鱼类的配子发生(卵子发生和精子发生)和成熟(卵母细胞成熟和精子)这2个生殖阶段由垂体和性腺产生的不同生殖激素控制，即促性腺激素(gonadotropin hormone, GtH)和类固醇激素(Ramos-Júdez et al, 2022)。鱼类垂体具有2种GtHs，即促卵泡激素(follicle- stimulating hormone, FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)，它们进一步刺激性类固醇的合成，调控性腺的生长发育和成熟；FSH和LH在调控性腺发育成熟和配子释放中发挥不同的生理功能(Zhang et al, 2024)。FSH和LH是异源二聚体，具有共同的α亚基和不同的β亚基，LHβ比FSHβ更具系统保守性(Fakriadis et al, 2024)。在对漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)的研究中发现，卵巢中的LHβ亚基mRNA表达水平在产卵期达到峰值，说明其参与卵母细胞的最终成熟以及排卵和产卵等过程(柳学周等, 2014)。在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的卵黄形成晚期和卵母细胞成熟期间，LHβ的转录显著增加(Shi et al, 2015)。另外，在鲐鱼(Scomber japonicus)配子发生的早期对LH进行检测发现，其蛋白表达量较低甚至没有，但在性腺成熟阶段其蛋白表达量达到最高，认为其主要作用是促进类固醇激素的合成、滤泡成熟和排卵(Nyuji et al, 2022)。

在水产养殖业中，通常使用基于促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)、绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)和垂体提取物的外源激素调控手段来促进鱼类配子发育成熟(Ramos-Júdez et al, 2022)。使用重组LH可为缓解鱼类生殖障碍和发展反季节育苗提供新思路(Molés et al, 2020)。近年来，已有对金钱鱼(Scatophagus argus) (Zhang et al, 2018)、印度囊鳃鲶(Heteropneustes fossilis)(Aizen et al, 2023)、大菱鲆(Scophthalmus maximus) (高云红, 2021)、密斑刺鲀(Diodon hystrix) (郭煜文等, 2023)等鱼类LH克隆、重组表达的研究报道，在鳗鲡目(Anguilliformes)鱼类中已对欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla) (Degani et al, 2003)和日本鳗鲡(A. japonica) (Suzuki et al, 2020)的LH开展了较多研究，但对星康吉鳗(Conger myriaster) LH的相关研究迄今报道较少。

星康吉鳗在中国的黄海、东海、渤海以及朝鲜半岛海域和日本北部海域广泛分布。星康吉鳗具有较高的经济价值，是我国渔业重要的捕捞对象之一(杨浩等, 2020)。近几十年来，星康吉鳗的资源遭到掠夺性开发，种苗资源日益匮乏(Zhao et al, 2024)。目前，星康吉鳗在我国已通过工厂化循环水养殖、工厂化开放式流水养殖、池塘养殖等人工养殖方式进行试养(赵新宇等, 2024)，但其人工养殖产业发展受限，主要原因是在人工养殖条件下的星康吉鳗很难达到性成熟，无法通过人工繁育提供玻璃鳗苗种，亟需开展星康吉鳗繁育技术研究(史宝等, 2023)。本研究通过对星康吉鳗的LH基因进行克隆以及生物信息学分析，并采用原核表达方式获得了重组LH蛋白，以期为进一步研究星康吉鳗LH的繁殖调控功能奠定理论基础，为后续利用星康吉鳗重组LH蛋白诱导人工培育的亲鳗性成熟提供思路。

实验所用星康吉鳗取自山东省海阳市黄海水产有限公司。从工厂化养殖条件下的星康吉鳗亲鳗后备群体中随机选择大小相近、体色正常、皮肤光滑的健康鱼，平均体长为(578.4±12.5) mm，平均体质量为(330.6±5.2) g。实验前置于室内循环水养殖系统的3 000 L养殖水槽中暂养驯化2周，每日早晚各投喂1次，24 h持续充氧，养殖水温为21.5~24.0 ℃，氨氮 < 0.45 mg/L，亚硝酸盐氮 < 0.06 mg/L，pH维持在7.8~8.2，盐度为28~32，溶解氧≥6.0 mg/L。采用MS-222麻醉，迅速解剖取其垂体组织保存于液氮中(–196 ℃)，后转入–80 ℃超低温冰箱中保存，用于总RNA提取。

使用RNAex Pro试剂(艾科瑞, 中国)提取星康吉鳗垂体组织中的总RNA，通过1%琼脂糖凝胶(艾科瑞, 中国)电泳与超微量紫外检测仪(NanoDrop 2000C) (Thermo, 美国)测定RNA的纯度和浓度。按照cDNA合成试剂盒(艾科瑞, 中国)说明书将RNA进行反转录合成第一链cDNA，获得的cDNA模板保存至–20 ℃备用。

以星康吉鳗垂体组织cDNA为模板进行LH基因克隆。基于NCBI上已公布的星康吉鳗近缘物种的LH基因编码保守区序列，利用软件Primer Premier 5.0设计克隆引物LH-F (5′-ATGTTAAATTCAGGGCTGA CCTAC-3′)和LH-R (5′-CTAAGCAGGGAGACTGGCT TT-3′)，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Bio-Rad S1000 PCR仪(伯乐，新加坡)按照ApexHF HS DNA聚合酶预混液-FS(含染料)(艾科瑞, 中国)操作说明对垂体cDNA模板进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测和分离，用DNA凝胶回收试剂盒(艾科瑞, 中国)回收并纯化目的PCR产物，将目的产物连接到pEASY-T1克隆载体(全式金, 中国)，然后转化到Trans1-T1感受态细胞(全式金, 中国)中，涂布于含氨苄青霉素(天根, 中国)抗性的琼脂糖平板上，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。PCR体系(25 μL)：12.5 μL 2×Accurate Taq Master Mix，0.5 μL cDNA，0.5 μL正反向引物，11 μL ddH₂O。PCR条件：94 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

使用软件DNAMAN 6.0将测序所得的星康吉鳗LH基因序列片段进行比对拼接，获得星康吉鳗LH基因的完整编码区(ORF)序列并推导其氨基酸序列；利用NCBI数据库对功能结构域进行预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；理化性质应用ProtParam软件进行分析(https://web.expasy.org/protparam/)；亲水性与疏水性利用ProtScale软件进行分析(https://web.expasy.org/protscale/)；跨膜区利用DeepTMHMM在线网站进行预测(https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM/)；信号肽预测运用SignalP 6.0 Server软件进行分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)；N-糖基化位点运用NetNGlyc1.0进行分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)；O-糖基化位点运用YinOYang1.2进行分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang-1.2/)；磷酸化位点利用NetPhos3.1进行分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)；通过PSORT Prediction进行亚细胞定位分析(https://www.genscript.com/psort.html)；蛋白质二级结构通过Psipred网站进行预测(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；蛋白质三级结构从AlphaFold蛋白结构数据库中检索(https://alphafold.ebi.ac.uk/)。通过NCBI数据库中的BLAST进行LH蛋白的同源性分析，获得其他物种的氨基酸序列。运用MEGA 6.0软件，以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建不同物种LH系统发育进化树(自扩展值为1 000)；星康吉鳗LH氨基酸序列与其他不同鱼类LH氨基酸序列同源性运用在线网站Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo)进行比对分析。

根据星康吉鳗LH基因序列，参照pET-28a(+)载体(天根, 中国)上的多克隆位点排列特点，选取NdeⅠ和XhoⅠ作为酶切位点，利用软件Primer Premier 5.0设计1对特异性引物LH-MF: 5′-GGCATATGATGTC AATCTACCCAGAATGCAG-3′和LH-MR: 5′-AA CTCGAGC-TAAGCA-GGGAGACTGGCTTT-3′。在引物LH-MF和LH-MR的5′端分别加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点(方框标注)。PCR扩增条件：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。将得到的目的片段连接至pEASY-T1克隆载体，转化到Trans1-T1感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的琼脂糖平板上，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆，使用LB液体培养基培养。使用质粒DNA提取试剂盒(艾科瑞, 中国)提取重组质粒pEASY-T1-LH，将质粒样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

在37 ℃条件下，使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(TaKaRa, 日本)对测序成功的重组质粒pEASY- T1-LH与pET-28a(+)载体进行3 h双酶切，双酶切产物使用1%琼脂糖凝胶检测。双酶切产物利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收并纯化，用T4连接酶(TaKaRa, 日本)在16 ℃条件下将双酶切产物连接3 h，然后转化到BL21感受态细胞(全式金, 中国)，之后涂布于含卡那霉素(全式金, 中国)抗性的琼脂糖平板上，37 ℃过夜培养。挑取阳性克隆，使用LB液体培养基进行培养，利用少量菌液进行PCR扩增检测。后通过质粒DNA提取试剂盒，提取重组质粒pET-28a-LH，将质粒样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

将测序正确的重组质粒pET-28a-LH转化到表达菌株Rosetta (DE3)感受态细胞(博迈德, 中国)，涂布于含卡那霉素的琼脂糖平板上，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆使用LB液体培养基培养4 h，后将菌液转到4个100 mL含卡那霉素(100 μg/mL)的LB培养基中扩大培养至OD₆₀₀值为0.6~0.8，然后分别加入终浓度为0.01、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG在16 ℃条件下诱导表达16 h。离心收集菌体(8 000 r/min，10 min)，PBS洗涤并重悬菌体，每组各留存1 mL进行后续检测。剩余重悬液用超声波细胞粉碎机(新芝, 宁波)破碎菌体后，12 000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀，用12%聚丙烯酰胺凝胶(金斯瑞, 中国)电泳(SDS-PAGE)检测上清液和沉淀中的蛋白表达情况。将样品与5×SDS上样缓冲液按照5∶1 (体积比)混匀并于100 ℃水浴锅中煮10 min，然后12 000r/min离心10 min，取10 μL进行SDS-PAGE(浓缩胶100 V, 10 min；分离胶140 V, 60 min)，后经考马斯亮蓝试剂(碧云天, 中国)染色，ddH₂O浸泡脱色后经凝胶成像系统(Bio-Rad, 美国)观察结果。

使用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天, 中国)对目的蛋白进行亲和层析柱纯化，通过超滤离心管(索莱宝, 中国)浓缩，采用SDS-PAGE检测，方法同上。收集纯化后的LH重组蛋白，在SDS-PAGE电泳后利用eBlot™ L1蛋白快速湿转仪(金斯瑞, 中国)转移至硝酸纤维素(PVDF)膜上，在封闭液中室温封闭PVDF膜1 h；用TBST洗脱3次，每次5 min；加入1∶2 000稀释的鼠抗6×His单克隆抗体(HRP conjugated)的一抗，4 ℃过夜孵育后，在室温下孵育1 h；用TBST洗脱3次，每次5 min；无需孵育二抗；用ECL化学发光试剂盒(索莱宝, 中国)在暗盒内显色1~2 min，后使用化学发光成像系统(VILBER, 法国)拍照观察。

根据设计的引物对星康吉鳗LH基因CDS区进行扩增，得到LH基因的CDS区序列长为423 bp (GenBank登录号: PP210936.1)，共编码140个氨基酸，序列中存在1个GHB结构域(由27~132位的105个氨基酸组成) (图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 星康吉鳗LH基因CDS序列及推导的氨基酸序列 Fig.1 Coding sequence of C. myriaster LH gene and the deduced amino acid sequence 方框部分：起始密码子；双下划线：GHB功能结构域；终止密码子用*表示。 Start codon is marked with frame. Functional domain GHB is marked with virtual underline. The termination codon is denoted by *.

LH编码蛋白的理化性质预测分析结果显示，该基因编码140个氨基酸，其中，半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)含量占比最高，均为15个，占总氨基酸量的10.7%，而色氨酸(Trp)占比最少，仅为1个，占0.7%。氨基酸编码蛋白分子式为C₆₆₉H₁₀₆₀N₁₈₀O₂₀₆S₂₀，该蛋白含有14个带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)和12个带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)。相对分子质量(M_W)为15.56 kDa，脂肪族指数(aliphatic index)为73.71，理论等电点(pI)为5.85，蛋白不稳定系数(instability index)为66.49，表明该蛋白为不稳定性蛋白。

通过ProtScale分析LH蛋白的亲水性与疏水性，结果显示，第16位氨基酸(Cys)疏水性最强，为2.233，第65位氨基酸(Ser)亲水性最强，为–2.333。大部分氨基酸表现为负值，预测LH蛋白可能是一种稳定的亲水性蛋白(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 LH蛋白亲/疏水性预测 Fig.2 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of LH

使用DeepTMHMM网站预测LH蛋白跨膜结构域，结果显示，该蛋白无跨膜区(图 3)。运用SignalP 6.0 Server软件预测信号肽，结果显示，Signal Peptide (Sec/SPI)值为0.999 2，Other值为0.000 2，表明LH蛋白的前1~22个氨基酸为信号肽。

图 1(Fig. 1)

图 3 LH蛋白跨膜结构域预测 Fig.3 Prediction of transmembrane domain of LH protein

对LH蛋白的N-糖基化位点和O-糖基化位点的预测发现，该蛋白存在1个N-糖基化位点(图 4)和3个O-糖基化位点(图 5)。NetPhos3.1网站分析结果显示，LH蛋白共有17个可能的磷酸化位点，其中，Ser、Thr及Tyr磷酸化位点分别有9个、6个和2个(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 4 LH蛋白的N-糖基化位点预测 Fig.4 Prediction of N-glycosylation site of LH protein

图 1(Fig. 1)

图 5 LH蛋白的O-糖基化位点预测 Fig.5 Prediction of O-glycosylation site of LH protein

图 1(Fig. 1)

图 6 LH蛋白磷酸化位点预测 Fig.6 Prediction of phosphorylation site of LH protein

利用PSORT Prediction软件预测LH蛋白的亚细胞定位，结果显示，该蛋白在细胞核、线粒体和细胞质中的可能性分别为39.1%、26.1%和17.4%。初步预测星康吉鳗LH蛋白定位于细胞核。

二级结构分析结果显示，LH蛋白含有19个α-螺旋，占比13.6%；35个β-折叠，占比25%；86个无规则卷曲，占比61.4%。利用AlphaFold Protein Structure Database网站检索到星康吉鳗和其他脊椎动物LH蛋白的三级结构(图 7)。比较后发现，星康吉鳗LH蛋白的三级结构与日本鳗鲡的LH蛋白三级结构较为相似，与人(Homo sapiens) LH蛋白三级结构存在一定差异。

图 1(Fig. 1)

图 7 星康吉鳗和其他脊椎动物LH蛋白的三级预测结构 Fig.7 The predicted 3D structures of LH protein in C. myriaster and other vertebrates A：星康吉鳗；B：日本鳗鲡；C：人。 A: C. myriaster; B: A. japonica; C: H. Sapiens.

对星康吉鳗LH氨基酸序列与日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、花鳗鲡(A. marmorata)等不同物种的LH氨基酸序列进行比对，并绘制了多个物种基于氨基酸序列的NJ系统进化树，发现星康吉鳗的LH与鳗鲡目的欧洲鳗鲡、花鳗鲡、日本鳗鲡LH在进化树上聚为一簇(图 8)。对星康吉鳗的LH氨基酸序列与多个物种的LH氨基酸序列同源性进行分析，结果显示，星康吉鳗LH与欧洲鳗鲡的同源性为92.14%，与花鳗鲡的同源性为91.43%，与日本鳗鲡的同源性为90.71%，与斑马鱼(Danio rerio)的同源性为65.47%；与小鼠(Mus musculus)同源性为41.73%，与原牛(Bos taurus)同源性为41.73%，与人同源性为43.31%(表 1)。星康吉鳗的LH与其他硬骨鱼类同源性较高，但与哺乳类等同源性较低，说明LH在进化过程中出现了进化差异。不同物种氨基酸序列对比发现了GHB家族的保守信号序列GCP(43~45)、ICSGHC(54~59)、VCTY (77~80)、LPDC(90~93)、PVALSC(104~109) (图 9)。

图 1(Fig. 1)

图 8 LH氨基酸序列的系统进化树分析(枝上数字表示自展值) Fig.8 Phylogenetic tree based on LH amino acid sequences (Numbers on branches indicate bootstrap support values)

表 1(Tab.1)

表 1 LH氨基酸序列的同源性比对 Tab.1 Homology comparison of LH amino acid sequence 物种Species (GenBank Accession No.) 同源性Identity/% 欧洲鳗鲡Anguilla anguilla (XP_035255290.1) 92.14 花鳗鲡Anguilla marmorata (ACK87153.1) 91.43 日本鳗鲡Anguilla japonica (BAD14302.1) 90.71 斑马鱼Danio rerio (NP_991185.1) 65.47 金钱鱼Scatophagus argus (XP_046258169.1) 54.26 许氏平鲉Sebastes schlegelii (AAU14142.1) 53.38 蜂巢石斑鱼Epinephelus merra (BAJ05297.1) 52.90 高体 Seriola dumerili (BAR79710.1) 52.90 五条 Seriola quinqueradiata (BAW34923.1) 52.90 条石鲷Oplegnathus fasciatus (AIZ66847.1) 52.52 半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis (AFF59207.1) 49.64 人Homo sapiens (NP_000885.1) 43.31 小鼠Mus musculus (NP_032523.2) 41.73 原牛Bos taurus (NP_776355.1) 41.73

表 1 LH氨基酸序列的同源性比对 Tab.1 Homology comparison of LH amino acid sequence

图 1(Fig. 1)

图 9 星康吉鳗LH氨基酸序列与其他物种LH氨基酸对比 Fig.9 Amino acid alignment of LH from C. myriaster and other species 以相似性50%为阈值，≥50%以蓝色标注，≥75%以粉色标注，100%以黑色标注。★. 保守的半胱氨酸残基；破折号表示为使所有比较序列之间的一致性程度最大化而创建的间隔。 Similarity is set at 50% as threshold, greater than or equal to 50% is highlighted blue, greater than or equal to 75% is in pink, and 100% is in black. ★. Conserved cysteine residues; Dashes represent gaps created to maximize the degree of identity among all compared sequences.

PCR扩增得到LH基因插入酶切位点后的片段长度约为439 bp (图 10)，与预期大小相符。将片段连接至质粒pEASY-T1后，对重组质粒pEASY-T1-LH测序，结果显示序列完全正确。重组质粒pEASY- T1-LH与pET-28a(+)载体经双酶切后，电泳检测结果显示，酶切产物大小约为428 bp和5 289 bp (图 11)。酶切产物经连接得到重组质粒pET-28a-LH，转化到Trans1-T1感受态细胞中，对5组菌液样品PCR检测，得到与预期大小相符的特异条带(图 12)。提取重组质粒pET-28a-LH，测序结果表明正确构建了重组质粒pET-28a-LH。

图 1(Fig. 1)

图 10 LH基因插入酶切位点后的片段扩增 Fig.10 Fragment amplification of LH after insertion into restriction site M：DL1000 DNA marker；1：PCR产物。 M: DL1000 DNA marker; 1: PCR amplification products.

图 1(Fig. 1)

图 11 重组质粒pEASY-T1-LH与pET-28a(+)载体的双酶切产物 Fig.11 Double digestion product of recombinant plasmid pEASY-T1-LH and pET-28a(+) vector 1：重组质粒pEASY-T1-LH双酶切产物；2：pET-28a(+)载体双酶切产物；M：DL5000 DNA marker。 1: Double digestion product of recombinant plasmid pEASY-T1-LH; 2: Double digestion product of pET-28a(+) vector; M: DL5000 DNA marker.

图 1(Fig. 1)

图 12 重组质粒pET-28a-LH培养菌液PCR鉴定 Fig.12 PCR identification of recombinant plasmid pET-28a-LH culture bacteria 1：样品1；2：样品2；3：样品3；4：样品4；5：样品5；M：DL2000 DNA marker。 1: Sample 1; 2: Sample 2; 3: Sample 3; 4: Sample 4; 5: Sample 5; M: DL2000 DNA marker.

将重组质粒pET-28a-LH转化到Rosetta (DE3)感受态细胞中进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示，经不同浓度IPTG诱导后的菌液在25~35 kDa之间出现特异性条带，而空载体对照菌未出现，此条带即为LH重组蛋白，大小约为26.5 kDa。尽管添加了不同浓度的IPTG诱导表达，但蛋白的表达量并没有出现明显差异，因此，本研究将LH重组蛋白的IPTG诱导浓度定为0.5 mmol/L。对不同浓度IPTG诱导的菌液超声破碎后分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE结果显示，LH重组蛋白主要在上清液中表达。对经His-tagged镍柱亲和层析柱纯化的蛋白流出液进行SDS-PAGE电泳检测后发现，除目的蛋白外，仍存在部分杂蛋白(图 13)。经Western Blot实验鉴定，所纯化的蛋白可以被His抗体特异性识别，并在26.5 kDa处有特异性条带，表明携带6×His标签的融合蛋白成功表达(图 14)。

图 1(Fig. 1)

图 13 LH重组蛋白的表达和纯化的SDS-PAGE检测 Fig.13 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant LH protein M：预染蛋白标记(11~180 kDa)；1：pET-28a(+)空载；2~5：0.01、0.1、0.5和1 mmol/L IPTG诱导；6：0.5 mmol/L IPTG诱导后上清液；7：0.5 mmol/L IPTG诱导后沉淀；8：纯化后重组蛋白。 M: Prestained protein ladder (11–180 kDa); 1: pET-28a(+) empty; 2–5: 0.01, 0.1, 0.5, and 1 mmol/L IPTG-induced; 6: Supernatant of bacterial induction by 0.5 mmol/L IPTG; 7: Sediment of bacterial induction by 0.5 mmol/L IPTG; 8: Purification of target protein.

图 1(Fig. 1)

图 14 LH重组蛋白Western Blot鉴定结果 Fig.14 Results of LH recombinant protein identification by Western Blot M：预染蛋白标记(11~180 kDa)；1：pET-28a(+)空载；2：LH重组蛋白。 1: Prestained protein ladder (11–180 kDa); 2: pET-28a(+) empty; 3: LH recombinant protein.

本研究从星康吉鳗垂体中克隆得到423 bp的LH基因CDS区序列，编码140个氨基酸。与其他鱼类的LH氨基酸序列进行比对，发现其与鳗鲡目鱼类中的欧洲鳗鲡、花鳗鲡、日本鳗鲡同源性达到90.71%~ 92.14%，与其他目鱼类LH的同源性为49.64%~ 65.47%，与哺乳动物同源性为41.73%~ 43.31%。基于LH氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也显示，星康吉鳗与鳗鲡目中的欧洲鳗鲡、花鳗鲡和日本鳗鲡聚为一支，这与传统的形态学分类结果一致。N-糖基化是所有真核生物中最复杂和最普遍的蛋白质修饰，由N-糖基化或O-糖基化修饰的蛋白质可调节蛋白质的生理性质，从而调节基因组编码的天然蛋白质的功能(Lee et al, 2015)。糖基化是一种蛋白质翻译后修饰，在蛋白质形成自身特有结构、维持蛋白质结构稳定及功能发挥等方面具有重要作用，并会影响膜蛋白的成熟转运、细胞粘附及细胞间信号传导等(刘中静等, 2022)。硬骨鱼类的LH与其受体结合的能力以及异源二聚体的稳定性会随N-糖基化位点和半胱氨酸残基的变化而受到影响(陈圣毅等, 2014; Chi et al, 2015)。史氏鲟(Acipenser schrenkii)、大刺鳅(Mastacembelus armatus)和密斑刺鲀的LH氨基酸序列均存在12个保守的半胱氨酸残基和1个糖基化位点(胡红霞等, 2006; 黄小琪等, 2020; 郭煜文等, 2023)。本研究通过对N-糖基化位点分析发现，星康吉鳗LH的氨基酸序列中含有1个N-糖基化位点，且与其他硬骨鱼类和高等脊椎动物保持高度保守性。通过多序列比对结果发现，星康吉鳗LH氨基酸序列含有15个半胱氨酸残基，与其他鳗鲡目鱼类LH氨基酸序列包含的半胱氨酸残基数量相同，但与非鳗鲡目鱼类LH氨基酸序列包含的半胱氨酸残基数量存在差异，进一步说明了鳗鲡目鱼类LH基因在进化过程中出现特异性。

pET-28a(+)载体是一种应用广泛的表达系统，具有促进折叠、提高溶解度、便于纯化等优点，可以产生大量的蛋白质(Baciu et al, 2023)。pET-28a(+)载体表达的蛋白质由蛋白标签和目的蛋白连接在一起，称为融合蛋白，其蛋白标签为His-tag和T7-tag，相对分子质量约10 kDa (李文桂等, 2010)。在使用pET-28a(+)载体对金钱鱼LH进行原核表达的实验中，Western Blot检测结果显示LH重组蛋白的相对分子质量在15.0~16.0 kDa之间，表明LH蛋白已成功表达(Zhang et al, 2018)。本研究首次通过pET-28a(+)载体与星康吉鳗LH基因构建了重组质粒pET-28a-LH，实现了星康吉鳗LH蛋白的体外原核重组表达，经Western Blot检测结果显示，星康吉鳗LH重组融合蛋白在约26.5 kDa的位置有1条特异性结合条带，因LH重组融合蛋白中插入了His-tag和T7-tag标签，故除去标签后LH蛋白表达的相对分子质量约为16.5 kDa，比预测的相对分子质量大1 kDa左右。已有研究证明，重组蛋白的相对分子质量比预计的偏大，推测其原因可能是糖基化对重组蛋白的电泳迁移有影响(Chen et al, 2012)。因此，本研究中星康吉鳗LH重组融合蛋白已经通过原核表达系统成功表达，为后续开展星康吉鳗LH蛋白的离体实验以及在体实验奠定了基础。

本研究在实验过程中发现，采用BL21(DE3)感受态细胞作为宿主菌无法成功表达星康吉鳗的LH重组融合蛋白。在原核表达系统中，基因中成串或多个大肠杆菌(Escherichia coli)稀有密码子的存在，是外源蛋白不表达或低表达量的重要影响因素之一(李月红等, 2012)。对本研究克隆得到的LH基因序列进行稀有密码子分析，其CAI值为0.66，小于0.80，且存在连续的稀有密码子，这可能会影响LH蛋白在大肠杆菌中的表达。Rosetta (DE3)感受态细胞是通过BL21 (DE3)感受态细胞优化产生的，该菌株有一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌稀有密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNA，可增强真核蛋白表达(脱萍等, 2021)。因此，本研究选用经过修饰后的专用于表达大肠杆菌稀有密码子的Rosetta(DE3)感受态细胞，从而高效地表达了可溶性的LH重组融合蛋白。在对Mx (Myxovirus resistance)基因原核表达的结果中表明，目的蛋白在Rosetta (DE3)感受态细胞中检测到了表达，而在BL21(DE3)感受态细胞中未检测到表达(尹春光等, 2009)，该结果与本实验结果相一致。在海七鳃鳗(Petromyzon marinus) CXCL8基因的原核表达中，Rosetta(DE3)感受态细胞中目的蛋白表达量明显高于BL21(DE3)感受态细胞(朱欣云等, 2018)。DAB₃₈₉ IL-2蛋白在原核表达过程中同样发现，BL21(DE3)感受态细胞不能对其进行表达，而Rosetta(DE3)感受态细胞是正确表达该蛋白的合适菌株(Zarkar et al, 2020)。本研究使用Rosetta(DE3)感受态细胞成功表达了星康吉鳗的LH重组融合蛋白，为后续原核表达过程中表达感受态细胞的选择提供了思路。

目前，大肠杆菌已被有效地用于大量重组蛋白的生产，然而，在表达过程中由于蛋白质的错误折叠和聚集而导致包涵体，虽然包涵体的形成便于分离和防止蛋白质水解，但其需要用高浓度的变性剂进行溶解，且变性裂解后较难复性，导致具有生物活性的蛋白总产量很低，故通常对诱导条件进行优化来避免包涵体的产生，从而形成可溶性的蛋白(Kim et al, 2013; Nguyen et al, 2014)。另有研究表明，低温下的蛋白表达往往能显著提高重组蛋白的溶解度(Francis et al, 2010)。本研究对LH重组融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG浓度均进行了优化，最终通过16 ℃、16 h成功表达出可溶性的LH重组融合蛋白。Kim等(2013)优化了重组人生长激素蛋白的原核表达条件，确定16 ℃诱导16 h为最佳诱导条件。在大口黑鲈(Micropterus salmoides) LH蛋白的原核表达研究中同样发现，16 ℃诱导条件下目的蛋白呈可溶性(张李敏, 2022)。本研究还发现，在不同浓度IPTG条件下蛋白的表达量无明显差异。凡纳对虾(Penaeus vannamei)热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的原核表达研究显示，一定浓度范围内的IPTG对表达无明显影响，0.1~1 mmol/L IPTG适用于重组载体的诱导表达(吴任等, 2006)。脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)热休克蛋白90 (HSP90)原核表达过程中发现，随着IPTG浓度的增加，目的蛋白占菌体总蛋白的比例无明显差异(韩俊英等, 2011)。本研究结果对原核表达制备可溶性蛋白样品提供了参考，也为后续进一步研究星康吉鳗LH蛋白的功能奠定了基础。

本研究成功克隆了星康吉鳗LH基因的CDS区序列，并对其氨基酸序列进行生物信息学分析，构建了重组质粒pET-28a-LH，通过转化Rosetta (DE3)感受态细胞经IPTG诱导成功表达了分子质量单位约为26.5 kDa的LH重组融合蛋白，除去载体表达的融合标签部分，实际表达的蛋白约为16.5 kDa，这与预测大小相符。经Western Blot检测结果显示，该重组融合蛋白可以被His抗体特异性识别，表明携带6×His标记的LH重组融合蛋白成功表达。