到了普通PCR的1 000倍。

图 1(Fig. 1)

图 4 唇形后口虫检测用荧光定量PCR灵敏度实验结果 Fig.4 Sensitivity test results of RT-qPCR detection of B. labialis 1~10: 4.05×109~4.05×100 copies/µL.

图 1(Fig. 1)

图 5 唇形后口虫检测用普通PCR灵敏度实验结果 Fig.5 Sensitivity test results of PCR detection of B. labialis M：DNA相对分子量标准；BC：空白对照； 1~8:4.05×101~4.05×108 copies/µL。M: DL2000; BC: Blank control; 1~8: 4.05×101~4.05×108 copies/µL.

利用已建立的SYBR GreenⅠRT-qPCR方法，分别以海洋尾丝虫、贪食纤口虫、僧帽肾形虫、多小核草履虫的DNA、唇形后口虫质粒标准品(阳性对照)、刺参体壁基因组DNA(阴性对照)和ddH₂O (空白对照)为模板验证本检测方法的特异性。结果显示(图 6)，质粒标准品(阳性对照)检测结果为阳性，海洋尾丝虫、贪食纤口虫、僧帽肾形虫、多小核草履虫的DNA、刺参体壁基因组DNA(阴性对照)和ddH₂O(空白对照)均未见特异性扩增，表明已建立检测方法的特异性较好。

图 1(Fig. 1)

图 6 唇形后口虫检测用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的特异性检测 Fig.6 Specific detection of SYBR GreenⅠ RT-qPCR detection of B. labialis

分别选取浓度为4.05×10³、4.05×10⁵、4.05×10⁷ copies/µL的重组质粒标准品为模板，采用本研究建立的方法进行批内和批间重复性实验，通过计算批内和批间C_t值的平均值、标准差和变异系数(coefficient of variation, CV)评价方法的重复性。结果显示(表 3)，各浓度的组内C_t值均一性较高，批内实验CV值为0.32%~0.82%，批间实验CV值为0.40%~0.88%，CV值均较低，表明该方法具有良好的重复性，在保证检测结果准确的前提下，可应用于大批量的样品检测。

表 3(Tab.3)

表 3 唇形后口虫检测用SYBR GreenⅠRT-qPCR组内及组间重复性检测 Tab.3 Inter-batch and intra-batch repeatability of SYBR GreenⅠRT-qPCR detection of B. labialis 重组质粒标准品Recombinant plasmid standard (copies/µL) 批内重复性实验(Ct值) Intra-assay reproducibility 批间重复性实验(Ct值) Inter-assay reproducibility $ \bar X \pm {\text{SD}} $ CV/% $ \bar X \pm {\text{SD}} $ CV/% 1 4.05×107 13.845±0.103 0.74 13.785±0.121 0.88 2 4.05×105 19.650±0.161 0.82 19.576±0.153 0.78 3 4.05×103 25.645±0.082 0.32 25.972±0.104 0.40

表 3 唇形后口虫检测用SYBR GreenⅠRT-qPCR组内及组间重复性检测 Tab.3 Inter-batch and intra-batch repeatability of SYBR GreenⅠRT-qPCR detection of B. labialis

采集刺参不同养殖区和不同养殖模式下养殖系统各部分样品进行RT-qPCR检测，采集的刺参样品进行镜检，结果如表 4、图 7所示，池塘养殖模式中3个位点的海水、底泥中均有目的基因检出，海水目标基因拷贝数值为296.50~809.84 copies/L，底泥目标基因拷贝数值为50.68~730.32 copies/g，池塘模式下仅有P2位点进行饲料投喂，而在投喂的配合饲料粉末原料中未检出目的基因。工厂化养殖模式中，目的基因在I1和I2位点水源的水样、鲜海泥、投喂的预制饲料和I3位点成参池采集的样品中检出，I1和I2位点水源的鲜海泥与投喂的预制饲料中唇形后口虫DNA载量无显著性差异，刺参呼吸树未感染唇形后口虫；I3位点3个成参池中海水目标基因拷贝数值为117.69~273.47 copies/L，底泥目标基因拷贝数值为56.51~381.97 copies/g，预制饲料与第3个养殖池底泥的目标基因拷贝数值无显著性差异。网箱养殖模式中，N1和N2两个位点的海水目标基因拷贝数值为282.80~422.25 copies/L，N2位点附着物目标基因拷贝数值为434.71~642.30 copies/g，N1位点附着物和N2位点投喂的配合饲料未检出目的基因。吊笼养殖模式中，3个位点海水目标基因拷贝数值为372.49~ 453.85 copies/L，附着物目标基因拷贝数值为577.71~674.71 copies/g，投喂的海带原料均未检出目标基因。4种模式中，除N1位点网箱附着物外，成参养殖环境的海水、底泥和附着物中均检出目的基因，而配合饲料与海带原料无检出。

表 4(Tab.4)

表 4 临床样品唇形后口虫镜检与RT-qPCR检测结果 Tab.4 Results of microscopic examination and RT-qPCR detection of B. labialis in different culture patterns 模式Culture pattern 编号Number 位点Location 刺参内寄生唇形后口虫量Degree of infection 水样Sea water sample/(copies/L) 泥样/附着物Soil sample/Attachment (copies/g) 饲料Feed sample/(copies/g) 池塘Pond P1 山东省青岛市即墨区 +++ 372.48±23.21 416.88±3.48 — ++ 331.71±22.94 277.60±13.60 +++ 377.75±12.24 503.25±13.96 P2 辽宁省锦州市凌海市 ++ 334.66±6.02 341.59±15.25 0.00±0.00 (配合饲料) + 304.65±8.03 153.78±29.13 + 296.50±8.62 50.68±16.24 P3 山东省青岛市黄岛区 +++ 544.35±58.93 320.83±19.38 — +++ 726.01±18.44 426.81±6.80 +++ 809.84±9.33 730.32±3.08 工厂化Factory I1 山东省青岛市黄岛区(育苗车间) – 0.00±0.00 0.00±0.00 465.11±8.35 (预制饲料) – 0.00±0.00 0.00±0.00 – 0.00±0.00 0.00±0.00 101.66±15.35 (水源水样) 504.62±16.67 (鲜海泥) I2 山东省青岛市黄岛区(育苗车间) – 0.00±0.00 0.00±0.00 471.45±7.19 (预制饲料) – 0.00±0.00 0.00±0.00 – 0.00±0.00 0.00±0.00 117.53±12.69 (水源水样) 498.33±24.62 (鲜海泥) I3 山东省烟台市莱州市(养成车间） + 186.94±14.01 157.15±9.15 0.00±0.00 (配合饲料) 370.42±20.90 (预制饲料) + 117.69±7.66 56.51±2.20 + 273.47±1.54 381.97±17.70 网箱Net cage N1 山东省烟台市芝罘区 – 408.44±7.16 0.00±0.00 — – 282.80±10.16 0.00±0.00 + 412.31±8.50 0.00±0.00 N2 山东省威海市荣成区 +++ 406.16±2.67 434.71±2.13 0.00±0.00 (配合饲料) +++ 392.25±5.88 535.21±2.38 +++ 422.25±13.15 642.30±16.88 吊笼Cage C1 福建省宁德市霞浦县溪南镇东安海域 +++ 446.53±5.15 645.65±4.29 0.00±0.00 (海带原料) +++ 453.85±11.45 662.73±18.00 +++ 443.79±2.37 577.71±17.36 C2 福建省宁德市霞浦县溪南镇沙湾海域 +++ 378.00±1.56 652.26±7.72 0.00±0.00 (海带原料) +++ 389.14±2.41 621.52±20.77 +++ 372.49±29.73 674.71±5.93 C3 福建省宁德市霞浦县下浒镇雷江海域 +++ 417.88±5.56 631.96±21.65 0.00±0.00 (海带原料) 94.80±4.93 (混合粘性饲料) +++ 424.52±8.86 595.05±18.53 +++ 393.46±2.01 613.51±17.31 注：“—”表示采样时该位点刺参未投喂饲料；未感染为“–”，感染1~200个为轻度，记为“+”；感染200~500个为中度，计为“++”；感染500个以上为重度，计为“+++”；空格为该位点未采集刺参样品。 Note: “—” indicates that A. japonicus was not being fed feed at the time of sampling; infection intensity is categorized as: “–” for no infection, “+” for light infection (1~200 parasites), “++” for moderate infection (200~500 parasites), and “+++” for severe infection (> 500 parasites); the blank cell indicates that no sample was collected at the site.

表 4 临床样品唇形后口虫镜检与RT-qPCR检测结果 Tab.4 Results of microscopic examination and RT-qPCR detection of B. labialis in different culture patterns

图 1(Fig. 1)

图 7 不同刺参养殖模式环境样品RT-qPCR检测结果 Fig.7 RT-qPCR detection results of environmental samples collected from different culture pattern

海水中唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈中度正相关(R=0.563, P < 0.05)，底泥和附着物样品中的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931, P < 0.05)，推测鲜海泥是唇形后口虫传播的重要载体。

目前已经报道的刺参主要寄生虫包括原生动物(Protozoa)、环节动物(Annelida)、扁形动物(Platyhelminthes)、软体动物(Mollusca)、节肢动物(Arthropoda)和纤毛虫(Ciliophora)(战文斌等, 1993; 荣小军等, 2009)。后口虫隶属于盾纤类纤毛虫，我国关于后口虫的报道主要集中在刺参养殖领域，徐奎栋等(2000)在栉江鳐(Pinna pectinata)中也有报道，国内外对于刺参唇形后口虫的研究主要集中在形态观察与鉴定、培养和药物筛选等方面(Long et al, 2006; 荣小军, 2005)。本实验室采集的刺参样品的镜检结果显示，在山东、辽宁、福建等刺参主养区的25个养殖场的样品中均观察到有唇形后口虫寄生。尚未发现唇形后口虫感染直接导致刺参死亡的情况(王印庚等, 2005; 张春云等, 2006)。大量唇形后口虫寄生在呼吸树中导致的刺参排脏反应，致使刺参生长缓慢，免疫力下降，进而易感细菌性疾病，给刺参养殖业带来巨大损失，需要引起高度重视。但鉴于尚无便捷可靠的虫体检测方法，对于该寄生虫的传播途径研究无法开展。

RT-qPCR因其全封闭扩增、灵敏度高、重复性好、特异性强等优点，成为近年来病原检测的主流方法之一。其中，SYBR GreenⅠ荧光染料法摒弃价格高昂的探针，降低实验成本，简化操作过程，适用产业的快速检测。储旭等(2023)建立了一种灵敏性高、实用性强的青蟹呼肠孤病毒(MCRV)RT-qPCR检测方法，既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选，也能满足病原感染相关研究的需要。徐媛媛等(2023)建立的5种主要海水养殖病原菌多重微流控RT-qPCR快速检测技术与李昊等(2023)建立的对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控RT-qPCR检测的方法更符合养殖基层的现场快速检测需求，为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。在纤毛虫实时定量检测方面，曹泽艺等(2024)建立了多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis) PCR和SYBR GreenⅠRT-qPCR检测方法，由于在适宜水环境与温度条件下，多子小瓜虫仅需约1~2周便可暴发性繁殖，迅速导致鱼体大面积感染及死亡，而该技术高效检测出处于潜在感染状态的鱼类及其养殖环境中的多子小瓜虫，针对淡水养殖中该疾病的早期诊断与病原体鉴定均具有实用价值。鉴于唇形后口虫生活史未知，本研究建立了SYBR GreenⅠRT-qPCR技术，对养殖环境样本(如海水、底泥、附着物以及不同类型饲料)进行全面检测，同时结合刺参养殖模式及众多因素进行探讨，以期进一步探究其可能存在的传播途径。

本研究建立的RT-qPCR检测方法在引物筛选过程中，仅有一对引物能扩增出唇形后口虫DNA目的片段，但对于海洋尾丝虫、贪食纤口虫、僧帽肾形虫以及多小核草履虫的DNA产生了非特异性扩增，调整退火温度后，凝胶电泳条带分析显示最低退火温度为62 ℃时，该引物未出现非特异性扩增，RT-qPCR验证揭示，该温度可作为反应体系中最佳退火温度。灵敏度实验结果显示，RT-qPCR的灵敏度达到了普通PCR的1 000倍。以上结果印证了所构建唇形后口虫SYBR GreenⅠRT-qPCR检测方法的高特异性和高灵敏度。

本研究分析了4种刺参养殖模式的环境样品和饲料样品，涉及刺参的主要养殖模式和多种环境因子。镜检和RT-qPCR检测结果显示，开放性养殖环境中，海水中唇形后口虫DNA载量在282.80~453.85 copies/L范围内，其水环境中存在无唇形后口虫寄生的刺参，而附着物样品的唇形后口虫DNA载量与刺参体内唇形后口虫量呈高度正相关(R=0.931)。据此分析，唇形后口虫可能从附着物中释放从而进入海水环境，刺参呼吸树中央腔连接着泄殖腔，唇形后口虫则通过泄殖腔收缩舒张的作用，被海水输送至呼吸树中央腔内进行生长、发育和繁殖，最终在呼吸树内成功定殖。独立的养殖环境中，工厂化养殖(育苗)模式的I1和I2位点水源水经过砂滤池过滤与二氧化氯消毒进入养殖池，池中水样未检出唇形后口虫的目的片段，而预制饲料在添加大量鲜海泥的情况下，幼参的呼吸树中并未发现有唇形后口虫寄生，底泥中同样未检出目的片段，转移至P3位点池塘后养成成参的呼吸树中观察到大量唇形后口虫。由此推测，稚参和幼参呼吸树中的内环境不适宜唇形后口虫寄生，可能与其呼吸树的微环境、营养成分或者空间结构等因素有关，即使养殖环境中加入带有唇形后口虫包囊的鲜海泥，唇形后口虫也难以在小规格刺参呼吸树中完成定殖。刘彤等(2012)的调查结果与本研究临床样品检测分析结果基本一致，其研究表明，育苗室养殖池中的海参无论规格大小均无后口虫寄生，94%的室外池塘中海参被后口虫感染，且育苗室水源海域的海参存在感染后口虫的情况。推测，砂滤与清塘可以有效过滤或杀灭后口虫，后口虫可以通过换水途径进入池塘，进而感染海参。

综上所述，本研究成功建立了一种特异性强、灵敏度高、重复性好的寄生性唇形后口虫SYBR GreenⅠRT-qPCR检测方法，可用于唇形后口虫的快速检测，推测湿海泥为唇形后口虫的重要传播途径，本研究结果为该虫的防控奠定了研究基础。