暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交F1代的荧光PCR鉴定技术的建立
doi: 10.3969/j.issn.2095-9869.20241205004
赵昕1,2 ， 车帅2 ， 王焕2 ， 孙侦龙4 ， 尤颖哲5 ， 柳淑芳2,3 ， 庄志猛2
1. 浙江海洋大学水产学院 浙江 舟山 316022
2. 海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东 青岛 266071
3. 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 山东 青岛 266237
4. 江苏中洋集团股份有限公司 江苏 南通 226600
5. 漳州市水产技术推广站 福建 漳州 363000
基金项目: 国家重点研发计划(2019YFC1604700)、国家现代农业产业技术体系(CARS-47)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2024JC0101；20603022024023)共同资助
Establishment of Fluorescence PCR Identification Techniques for Takifugu obscurus, T. rubripes, and Their Hybrid F1 Generation
ZHAO Xin1,2 ， CHE Shuai2 ， WANG Huan2 ， SUN Zhenlong4 ， YOU Yingzhe5 ， LIU Shufang2,3 ， ZHUANG Zhimeng2
1. Marine Fishery College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022 , China
2. State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071 , China
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237 , China
4. Jiangsu Zhongyang Group Co., Ltd., Nantong 226600 , China
5. Zhangzhou Fisheries Technical Extension Station, Zhangzhou 363000 , China
摘要
暗纹东方鲀((Takifugu obscurus ♀)×红鳍东方鲀(T. rubripes ♂)的杂交 F1 代具备双亲诸多优良性状，市场前景较好。但杂交 F1 代的形态特征与其亲本难以区分，为河鲀种质资源保护和开发利用带来了困扰，迫切需要开发有效的分子鉴定方法对杂交 F1 代及其亲本进行精准判别。为实现杂交 F1 代及其亲本的快速准确鉴定，本研究根据核基因 SH3PX3 多态性 SNP 位点，设计荧光 PCR 扩增引物及探针，优化了荧光 PCR 参数，建立了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的荧光 PCR 鉴定方法，并对该方法进行了验证。结果显示：杂交 F1 代的 COI 序列与母本暗纹东方鲀的序列相似度为 100%，在 NJ 进化树中聚为一支，无法实现杂交 F1 代和母本的区分；SH3PX3 基因荧光 PCR 体系最佳退火温度为 48 ℃；荧光 PCR 扩增后，暗纹东方鲀仅 FAM 通道有 Ct 值，ΔCt 值大于 20，红鳍东方鲀 FAM 信号通道比 HEX 通道的 Ct 值高 2~5，杂交 F1 代的 FAM 通道与 HEX 通道的 Ct 值接近，二者之差小于 2；基于上述方法对 17 份暗纹东方鲀、21 份红鳍东方鲀和 53 份杂交 F1代样品进行验证，鉴定准确率为 100%。本研究建立的荧光 PCR 鉴定方法不仅具有结果准确、易判读等优点，还避免了测序等繁琐流程，可实现高通量检测，显著提高了检测效率，为河鲀种质资源鉴定与保护、杂交育种和遗传多样性研究提供了技术支持。
Abstract

Pufferfish, commonly known as "fugu," belong to the family Tetraodontidae within the class Actinopterygii. With a wide variety of species, the genus Takifugu has the highest number of members and the greatest economic value. Notable representatives include Takifugu obscurus and T. rubripes. These two pufferfish species are characterized by their tender and delicious flesh as well as their high nutritional value. They are widely used in aquaculture, pufferfish toxin pharmaceutical development, and vertebrate genome research, thus holding significant economic, scientific, and medicinal value. T. obscurus is primarily distributed along the coasts of the Yellow, Bohai, and East China Seas in China. It can also enter the middle and lower reaches of rivers such as the Yangtze River and other connected lakes. It is one of China's important freshwater economic aquaculture species. Due to its high fat content and strong edibility, it is highly favored by domestic consumers, especially those who enjoy cooking. However, issues associated with aquaculture, such as small body size, slow growth, and sensitivity to low temperatures, have led to weaker market competitiveness. T. rubripes is mainly found in the Yellow Sea, East China Sea, and Taiwan waters of China. It is widely cultured in northern China, Japan, and South Korea and is suitable only for marine aquaculture. Compared to T. obscurus, T. rubripes has a faster growth rate and larger body size. However, when facing nutritional deficiency, its larvae may engage in cannibalism. After multiple generations of self-crossing, the germplasm of T. rubripes has degraded, with issues such as deformities and diseases severely impacting breeders.

Hybrid breeding combines superior traits of parents to produce new hybrid varieties with improved characteristics. To obtain varieties with better traits and meet the rapidly developing needs of the pufferfish industry, aquaculture farmers have utilized the principle of hybrid vigor to increase production and efficiency. They have crossed T. obscurus (♀) with T. rubripes (♂) to produce hybrid F1 offspring with good market prospects. The hybrid F1 generation inherits the fast growth rate and large body size of the paternal parent (T. rubripes) and the freshwater culture capability of the maternal parent (T. obscurus). Therefore, the hybrid pufferfish not only retains the freshwater culture capability but also achieved improved growth rates and yields. However, the hybrid F1 generation has morphological features that blended with those of the parents. T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generations are similar in appearance and body size at the larval, juvenile, and adult stages, making it impossible to distinguish them by naked eye observation. Additionally, certain tissues or processed meat products of pufferfish cannot be differentiated based on appearance alone. In recent years, the hybrid offspring, which share similar morphological features with their parents, have been easily mixed into the parentalgroups used for hybrid breeding. This has led to prominent issues in pufferfish aquaculture, such as mixed germplasm, serious quality degradation, and uncontrolled hybridization. The escape of hybrid individuals can also affect the gene pool of wild populations, which is not conducive for protecting germplasm resources. Accurate species identification is not only essential for distinguishing pufferfish species but also promotes the rational development of fishery resources, ecological surveys, and biodiversity conservation. Therefore, there is an urgent need for a method to distinguish between T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generation.

In our previous research, we identified a single nucleotide polymorphism (SNP) site in the SH3PX3 nuclear gene, which combined with mitochondrial genes, can be used to identify T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generation. Direct sequencing of SNP sites can differentiate between the three. However, when faced with a large number of samples, the sequencing cost is relatively high, and the vast and complex data generated during sequencing impose higher demands on researchers' data analysis capabilities. In recent years, the TaqMan probe method based on fluorescence PCR has been widely used for gene expression, mutation, and polymorphism research because of its high sensitivity, speed, and specificity. Compared to ordinary TaqMan probes, TaqMan-MGB probes can accurately distinguish single-base differences and are commonly used for SNP genotyping.

In the present study, we designed fluorescence PCR amplification primers and probes based on the polymorphic SNP site of the SH3PX3 nuclear gene, optimized the fluorescence PCR parameters, and established a fluorescence PCR identification method for T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generation. This method was validated, with the results showing that: (1) The COI sequence of the hybrid F1 generation was 100% identical to that of the maternal parent T. obscurus, and they clustered together in the NJ phylogenetic tree, making it impossible to distinguish between the hybrid F1 and the maternal parent; (2) The optimal annealing temperature for the SH3PX3 gene fluorescence PCR system was 48℃; (3) After fluorescence PCR amplification, only the FAM channel of T. obscurus has a Ct value, and the ΔCt is greater than 20, T. rubripes had a Ct value in the FAM channel that was 2 to 5 higher than that in the HEX channel, and the Ct values of the FAM and HEX channels in the hybrid F1 were close, with a difference of less than 2; (4) Based on the above method, 17 samples of T. obscurus, 21 samples of T. rubripes, and 53 samples of hybrid F1 were verified, with an identification accuracy rate of 100%. The fluorescence PCR identification method established in this study not only provides accurate results and easy interpretation, but also avoids cumbersome processes such as sequencing. It can achieve high-throughput detection and significantly improve detection efficiency. This method offers technical support for the identification and protection of pufferfish germplasm resources, hybrid breeding, and genetic diversity research.

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）与暗纹东方鲀（T. obscurus）均隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、鲀形目（Tetraodontiformes）、鲀科（Tetraodontidae）、东方鲀属（Takifugu）。红鳍东方鲀主要分布于我国黄渤海、东海及台湾海域，是东方鲀属中个体最大、生长最快的种类，体长为 35~45 cm，最长可达 80 cm（伍汉霖，1981）； 暗纹东方鲀主要分布于我国黄渤海、东海沿岸，也可进入长江和其他江河的中下游及与此相连的湖泊，是海淡水洄游性鱼类，体长仅54~285 mm（苏锦祥，2002）。二者均为我国河鲀养殖主要种类，具有较高的营养价值和经济价值。杂交育种可以将亲本的优势性状结合到一起，从而获得性状优良的杂交新品种（孙斌华等，2024; 邹杰等，2013）。为满足河鲀产业快速发展的需要，养殖业者利用杂交优势原理进行增产增效，其中以暗纹东方鲀为母本和红鳍东方鲀为父本进行杂交育种获得了具有养殖存活率高、生长速度快、肌肉品质好等优良性状的杂交 F1 代（赵海涛等，2013; 张年国等，2016）。杂交 F1 代的肉质继承了暗纹东方鲀的鲜美风味，比红鳍东方鲀的肌肉质地更柔软，且可以在淡水中养殖，其在苗种时期体长以及生长速度方面也优于暗纹东方鲀（Park et al，2017）。然而，杂交 F1 代的形态兼具暗纹东方鲀、红鳍东方鲀的特征，三者在稚鱼、幼鱼、成鱼时期外观体型均相似，仅依靠形态学鉴别可能会出现错误，影响优质苗种的培育（徐杰杰，2021）。若杂交 F1 代混入育种亲本群体中，则会导致河鲀亲本种质混杂和无序杂交，将严重影响其养殖业的健康发展。此外，自然海区也发现了东方鲀属鱼类近缘杂交现象（尹璐等，2016），可能对东方鲀属鱼类的遗传多样性和种质纯度构成潜在威胁。因此，开发一套杂交 F1 代及其亲本的鉴定方法已成为当前研究的迫切需求。
线粒体 COI 基因可实现多数硬骨鱼类的物种鉴别，在鱼类物种鉴定、系统发育研究中广泛应用（李楠等，2018; 王熠，2018; 刘凯莹，2023）。由于线粒体基因为母系遗传，仅利用线粒体基因无法实现杂交种与其母本的区分（李培等，2009; 马波等，2018）。与之相比，核基因兼具父母本的遗传信息，结合线粒体基因，可以有效区分杂交种及亲本。Qu 等（2018）筛选出 RYR3 核基因标记，并集合线粒体 COI 基因实现了杂交石斑鱼与其父母本的鉴别。杨子豪等（2024）利用单拷贝 fam43a基因和线粒体 Cyt b基因能够快速准确地鉴定中华鲟（Acipenser sinensis）及其潜在杂交种。本团队前期研究发现，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的核基因 SH3PX3 存在一个 SNP 位点，即暗纹东方鲀为 TT 型，红鳍东方鲀 CC 型，杂交 F1 代为 TC 型，该位点位于外显子片段，为同义突变，未改变编码的氨基酸，不会影响蛋白质的功能。利用核基因 SH3PX3 所筛选的 SNP 位点，通过直接测序的方法，可以实现暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交 F1 代样品的准确鉴别。然而，该方法面对大量样本的检测需求时，测序成本较为高昂，测序过程中产生的庞大、复杂的数据，对于科研人员的数据分析能力提出了更高的要求。因此，亟需开发一种快速、灵敏、精确的检测方法，实现三者的快速准确鉴定。
近年来，实时荧光定量 PCR 技术因具备高灵敏度、快速性和强特异性等优势，在基因表达、突变以及多态性研究领域获得了广泛应用（高正琴等，2011）。 TaqMan-MGB 探针能够精准区分单个碱基的差异，常用于 SNP 分型，既省去了普通 PCR 检测中扩增产物的后续分析与验证，简化了检测流程，也减少了实验操作中的污染风险，提高了检测的安全性。目前，该技术已广泛应用于鱼类的病毒检测（谭翰清等，2013; 马冬梅等，2011）和成分检测领域（李杰等，2022），在鱼类杂交种及亲本鉴定领域的应用尚未见报道。本研究结合线粒体 COI 基因和核基因 SH3PX3 的 SNP 位点，优化并引入了 TaqMan-MGB 荧光探针，优化了荧光 PCR 参数，建立了用以区分暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的荧光 PCR 快速鉴定方法，以期为河鲀种质资源保护及养殖业的可持续发展提供可靠的技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
河鲀样品共计 121 份，其中暗纹东方鲀 27 份、红鳍东方鲀 31 份、杂交 F1 代 63 份，样品信息详见表1。将样品的肌肉组织固定于 95%酒精中备用，取暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交 F1 代样品各 10 份，用于荧光 PCR 方法的建立；剩余样品用于方法的验证。
表1样品信息
Tab.1Sources of sample information
1.2 实验方法
1.2.1 DNA 提取
本研究利用海洋生物组织基因组 DNA 提取试剂盒（北京天根）提取河鲀样本中的 DNA，并将提取后的 DNA 使用 Nano300 微量分光光度计进行 DNA 浓度和纯度测定，置于–20℃中保存。
1.2.2 引物和探针的设计合成
根据前期研究发现的 SH3PX3 基因多态性 SNP 位点（T/C）设计荧光 PCR 扩增引物和 MGB 分型探针，荧光探针 1 与荧光探针 2 分别选取 FAM（蓝色）、HEX（绿色）荧光素进行标记；线粒体 COI 基因引物序列参考 Ward 等（2009）的研究。引物特异性使用 Primer-BLAST 工具在 NCBI 数据库中进行验证。引物和探针由北京六合华大基因科技有限公司合成。序列详情见表2。
表2引物和探针序列
Tab.2Primer and probe sequences
1.2.3 线粒体 COI 基因扩增体系
PCR 扩增体系为 25 μL，其中，2×Rapid Taq Master Mix（南京诺唯赞）12.5 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物（10 µmol/L）各 1 μL，水 8.5 μL。PCR 程序：94℃预变性 5 min；94℃ 变性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 20 s，共 35 个循环；72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京六合华大基因科技有限公司进行双向测序，测序结果通过 NCBI 中的 BLAST 工具进行序列比对。
1.2.4 荧光 PCR 扩增体系及优化
为确保荧光 PCR 实验扩增结果的一致性，将所有样品 DNA 浓度稀释至 200 ng/µL。每个反应 3 个平行实验。荧光 PCR 的扩增体系为 25 μL，含荧光 PCR Mix 预混液（青岛立见）12.5 μL，DNA 模板 5 μL，引物（20 µmol/L）各 0.5 μL，探针（10 µmol/L）各 0.5 μL，水 5.5 μL。PCR 条件：37℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 15 s，48℃ 30 s（收集荧光信号），45 个循环。
1.2.5 数据分析
使用 SeqMan软件对 COI基因测序原始序列进行校对和拼接，采用 MEGA 7.0 构建邻接法（neighbor-joining，NJ）分子系统发育树，系统发育树分支的置信度利用 Bootstrap 检验，重复次数为 1000。
荧光 PCR 结束后，导出扩增曲线及 FAM、HEX 通道的 Ct 值，计算 Ct±SD 和 ΔCt（|FAM–HEX|）。
2 结果与分析
2.1 暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的 COI 基因鉴别结果
所有样品均成功扩增，有效序列长度为 603 bp。所得序列经 BLAST 比对分析表明，27 份暗纹东方鲀和 31 份红鳍东方鲀的 COI 基因均与 NCBI 数据库中靶标种类的 COI 基因片段同源性为 100%。63 份杂交 F1 代的 COI 基因与暗纹东方鲀 COI 基因的同源性为 100%。使用本研究测定的部分序列和 6 条从 NCBI 数据库下载的线粒体 COI 基因序列，以绿鳍马面鲀（Thamnaconus modestus）为外群，构建 NJ 系统发育树。结果表明，本研究自测的杂交 F1 代亲本序列与下载的 6 条参考序列均以较高的支持率分别聚类，且杂交 F1代分别与母本暗纹东方鲀聚为一支（图1）。可见 COI 基因仅可对杂交 F1 代的母本进行溯源。
2.2 荧光 PCR 结果分析
2.2.1 最佳退火温度筛选
以基因组 DNA 为模板，设置退火温度分别为 48℃、50℃、56℃时进行荧光 PCR 扩增。结果如图2a所示，退火温度为 48℃时扩增曲线为 S 型，线型流畅，扩增效率较好，表明荧光 PCR 正常，目标序列成功扩增，且反应体系无异常，表3中的扩增结果有明显差异。图2b和图2c的扩增曲线线型不流畅，表3中的 Ct 值大于 35，超出检测范围。因此，本研究后续荧光 PCR 参数设定为：37℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 15 s，48℃ 30 s，循环 45 次。
2.2.2 荧光 PCR 方法的建立
利用优化后的荧光 PCR 程序对 10 份暗纹东方鲀（编号 TO1~TO10）、10 份红鳍东方鲀（编号 TR1~TR11）和 10 份杂交 F1 代（编号 1~10）样品进行扩增，所有样品均成功扩增。暗纹东方鲀样品仅在 FAM 检测通道呈现特异性扩增，ΔCt 大于 20（图3a，附表1）；红鳍东方鲀样品在 FAM 和 HEX 检测通道均显示扩增，FAM 通道的 Ct 值在 20~30 之间，HEX 通道的 Ct 值在 20~26 之间，ΔCt 为 2~5（图3b，附表1）；杂交 F1 代样品在 FAM 和 HEX 检测通道的均显示扩增，FAM 通道和 HEX 通道 Ct值均在 20~30 之间，ΔCt 小于 2（图3c，附表1）。综上，FAM 单通道扩增，ΔCt 大于 20 的样品可判定为暗纹东方鲀；FAM、HEX 通道均有扩增且 ΔCt 为 2~5 的样品可判定为红鳍东方鲀；FAM、HEX 通道均有扩增且 ΔCt 小于 2 的样品可判定为杂交 F1 代。
图1暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的 COI 基因序列 NJ 系统树
Fig.1The NJ phylogenetic tree of COI gene sequences for T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generation
TR 为自测红鳍东方鲀序列，TO 为自测暗纹东方鲀序列，ZJ 为自测杂交 F1 代序列。
TR represents the self-determined sequences of T. rubripes, TO represents the self-determined sequences of T. obscurus, and ZJ represents the self-determined sequences of the hybrid pufferfish.
图2退火温度分别为 48℃（a）、50℃（b）和 56℃（c）的扩增曲线
Fig.2Amplification curves at annealing temperature of 48℃ (a) , 50℃ (b) , and 56℃ (c)
2.3 荧光 PCR 方法的验证
利用 91 份已知遗传背景的河鲀样品对上述方法进行验证，结果见图4。所有样品均成功扩增，编号为 TO11~TO27 的 17 份样品经荧光 PCR 扩增后仅有 FAM 通道有 Ct 值，ΔCt 大于 20，鉴定为暗纹东方鲀。编号为 TR11~TR31 的 21 份样品的 ΔCt 为 2~5，鉴定为红鳍东方鲀。编号为 11~53 的 53 份样品经荧光 PCR 扩增后 ΔCt 小于 2，鉴定为杂交 F1 代。经与样品背景信息比对后鉴定结果准确率为 100%。
表3退火温度为 48℃、50℃和 56℃时的 Ct 值
Tab.3Ct values at annealing temperature of 48℃, 50℃, and 56℃
注：“–”代表无 Ct 值。样品编号 TO1、TO2 为暗纹东方鲀，TR1、TR2 为红鳍东方鲀，1、2 为杂交 F1 代。
Note: “–” represents no Ct value. Samples TO1 and TO2 were T. obscurus, TR1 and TR2 were T. obscurus, and 1 and 2 were hybrid F1 generation.
图3暗纹东方鲀（a）、红鳍东方鲀（b）及其杂交 F1 代（c）样品的荧光 PCR 扩增曲线
Fig.3Fluorescence PCR amplification curves of T. obscurus (a) , T. rubripes (b) , and their hybrid F1 generation (c)
图491 份样品的 ΔCt 值分布
Fig.4Distribution of ΔCt values in 91 samples
3 讨论
3.1 杂交 F1 代及其亲本鉴定方法
虽然暗纹东方鲀与红鳍东方鲀在体色与斑纹、体型与比例及鳍条数量等形态特征上存在差异，但其杂交 F1 代通常表现为亲本特征的混合或中间型，尤其在幼体或未成熟阶段，三者的外部形态极为相似，仅通过形态学特征很难区分，需要结合分子标记手段对其鉴定。本研究通过线粒体 COI 基因对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的序列同源性、系统进化树分析，结果显示，线粒体 COI 可有效鉴别暗纹东方鲀和红鳍东方鲀，但由于线粒体基因的母系遗传特性，无法实现杂交 F1 代与其母本的有效鉴定（图1）。郑乐云（2014）研究表明，赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）和云纹石斑鱼（Epinephelus moara）正反交子一代的线粒体 COI、16S rDNA、Cyt b 基因序列类型分别与母本的序列类型一致。吴文化（2010）研究发现，线粒体 DNA 条形码技术能够有效鉴别纯种鲟，并准确鉴定鲟杂交子代的母系来源，但对母系来源相同的杂交鲟鱼品种则无法实现有效区分。
有研究表明，基于所筛选的 SNP 位点建立荧光 PCR 方法可以实现物种的快速鉴定。吴锐琼等（2024） 筛选了福建省内野生棘胸蛙（Quasipaa spinosa）两个不同种群间的 12S rRNA 基因的 SNP 位点，并利用 KASP 技术开发了一种针对这两个群体的特异性 SNP 快速分型方法。冯俊彦等（2022）利用简化基因组测序技术对甘薯（Dioscorea esculenta）种质材料进行 SNP 位点筛选，并利用 HRM 技术实现了对不同基因型的准确区分。核基因具有双亲遗传特性，利用单核苷酸多样性（SNP）分子标记技术，结合线粒体基因，能够精准鉴别杂交种及其亲本。本团队前期通过核基因 SH3PX3 筛选到一个 SNP 位点（T/C），该位点可有效鉴别暗纹东方鲀（TT 型）、红鳍东方鲀（CC 型）及其杂交 F1 代（TC 型）。本研究利用该位点，设计荧光 PCR 扩增引物及探针，优化了荧光 PCR 参数，建立了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的荧光 PCR 鉴定方法，相较于传统形态学鉴定和线粒体基因鉴定方法，该方法在操作简便性、检测时效性和通量方面均实现了显著提升，为暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的准确鉴定提供了有力的技术支撑。
3.2 荧光 PCR 快速鉴别方法的有效性
SNP 位点的检测方法主要包括直接测序法和 TaqMan 探针法等。本研究前期利用河鲀核基因 SH3PX3 的 SNP 位点对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交 F1代进行鉴定，通过直接测序方法获得鉴定结果，但该方法难以满足大批量样本的同步鉴定需求，操作流程较为繁琐复杂。TaqMan-MGB 探针法在操作步骤、定量能力、检测时间等方面均表现出显著优势，能够快速、准确区分杂合子（杂交种）和纯合子（亲本），因此，本研究采用了 TaqMan-MGB 探针，建立了鉴定暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的荧光 PCR 方法。与普通 TaqMan 探针相比，本研究采用的 MGB 探针的 3'端存在一个能插入 DNA的小沟结合物（Minor Groove Binder，MGB），提高了检测的灵敏性和特异性，克服了普通 TaqMan 探针假阳性率较高的缺点（吕燕等，2022; 郭立新等，2020）。TaqMan-MGB 探针技术已成功应用于植物、作物等物种鉴定领域（郭立新等，2020; Endo et al，2020; 李忠华等，2021; 张田等，2021; 吴明生等，2015），在鱼类杂交种及其亲本鉴定领域尚未见到报道。本研究首次将该技术应用于杂交种及亲本鉴定领域，且探针所选取的 FAM 通道和 HEX 通道与多数荧光检测设备兼容，能够实时监测结果，省去电泳及核酸测序等步骤，操作更加便捷，整个鉴定流程控制在 2 h 以内。结果判读也较为简单，仅通过两个荧光通道的 Ct 值差异，就可轻松实现暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的准确鉴别，方法建立与验证阶段的样品扩增结果一致，证实了该方法的准确性、稳定性、特异性，开拓了新方法。
4 结论
本研究利用线粒体 COI 基因对暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代进行了序列相似性比对、NJ 进化树分析，准确鉴别了杂交 F1代的母系遗传信息； 针对核基因 SH3PX3 的 SNP 位点，设计荧光 PCR 扩增引物及探针，优化了荧光 PCR 参数，建立了快速鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的荧光 PCR 方法，实现了杂交 F1 代及其亲本的快速、准确和高通量鉴别。本研究结果后续可用于杂交河鲀的亲本溯源，避免杂交子代逃逸或误入亲本群体导致种质混乱的情况发生，为河鲀种质资源鉴定与保护、杂交育种和遗传多样性研究提供了技术支持。
附表1 荧光 PCR 扩增 Ct 值
Appendix 1 The Ct value results of fluorescence PCR amplification
续表
图1暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交 F1 代的 COI 基因序列 NJ 系统树
Fig.1The NJ phylogenetic tree of COI gene sequences for T. obscurus, T. rubripes, and their hybrid F1 generation
图2退火温度分别为 48℃（a）、50℃（b）和 56℃（c）的扩增曲线
Fig.2Amplification curves at annealing temperature of 48℃ (a) , 50℃ (b) , and 56℃ (c)
图3暗纹东方鲀（a）、红鳍东方鲀（b）及其杂交 F1 代（c）样品的荧光 PCR 扩增曲线
Fig.3Fluorescence PCR amplification curves of T. obscurus (a) , T. rubripes (b) , and their hybrid F1 generation (c)
图491 份样品的 ΔCt 值分布
Fig.4Distribution of ΔCt values in 91 samples
表1样品信息
Tab.1Sources of sample information
表2引物和探针序列
Tab.2Primer and probe sequences
表3退火温度为 48℃、50℃和 56℃时的 Ct 值
Tab.3Ct values at annealing temperature of 48℃, 50℃, and 56℃
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