凡纳对虾(Penaeus vannamei)又称南美白对虾、白腿虾等，具有生长快、抗病力强和易于饲养等优点，是我国海水养殖产量最高的甲壳动物。工厂化养殖是凡纳对虾重要的养殖模式，也是未来对虾养殖的发展方向。然而，随着对虾养殖密度不断增加，残饵、粪便的积累和对虾的排泄使养殖水体难堪重负，氨氮(NH3-N)和亚硝氮(NO2–-N)等有害含氮化合物的浓度升高(李秋芬等, 2024)。作为养殖水体常见的有害物质，非离子氨和NO2–-N会通过鳃等器官进入对虾体内，干扰其氧气运输、代谢和免疫功能(吴乐等, 2023)，严重影响对虾的健康，阻碍了对虾养殖业的健康发展(Garçon et al, 2022; Liu et al, 2017)。因而探究降低养殖水体中NH3-N和NO2–-N浓度的方法对于对虾养殖业的健康发展极为重要。
众多研究表明，水体氮循环过程是在携带氮循环功能基因的微生物参与下完成的(Kuypers et al, 2018; Zhou et al, 2022)。水体中的蓝藻(Cyanobacteria)含有固氮基因(如nifHDK)，能通过固氮作用，将空气中的N2转化为NH3-N(Thompson et al, 2012)。氨氧化细菌含有硝化基因(amoCAB，hao)能氧化NH3-N，生成羟胺(NH2OH)进一步生成NO2–-N(Kuypers et al, 2018)。分离自富营养化水体的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.) N31942含有多种功能基因，能降低水体中NH3-N的浓度(Liu et al, 2022)。因而查明微生物的特征和氮循环功能基因的丰度有利于深入了解养殖水体氮循环的过程和变化，揭示NH3-N和NO2–-N浓度积累的微观成因。前人的研究多以时间为标尺分析水体中含氮化合物的浓度和微生物群落的变化特征(Li et al, 2023; Liu et al, 2023; Ning et al, 2023; 张广瑞等, 2021)，而对于直接探讨不同浓度NH3-N和NO2–-N水体微观特征的研究却相对较少。
本研究随机采集凡纳对虾工厂化养殖的水样，并按照水体NH3-N和NO2–-N的浓度特征将样品分组。通过测定各组的微生物群落特征、氮循环基因绝对丰度，并对微生物相对丰度、氮循环基因绝对丰度和环境因子进行相关性分析，来揭示不同NH3-N和NO2–-N浓度水体中的微生物群落组成及其差异、氮循环功能基因丰度及差异、微生物丰度和氮循环基因丰度与环境因子(特别是NH3-N浓度和NO2–-N浓度)的相关性。本研究探讨水体中的微生物、氮循环基因和含氮化合物之间的关系，旨在为通过调控微生物解决对虾工厂化养殖中有害氮积累的问题提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 养殖概况与样品采集采样的凡纳对虾工厂化养殖公司位于山东省威海市文登区(36.92°N，122.07°E)。该公司使用外海水，经沉降、过滤和消毒后进行养殖，养殖池均为5.5 m × 4.0 m×1.2 m的水泥池，虾苗初始体长为(3.87±0.47) cm，养殖密度约为500尾/m2。每日进行5次(07:00、11:00、15:00、19:00和21:00)投喂，根据对虾体重的增加和摄食情况调整投喂量。每天09:00换水，养殖开始的第1个月不换水，1个月后开始换水2.2 m3，每10 d换水量增加2.2 m3，最大换水量为8.8 m3。自2022年7月4日至8月30日，每2周采集水体样品1次(共采集样本5次)。每次随机选择18个养殖池，于09:00开始采样，每个养殖池采集中上层水样；同时，每个养殖池随机捞取凡纳对虾10尾，测量其生物学体长。采样期间，养殖池水温为(28.1±2.0) ℃，盐度为29~30，pH为7.66±0.29，溶解氧为(5.76±0.60) mg/L。
使用聚乙烯取样杯于水面下约20 cm处取样，样品经100目(孔径0.150 mm)筛绢过滤后，装入聚乙烯水样瓶中。取1 L水样，用灭菌的0.22 μm的混合纤维滤膜进行现场抽滤(上海力辰邦西仪器科技有限公司，LC-95WD)。过滤后的水样立即运送回实验室，储存于–20 ℃冰箱，用于水体NH3-N、NO2–-N、硝态氮(NO3–-N)和总氮(total nitrogen，TN)浓度的测定。滤膜装入灭菌的冻存管内，液氮速冻，然后于–80 ℃保存，用于后续实验。
1.2 水体理化指标的测定使用水银温度计测定水体温度，使用pH计(上海力辰仪器设备有限公司，LC-pH-100B)测定水体pH，使用折光式盐度计(广州市速为电子科技有限公司，LS10T)测定水体盐度，使用溶氧仪(长春乐鏷科技有限公司，AZ8403)测定水体溶解氧。水体NH3-N浓度、NO2–-N浓度、NO3–-N浓度和总氮浓度分别采用靛酚蓝分光光度法、盐酸萘乙二胺分光光度法、锌镉还原法和过硫酸钾氧化法测定，测定过程按《海洋监测规范第4部分：海水分析》(GB/T12763.4-2007)的描述进行。
1.3 测序样品选取以水体中的NH3-N浓度为横坐标，NO2–-N浓度为纵坐标，构建各取样点NH3-N和NO2–-N的分布图。DG组(低NH3-N、低NO2–-N)：NH3-N < 1.33 mg/L、NO2–-N < 0.77 mg/L；DB组(高NH3-N、低NO2–-N)：NH3-N > 2.53 mg/L、NO2–-N < 0.77 mg/L；DY组(低NH3-N、高NO2–-N)：NH3-N < 1.33 mg/L、NO2–-N > 2.55 mg/L；DR组(高NH3-N、高NO2–-N)：NH3-N > 2.53 mg/L、NO2–-N > 2.55 mg/L。从上述4组中各随机取5个样品，进行16S rRNA测序和基因丰度绝对定量。测序样品如图 1所示，测序水样对应养殖池的对虾生物学体长见图 2。
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图 1 测序水体样本关于NH3-N和NO2–-N浓度的分布 Fig.1 The distribution of NH3-N and NO2–-N concentrations at the sample points sent to be measured DG: NH3-N < 1.33 mg/L, NO2–-N < 0.77 mg/L; DB: NH3-N > 2.53 mg/L, NO2–-N < 0.77 mg/L; DY: NH3-N < 1.33 mg/L, NO2–-N > 2.55 mg/L; DR: NH3-N > 2.53 mg/L, NO2–-N > 2.55 mg/L. The same below. |
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图 2 各组养殖池的凡纳对虾的生物学体长 Fig.2 Biological body length of P. vannamei in each group |
按说明书的操作方法，用FastDNA® SPIN Kit(MP BiomeDicals，美国)提取水体滤膜的DNA。用超微量分光光度计(NanoDrop ND 2000，美国)测定提取DNA的浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的完整性。质检合格的DNA用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)来扩增细菌16S rRNA的V3~V4可变区。PCR扩增产物送往上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina MiSeq PE 300平台测序。
本研究的微生物16S rRNA测序原始数据已上传至NCBI数据库，登录号为PRJNA1052999。原始测序序列使用Fastp (https://github.com/OpenGene/Fastp)进行质控。使用Flash (https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)进行pair-end双端序列拼接。使用Usearch (http://www.drive5.com/usearch/)进行OTU统计。使用Uparse (http://www.drive5.com/uparse/)对序列进行OTU聚类(相似度97%)，利用RDP classifier (https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)进行序列分类注释。用silva138/16s_bacteria数据库进行物种分类比对，分类置信度为0.7。
1.5 氮循环基因绝对定量的测定使用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)测定各组样品的napA、nirK、nirS、ureC、amoA、narG、nxrB基因的绝对丰度。引物序列如表 1所示。
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表 1 本研究中所测定的基因及其引物序列 Tab.1 Primers and their sequences used in this study |
采用SYBR Green qPCR法，使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed)试剂盒(诺唯赞，中国)，按说明书内容对目的基因进行扩增。使用StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems)进行实验。每个样品的每个基因设置3个技术重复，反应体系为10 μL，其中，荧光试剂[2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed)] 5 μL，模板DNA 2 μL，正义和反义引物各0.2 μL，DEPC H2O 2.6 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。
将所用引物和样本DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司构建质粒标准品。稀释质粒标准品，构建标准曲线(R2 > 0.99)。阴性对照以DEPC H2O为模板，未发现抑制作用。
1.6 数据分析原始序列经质控、拼接、OTU统计与聚类以及序列分类注释和物种分类比对后，使用Mothur软件(https://www.mothur.org/wiki/download_mothur)计算α多样性指数(ACE、Shannon)。使用R语言进行群落物种组成分析、β多样性分析(主坐标分析principal co-ordinates analysis，PCoA)、组间差异性分析和环境因子相关性分析。使用LEfSe软件，根据分类学组成来进行线性差异判别分析(linear discriminant analysis，LDA)。β多样性的距离矩阵使用Qiime进行计算，组间差异性使用ANOSIM法检验。组间差异性的显著性分析采用Kruskal-Wallis秩和检验进行。P < 0.05表示存在显著性差异。
实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。使用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析。对于符合正态分布的数据，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)来检验显著性水平。若数据符合方差齐性，则使用Tukey法进行多重比较；若不符合方差齐性，则使用Tamhane's T2检验。若数据不符合正态分布，则使用非参检验——Kruskal-Wallis H检验。P < 0.05表示存在显著性差异。
2 实验结果 2.1 微生物群落的α多样性各组水体微生物群落的ACE指数和Shannon指数及其比对结果如图 3所示。DB组的ACE指数和Shannon指数均为最高；DG组的ACE指数最低，DR组的Shannon指数最低。其中，DB组ACE指数间显著高于DG组(P < 0.05)，各组的Shannon指数无显著性差异(P > 0.05)。
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图 3 微生物群落的α多样性指数及其组间比对结果(OTU水平) Fig.3 The α diversity index of microbial communities in each group and the results of intergroup comparison (OTU level) 不同组上标有不同字母表示具有显著性差异(P < 0.05)。 Different letters marked on different groups indicate significant differences (P < 0.05). |
4个组水体OTU水平的PCoA分析结果见图 4。由图 4可见，分组要素PC1对分组的解释度为18.84%，PC2为12.72%，各样本分组水平差异显著(R=0.167 3，P=0.016)，表明4组样本间具有显著性差异。
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图 4 4个组微生物群落的PCoA分析(OTU水平) Fig.4 PCoA analysis of microbial communities of four groups |
4个组水体微生物群落的组成如图 5所示。在门水平上，4个组的优势菌有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidete)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)。在DG组中，变形菌门相对丰度为36.81%，拟杆菌门为26.66%；在DB组中，变形菌门相对丰度为39.92%，拟杆菌门为39.39%；在DY组中，变形菌门相对丰度为51.92%，拟杆菌门为32.35%；在DR组中，变形菌门相对丰度为40.90%，拟杆菌门为44.04%。DG组的蓝藻门和放线菌门相对丰度在4个组中最高，分别为14.87%和15.25%；DR组最低，分别为2.12%和4.93%。DY组疣微菌门相对丰度最高，为2.49%。
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图 5 4个组水体微生物群落的物种组成(门水平和科水平) Fig.5 Microbial composition at phyla level and family level of four groups |
在科水平上，相对丰度前十的菌科为红杆菌科(Rhodobacteraceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、腐败螺旋菌科(Saprospiraceae)、冷苔菌科(Cryomorphaceae)、norank_o__Chloroplast、微杆菌科(Microbacteriaceae)、norank_o__PeM15、葡萄球菌科(Stappiaceae)、NS9_marine_group和海氏菌科(Halieaceae)。各组中红杆菌科都是相对丰度最高的菌，DY组红杆菌科相对丰度最高，为42.43%；DB组最低，为22.86%。DB组黄杆菌科的相对丰度最高，为15.56%；DR组最低，为10.26%。DR组腐败螺旋菌科和冷苔菌科的相对丰度最高，分别为15.17%和10.71%，DG组最低，分别为6.43%和4.28%。DG组的norank_o__Chloroplast和微杆菌科的相对丰度最高，分别为13.13%和6.37%，DR组最低，分别为2.05%和2.68%。
2.4 微生物群落物种组成的LEfSe分析4个组在门到科水平的LEfSe分析结果如图 6所示。DG组的标志性微生物为放线菌门、norank_o__PeM15和丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)；DB组的标志性微生物为Micavibrionaceae和门球菌科(Porticoccaceae)；DY组的标志性微生物为甲基寡杆菌科(Methyloligellaceae)、海绵杆菌科(Spongiibacteraceae)、棒状杆菌目(Corynebacteriales)和分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)；DR组的标志性微生物为根瘤菌科(Rhizobiaceae)、f-37-13和norank_o__Chitinophagales。
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图 6 4个组微生物群落的差异物种判别分析 Fig.6 LEfSe analysis of microbial communities of four groups |
4个组在科水平的群落物种组成差异结果见图 7。如图 7所示，各组丰度前十的菌科中，DY组和DR组红杆菌科相对丰度高于DG组和DB组，DB组和DR组的腐败螺旋菌科和冷苔菌科的相对丰度高于DG组和DY组，DG组的norank_o__Chloroplast和norank_o__PeM15的相对丰度高于其他3组，DG组和DB组的微杆菌科的相对丰度高于DY组和DR组。其中，仅norank_o__PeM15的相对丰度在各组间具有显著差异(P < 0.05)，其他菌科则无显著差异(P > 0.05)。
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图 7 4个组微生物群落的物种差异分析 Fig.7 Difference analysis of microbial communities of four groups |
4个组的微生物相对丰度与环境因子的相关性分析结果见图 8。如图 8所示，在DG组中，norank_o__PeM15与NO2–-N浓度、pH和温度均呈显著正相关。蓝藻科与NH3-N浓度和温度呈显著的正相关(P < 0.05)。在DB组中，微杆菌科与NH3-N浓度、NO2–-N浓度和pH呈显著正相关。norank_o__PeM15与NO3–-N浓度呈显著正相关(P < 0.05)。在DY组中，norank_o__PeM15与总氮浓度具有显著正相关性(P < 0.05)。在DR组中，腐败螺旋菌、冷苔菌科与NH3-N浓度呈显著正相关；norank_o__Chloroplast与NH3-N浓度和温度具有显著的正相关性；norank_o__PeM15、蓝藻科和环细菌科(Cyclobacteriaceae)都与总氮浓度呈显著正相关性；海氏菌科与DO呈显著正相关性(P < 0.05)。
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图 8 各组样本微生物相对丰度与环境因子的相关性分析 Fig.8 Correlation analysis between the relative abundance of microorganisms and environmental factors of each group a：DG组；b：DB组；c：DY组；d：DR组。网络图中，红色线表示微生物与对应环境因子呈正相关，蓝色线则表示负相关。线的粗细表示相关性的大小。微生物科名前标“*”表示微生物与“*”后的环境因子有显著相关性(P < 0.05)；下同。 a: DG group; b: DB group; c: DY group; d: DR group. In the network diagram, the red line indicates a positive correlation between microorganisms and the environmental factors, while the blue line indicates a negative correlation. The thickness of the line indicates the magnitude of the correlation. "*" indicated that there was significant correlation between microorganisms and environmental factors after it (P < 0.05). The same below. |
4个组水体氮循环功能基因的绝对丰度结果见图 9。各功能基因绝对丰度的组成如图 9a所示，在DG组中，nirK的绝对丰度最高，其次是nirS和amoA；在DB和DY组中，nirS和amoA的绝对丰度最高；在DR组中，nirK和nirS的绝对丰度最高，其次是amoA。4个组中，绝对丰度最低的2个基因都是nxrB和napA。在4个组中，DR组narG的绝对丰度显著高于DB组(P < 0.05)，DG组与DY组的绝对丰度接近，与其他组无显著差异(P > 0.05)(图 9b)。nirS基因的绝对丰度在DG、DB、DY和DR组中依次升高，DR组显著高于其他3组，DY组显著高于DG组(P < 0.05) (图 9c)。DR组和DG组nirK基因的绝对丰度显著高于DB组和DY组(P < 0.05)(图 9d)。DR组中amoA基因的绝对丰度最高，显著高于DG组(P < 0.05)(图 9e)。4个组中nxr B的绝对丰度相近，并无显著性差异(P > 0.05)(图 9f)。DR组napA基因的绝对丰度最高，但与其他组无显著差异(P > 0.05)(图 9g)。DR组ureC基因的绝对丰度最高，显著高于其他3组(P < 0.05)(图 9h)。
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图 9 氮循环功能基因的绝对丰度 Fig.9 Abundance of nitrogen cycling functional genes at each sample |
水体氮循环功能基因与环境因子的相关性分析结果如图 10所示。amoA与NH3-N、NO2–-N和总氮呈显著正相关，与pH和DO呈显著负相关(P < 0.05)。nirK与pH呈显著负相关(P < 0.05)。nirS与NO2–-N呈显著正相关，与pH和DO呈显著负相关(P < 0.05)。
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图 10 4个组氮转化基因丰度与环境因子的相关性分析 Fig.10 Correlation analysis of nitrogen conversion gene abundance and environmental factors of four groups |
本研究中样品根据样本的NH3-N和NO2–-N的浓度特征分组。在分组过程中发现，NH3-N和NO2–-N浓度较低的样品多来自养殖前期，NH3-N或NO2–-N浓度较高的样品多来自养殖中期，而NH3-N和NO2–-N浓度都高的样品则多来自后期。这反映了随着养殖的进行，养殖水体的NH3-N和NO2–-N浓度逐渐升高，与已有研究中水质变化的结果相同(Srnivasa Rao et al, 2000; Zhang et al, 2020)。
α多样性反映了微生物群落的物种数和个体数。由于具有更加充足的营养物质投入，进行水产养殖活动的水体中，微生物群落更加多样化(窦妍等, 2016; 张翔等, 2016;)，α多样性也更高(Zhang M Y et al, 2019; 赵晓伟等, 2015)。在本研究中，ACE指数在组内变化较大，Shannon指数则变化较小。这意味着在水体NH3-N和NO2–-N浓度逐渐升高的过程中，水体微生物群落的丰度变化较大，而物种数目变化不大。
β多样性反映了各样本间的分组关系(Wang et al, 2017)。在本研究中，4个组的β多样性均存在显著性差异，其中DG组与DR组相距最远，DY组与DR组相交，DG组与DB组相交，DB组与DY组相交，表明各组间存在由DG组依次经DB组、DY组到DR组的连续性变化，养殖水体NH3-N的变化趋势为先升高后降低再升高，NO2–-N的浓度则持续升高，与样品分组传达的结果一致。
3.2 微生物群落特征微生物是养殖水体最重要的生物成分，水体中许多生物化学过程都在微生物的参与下完成(Duan et al, 2022)。在本研究中，4个组的优势菌科包括红杆菌、黄杆菌、腐败螺旋菌、冷苔菌和微杆菌等，与已有的研究结果一致(Callac et al, 2022; Moschos et al, 2022)。DY组红杆菌相对丰度最高，DB组最低。红杆菌是常出现在各种环境中的优势菌(Liu et al, 2019)，具有多样的营养方式，如光营养、化能自养/异养等(Moschos et al, 2022)，可以利用各种形式的有机物，其丰度的升高可能是因为投饵量增多，水体中有机物的含量增加引起的。
黄杆菌是养殖环境中常见的优势菌，在本研究中各组黄杆菌丰度变化不大。黄杆菌能分解复杂的有机物和腐殖酸等(Silva et al, 2017)，从颗粒有机物中吸收碳和氮(Gómez-Consarnau et al, 2019)，其丰度的下降可能会影响其他微生物的生命活动。腐败螺旋菌也是养殖环境中的常见优势菌，具有参与氮循环的潜力(Chen et al, 2014; Zhang L F et al, 2019)。DB组和DR组的腐败螺旋菌相对丰度较高，DG组和DY组中则较低。研究表明，腐败螺旋菌能降解水体中复杂的有机物(Chen et al, 2021)，这可能是其丰度与NH3-N变化趋势相同的原因。微生物丰度与环境因子的相关性分析也表明腐败螺旋菌与NH3-N浓度呈显著正相关，与Yang等(2023)研究中提出的腐败螺旋菌与氮循环基因丰度变化有直接联系的结论一致。
冷苔菌在DR组中丰度最高，在其他组的丰度无显著差异。Califano等(2017)研究发现，冷苔菌的增殖需要大量有机碳，这表明DR组水体可能处于有机碳过剩的状态。此外，冷苔菌与NH3-N浓度具有显著的正相关性，可能具有潜在的氮循环潜力。微杆菌在DG组中丰度最高，在DR组中最低，随着水体NH3-N和NO2–-N的升高其丰度呈降低趋势。微杆菌是活性污泥中的有效成分，能够参与硝化和反硝化反应(Zheng et al, 2022)，相关性分析结果表明，其与水体NH3-N和NO3–-N浓度呈显著正相关，这与Tang等(2020)的研究结果一致。微杆菌相对丰度的降低可能会使水体硝化反应减弱。除以上5种优势菌外，环细菌也表现出与NH3-N和总氮浓度的相关性。环细菌是养殖池塘中的细菌(Ali et al, 2021; 邹松保等, 2023)，目前对其功能的研究较少。根据本研究的相关性分析结果，它可能也是潜在的氮循环功能菌。
3.3 功能基因丰度差异功能基因的丰度反映了相关过程的强弱。一般认为，功能基因丰度越高，该过程的速率就越快，反应也更强(Smith et al, 2015; Yin et al, 2017)。amoA与ureC分别参与NH3-N的氧化与生成(Zhou et al, 2022; 储瑜等, 2018)，是水体NH3-N变化的标志。在本研究中，DG和DY组NH3-N浓度低，DR组NH3-N浓度高。DY组的ureC丰度是4组中最低的，生成NH3-N的速率最低；而amoA丰度与DB组相近，这些表明NH3-N生成速率慢可能是DY组NH3-N浓度低的主要原因。DG组样本多来自养殖前期，饲料投喂较少，水体NH3-N浓度低；这与该组amoA和ureC的低丰度特征吻合。DR组amoA和ureC的丰度都是4组中最高的，表明NH3-N的生成与消耗最为活跃，该组ureC的丰度显著高于其他3组，表明NH3-N的生成最为迅速，这可能是其NH3-N浓度高的主要原因。以上分析表明，养殖水体NH3-N浓度变化是由养殖环境中ureC和amoA基因的丰度变化引起的，ureC丰度增加有利于NH3-N的生成，amoA丰度增加则引起NH3-N的降解，这也与Zhou等(2022)关于氮循环的研究结果一致。
nirS和nirK是参与反硝化中NO2–还原的功能基因(Huang et al, 2023)，nxrB参与硝化中NO2–的氧化，都与NO2–-N的消耗有关；narG是参与反硝化中还原NO3–生成NO2–的功能基因(Gao et al, 2021)，与NO2–-N的生成有关。DY和DR组NO2–-N浓度高，DG和DB组NO2–-N浓度低。DB组narG基因的丰度在四组中最低，表明NO2–-N生成速率最慢，这可能是其NO2–-N浓度低的原因。DR组narG的丰度最高，意味着NO2–-N生成速度最快。DY组narG丰度较高，略低于DR组，二者NO2–-N的生成速率相近。但DR组nirS和nirK的丰度则显著高于DY组，表明DR组NO2–-N的消耗速度更快。然而，在样品筛选中，DR组样品的NO2–-N浓度并不低于DY组，这或许与DR样本多来自于养殖后期，投喂量大，水体含氮化合物总量高有关。有趣的是，尽管4组的narG、nirS和nirK基因的丰度存在显著差异，但nxrB基因的丰度差异较小。基因与环境因子的相关性分析也显示，nxrB与NH3-N、NO2–-N的相关性低，加之nxrB的绝对丰度较低，数量级仅有104，这可能意味着nxrB与水体含氮化合物的浓度变化无关。以上分析表明，养殖水体NO2–-N的浓度变化与环境中的narG、nirS和nirK基因的丰度有关。narG丰度的增加有利于NO2–-N浓度的增加，nirS和nirK丰度的增加有利于NO2–-N的降解。
napA是DNRA过程的功能基因(Wu et al, 2021)，反硝化与DNRA过程都以硝酸盐为底物(聂铭等, 2020)。在本研究中，WD和CY样本的narG和napA的相对丰度均呈现此消彼长的变化趋势，这与前人的反硝化过程和DNRA过程存在竞争关系的结论一致(Shan et al, 2016)。此外，nxrB和narG分别参与硝酸盐的氧化与还原(Moreno-Vivián et al, 1999; Pester et al, 2014)，二者的丰度在各组中呈现出相同的变化趋势。有研究表明，硝酸盐的氧化与还原是可逆的过程，催化这2个过程的关键酶——亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase，NXR)与膜结合硝酸盐还原酶(membrane-bound dissimilatory nitrate reductase，NAR)具有相同的结构(单晓雨等, 2016)。这可能是由于nxrB和narG是重叠基因导致的，本研究中二者丰度趋势相同也可能与此有关。
3.4 微生物丰度、功能基因与环境因子的相关性环境因子(如温度、DO和NH3-N浓度等)的变化与基因的表达以及微生物的丰度密切相关(Braker et al, 2010; Cheng et al, 2016; 张铭洋等, 2024)。本研究中功能基因与环境因子的相关性分析表明，amoA的丰度与含氮化合物(NH3-N、NO2–-N、总氮)的浓度均呈显著正相关，与pH和DO呈负相关。nirS与DO、pH呈显著负相关，nirK与pH呈显著负相关。这意味着功能基因丰度受到环境因子的显著影响，与前人的研究结果一致(Zhou et al, 2022)。微生物与环境因子的相关性分析表明，各组的优势菌科(如腐败螺旋菌、黄杆菌和微杆菌)也都与环境因子呈现显著的相关性。环境因子能够形成生态位，对微生物的类群产生影响(Louca et al, 2016)，进而使其丰度发生变化。通常认为，微生物是功能基因的携带者，是碳循环、氮循环和磷循环等生物化学过程的主要参与者(Shinichi et al, 2015)。环境因素是通过影响微生物的丰度来间接影响基因的丰度和表达的。但有学者发现，有些环境下，如逐渐变暖的草地的土壤微生物并没有发生可观测到的变化，但其功能基因却发生了变化(Gao et al, 2021)。此外，基因丰度虽然能反映出相关过程的强弱，但基因传达的信息往往具有滞后性，比微生物群落慢约10倍(Zhou et al, 2022)。因而环境因素如何对基因产生影响，可能需要根据具体的情况进行具体分析。
4 结论NH3-N和NO2–-N的异常积累是目前凡纳对虾集约化养殖的顽疾之一，严重制约了对虾养殖的健康发展。本研究分析了不同NH3-N和NO2–-N浓度的对虾养殖水体的微生物群落特征、氮循环功能基因的丰度以及微生物丰度、环境因子和功能基因的相关性。结果表明，NH3-N浓度高的水体(DR和DB组)中腐败螺旋菌、冷苔菌的相对丰度较高；其中腐败螺旋菌和冷苔菌均与NH3-N呈显著正相关，二者可能引起NH3-N浓度的变化。NO2–-N浓度高的水体(DR和DY组)红杆菌丰度较高、微杆菌丰度较低。NH3-N和NO2–-N浓度都高的水体反硝化过程的功能基因narG、nirS、nirK以及NH3-N生成与消耗的基因ureC和amoA较高，其中，amoA与NH3-N和NO2–-N浓度均呈显著正相关，其丰度升高可能是NH3-N和NO2–-N浓度升高的原因。本研究从新的角度加深了对NH3-N和NO2–-N积累原因的认识，为其解决方法提供了微生物学理论基础。
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