摘要
夏季极端高温频发，对我国特有的经济虾类脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)养殖业造成严重影响。热休克转录因子 1 (heat shock transcription factor 1, HSF-1)是调控热休克反应的关键因子，但其在脊尾白虾中的功能尚不明确。为了探究 Echsf-1 在脊尾白虾高温胁迫中的功能，本研究利用生物信息学、qPCR、RNAi 和转录组测序等方法，解析了 Echsf-1 在脊尾白虾高温胁迫中的表达及功能。结果显示，Echsf-1 编码 668 个氨基酸，与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氨基酸序列相似性最高。Echsf-1 基因在脊尾白虾的鳃、胃、肝胰腺、肌肉及眼柄等组织中均有表达，其中，肝胰腺和鳃组织中的表达量在高温胁迫 48 h 后达到峰值，72 h 后开始下降。敲降 Echsf-1 后，高温干扰组脊尾白虾的存活率显著降低，肝胰腺和鳃组织损伤加剧。转录组分析发现，与高温组相比，高温干扰组脊尾白虾在糖胺聚糖降解、淀粉和蔗糖代谢等通路中显著富集。其中，与硫酸乙酰肝素分解相关基因(如 gusb、hspe 和 naglu)表达普遍上调，磷酸葡萄糖变位酶 2 基因(pgm2)表达下调。这些基因的表达变化可能影响组织修复和 DNA 损伤修复过程，进而加重组织损伤。本研究揭示了 Echsf-1 在脊尾白虾高温应激中的重要作用，为耐高温品种的选育提供了基础数据和理论支撑。
Abstract
Exopalaemon carinicauda, a shrimp Litopenaeus vannamei species endemic to China, holds significant economic value due to its desirable meat quality, high protein content, and low fat levels, making it a popular choice among consumers. Its rapid growth, adaptability, and short cultivation cycle further enhance its appeal in aquaculture. However, industrial expansion and rising greenhouse gas emissions have intensified ocean heatwaves, posing a critical challenge to crustacean farming. Temperature fluctuations profoundly affect crustacean physiology, with prolonged high-temperature exposure causing tissue damage, mortality, and economic losses. While prior studies on E. carinicauda have examined the impacts of temperature on growth and embryonic development, the mechanisms underlying its thermal tolerance remain poorly understood. It is vital for developing heat-resilient strains to sustain aquaculture productivity. Heat shock transcription factor 1 (HSF-1) is a key factor in the regulation of the heat shock response, which protects the body from heat stress injury by up-regulating the expression of heat shock proteins and reducing the accumulation of misfolded proteins. Although it has been found that hsf-1 plays an important role in the heat shock response of many species, its role in the heat shock response of E. carinicauda has not beenfully studied, and further research is needed to determine whether it has the same function. Therefore, this study was conducted to understand the function of Echsf-1 in high-temperature stress in E. carinicauda. E. carinicauda was subjected to temperatures of 33℃, a stress threshold identified in preliminary trials. Bioinformatics tools were used to analyze the Echsf-1 gene sequence, and qPCR quantified its expression across healthy tissues (gill, stomach, hepatopancreas, muscle, and eye stalk). Hepatopancreas and gill tissues were further evaluated under heat stress. To assess the functional role of Echsf-1, RNA interference (RNAi) was employed via dsRNA injection (4 μg/g), with four groups: normal temperature (NT), normal temperature dsRNA (NTD), high temperature (HT), and high temperature dsRNA (HTD). Each group included 7 replicates (5 for sampling, 2 for survival analysis). Tissues collected at 24 h and 72 h were fixed for histological examination, while hepatopancreas transcriptomes (72 h) were sequenced. Survival rates were monitored at 24-h intervals. The results showed that the amino acid sequence of Echsf-1 is closely related to that of Litopenaeus vannamei, and Echsf-1 was expressed in several tissues of healthy E. carinicauda, with gill tissues showing the highest level of expression, followed by the stomach and hepatopancreas, suggesting that this transcription factor plays a role in the regulation of genes in a variety of tissues. Under high-temperature stress, Echsf-1 expression levels in hepatopancreas and gills peaked at 48 h, and then declined by 72 h. The timing of significant hsf-1 expression was differentiated from that in other species, and species-specificity of the gene was speculated. In RNAi experiments, the E. carinicauda in the high temperature dsRNA group exhibited significantly reduced survival and exacerbated tissue damage. These results suggest that Echsf-1 is involved in high-temperature stress and improves survival as well as reduces tissue damage under high-temperature stress. Transcriptome analysis showed 1,240 differentially expressed genes (DEGs) in the HT vs NT comparison, with 751 up-regulated and 489 down-regulated. In the HTD vs NTD comparison, there were 482 DEGs, of which 358 were up-regulated and 124 were down-regulated. KEGG enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in immune- and metabolism-related pathways such as antigen processing and presentation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, glycosaminoglycan degradation and sphingolipid metabolism. In the HT vs NT comparison, hsp70 expression was found to be down-regulated and bip expression was up-regulated in the antigen processing and presentation pathway. HSP70 facilitates the correct folding of misfolded proteins, and its down-regulation leads to the accumulation of misfolded proteins; Bip, an endoplasmic reticulum (ER) molecular chaperone, was up-regulated, potentially causing over-activation of the unfolded protein response (UPR), which indicates increased ER stress and subsequent cell death and tissue damage. Genes associated with heparan sulfate (HS) catabolism in the glycosaminoglycan degradation pathway (e.g., gusb, hspe, and naglu) were generally up-regulated in the HTD vs NTD comparison, which may allow for the excessive catabolism of HS, resulting in the impaired function of tissue repair. HS plays a critical role in extracellular matrix organization, cell adhesion, tissue development, and repair, and the insufficiency of HS leads to the inability of tissue damage to be effectively repaired, causing death of the organism. In addition, analysis of the HT vs NT and HTD vs NTD comparator revealed that phosphoglucose mutase 2 (PGM2) showed opposite expression patterns in these two comparator groups. PGM2 promotes substance reuse, DNA replication, and DNA damage repair. In the HTD vs NTD comparison, the down-regulation of PGM2 was produced by the knockdown of Echsf-1. The down-regulation of PGM2 leads to an increase in energy expenditure in the organism, and DNA damage could not be repaired in a timely manner, which ultimately led to tissue damage and death of the individuals. This study demonstrates the critical role of Echsf-1 in enhancing thermotolerance by regulating stress-response pathways, reducing protein misfolding, and supporting tissue repair in E. carinicauda. These findings provide a foundation for selective breeding of heat-resistant crustaceans and advance our understanding of molecular adaptation to climate-driven thermal stress in aquaculture.
Keywords
脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）是我国特有的经济虾类，在东部沿海池塘混养模式中具有显著的养殖优势和发展潜力（徐凯等，2025; 秦桢等，2022）。然而，近年来频发的夏季极端高温显著降低了脊尾白虾的存活率（李丽君等，2015），给养殖业带来了严重的经济损失。已有研究表明，高温可以显著降低甲壳动物的存活率（Hoang et al，2020），并对鳃和肝胰腺造成明显的病理损伤（Wu et al，2025），同时抑制免疫功能的正常发挥（Madeira et al，2018; Wang et al，2006）。虽然已有研究探讨了温度对脊尾白虾生长性能和胚胎发育等方面的影响（Zhao et al，2024; 李志辉等，2019; 栗治国等，2013），但其分子层面的热激响应机制仍存在研究空白。因此，亟需深入探究其高温耐受机制，为后续脊尾白虾耐高温新品系的选育提供理论依据。
热休克转录因子 1（heat shock transcription factor 1，HSF-1）是热休克家族中进化保守的转录因子（Neueder et al，2014），能启动细胞保护性热休克反应（Kijima et al，2018; 孔祥辉等，2022; Reyes et al，2022）。研究表明， HSF-1 在菲律宾帘蛤（Ruditapes philippinarum）、小鼠（Mus musculus）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中参与热休克反应，维持细胞稳态并保护机体（Chen et al，2020; Servello et al，2020）。然而，Echsf-1 在脊尾白虾中的生物学功能尚未得到系统解析。在之前研究中，RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术已在脊尾白虾、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）和日本对虾（Penaeus japonicus）等甲壳动物功能研究中建立成熟的应用体系（李明栋等，2022; Li et al，2018; Sekimoto et al，2022），这为探究 Echsf-1 在脊尾白虾中的功能提供了可靠的技术支持。
本研究以脊尾白虾为实验对象，通过构建高温胁迫模型，系统分析了 Echsf-1 在健康组织及高温胁迫后肝胰腺、鳃组织中的表达变化，并通过敲降 Echsf-1 观察其对存活率和组织损伤的影响，以评估 Echsf-1 在高温胁迫中的功能。进一步结合肝胰腺转录组测序数据，深入挖掘高温胁迫下与 Echsf-1 协同调控的差异表达基因及通路，旨在揭示 Echsf-1 在脊尾白虾高温胁迫中的功能，为脊尾白虾耐高温品种选育提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用脊尾白虾来自日照海辰水产有限公司，平均体长为（5.4±0.4）cm，平均体重为（1.3±0.2）g。暂养期间，将虾置于砂滤处理的海水中适应 7 d，水温维持在（22.0±0.2）℃，盐度为 28.0±0.5。暂养期间持续充氧，每日定时投喂，并更换 1/3 水量。实验前 24 h 停止投喂。
1.2 实验方法
1.2.1 Echsf-1 基因生物信息学分析
Echsf-1 分子量、不稳定系数和等电点等理化性质由 ExPASy 中 Prot Param 分析，结构域通过 Inter Pro 搜索，信号肽由 SignaIP 预测。使用 Cell PLOC 进行亚细胞定位。利用 ExPASy 中 Prot Scale 推测蛋白质亲疏水性。采用 TMHMM 进行跨膜结构分析。通过 SOPMA 预测蛋白二级结构。最后通过 MEGA 11 软件构建 NeighborJoining 进化树（赵岩峰等，2025）。
1.2.2 dsRNA 体外合成
根据 Echsf-1 cDNA 序列设计含 T7 启动子序列（TAATACGACTCACTATA GGG）引物（序列见表1），按照 TR-102-T7 RNAi Transcription Kit（诺唯赞，南京）说明书合成 dsRNA，参照连春盎（2016）的方法，通过苯酚/氯仿方法纯化后放置于‒80℃冰箱保存，用于后续 RNAi 实验。
1.2.3 实验设计
高温胁迫实验分为对照组（22℃）和高温胁迫组（33℃），每组包含 3 个生物学重复，每个重复投放 20 尾虾，实验前，从对照组随机选取 4 尾脊尾白虾，采集眼柄、鳃、肝胰腺、肌肉和胃组织。高温胁迫期间，分别于 0、24、48、72 h 时随机采集 4 尾个体的肝胰腺和鳃组织，液氮速冻后置于‒80℃冰箱保存，用于后续 Echsf-1 表达变化模式分析。
RNAi 实验设置 4 组：常温组（NT）、常温干扰组（NTD）、高温组（HT）和高温干扰组（HTD），每组 7 个平行，每个平行 20 尾虾。干扰组按照 4 μg/g 体重剂量注射 dsRNA，用 PBS 调整至注射总量 10 μL，采用肌肉注射法将溶液注入第 4 腹足基部（李明栋等，2022），对照组注射 10 μL PBS。根据预实验结果，选择干扰效果最佳的 72 h 肝胰腺组织进行转录组测序分析。实验期间，记录高温组和高温干扰组在 0、24、 48、72 和 96 h 存活率，并分别于 24 h、72 h 采集肝胰腺和鳃组织，置于 4%多聚甲醛溶液中固定保存，用于后续组织病理学切片观察。
1.2.4 组织病理分析
组织病理切片制备参照之前方法进行（Fan et al，2022），将固定 24 h 肝胰腺和鳃组织放入酒精中进行梯度脱水，经二甲苯透明后石蜡包埋。使用包埋机制备切片，脱蜡后分别进行苏木精和伊红染色，最后用中性树脂封片。使用全景组织细胞扫描分析仪（3D Histeco，匈牙利）进行扫描和观察。
1.2.5 总 RNA 提取、文库构建及测序
肝胰腺组织总 RNA 提取采用 TRIzol 方法（诺唯赞，南京），利用 NanoDrop 1000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）和琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 浓度、纯度和完整性。质检合格 RNA 样品由美吉公司构建文库，并在 NovaSeqX Plus 平台上进行测序分析。
1.2.6 差异表达分析及差异基因富集分析
使用 DESeq 软件对差异表达基因（DEGs）进行标准化及差异表达基因检测，筛选阈值为 Padj<0.05 和|log2FC|>1（FC，fold change）。使用 Python scipy 软件对 DEGs 进行 KEGG 富集分析，以 Padj<0.05 作为显著富集阈值。
1.2.7 实时荧光定量 PCR
使用 Primer 5.0 软件设计引物（表1），以 18s 为内参基因，参照 ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 试剂盒（诺唯赞，南京）说明书，使用 QuantStudioTM 1 Plus 实时荧光定量 PCR 仪（赛默飞世尔仪器有限公司，上海）进行 qPCR，并通过 2‒ΔΔCt法（Livak et al，2001）计算基因相对表达量。
1.2.8 数据分析
使用 SPSS 20 软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），比较各组数据之间差异，P<0.05 表示具有显著性差异。使用 GraphPad Prism 9.5 软件绘图。热图聚类分析使用 R 语言中的 fastcluster 包，基于基因相对表达水平的 log2（ratios）值进行层次聚类。
表1实验所用引物
Tab.1The primers used for the experiments
2 结果
2.1 Echsf-1 基因序列分析
通过 ExPASy 在线分析工具预测，Echsf-1 编码 668 个氨基酸，其蛋白质分子量为 72.84 kDa，理论等电点（pI）为 5.27，不稳定系数为 53.70（>40），表明该蛋白为不稳定蛋白。结构域分析结果显示，Echsf-1 包含 1 个 HSF_DNA-BD 结构域和 1 个 HSF_DNA 绑定结构域，不含信号肽，亚细胞定位预测显示其位于细胞核中。总平均亲水性为‒0.456，TMHMM 预测表明 Echsf-1 无跨膜结构域。SOPMA 分析显示，其二级结构无规则卷曲占比 76.65%，α-螺旋占比 20.81%，延伸链占比 2.54%。使用软件 MEGA 11.0 构建的 Neighbor-Joining 进化树显示，脊尾白虾 Echsf-1 氨基酸序列与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）亲缘关系相近（图1）。
2.2 Echsf-1 基因在健康组织及遭受高温胁迫组织中表达模式分析
Echsf-1 基因在健康脊尾白虾不同组织中表达水平如图2A 所示：Echsf-1 基因在脊尾白虾眼柄、鳃、肝胰腺、胃和肌肉中均有表达，Echsf-1 在鳃和胃中表达水平最高，肝胰腺和肌肉次之。
高温胁迫后，Echsf-1 在肝胰腺中的表达量在 0 h、 24 h 时显著下降，在 24 h 达到最低点，随后在 48 h达到峰值，胁迫 72 h 后 Echsf-1 表达量有所下降但仍高于 0 h（图2B）；Echsf-1 在鳃组织中的表达量在 0 h 低于对照组，随后在 24 h 和 48 h 呈持续上升趋势，并在 48 h 达到峰值（图2C）。
图1脊尾白虾与其他物种的 HSF-1 蛋白系统进化树
Fig.1Phylogenetic tree of HSF-1 proteins in E. carinicauda and other species
图2Echsf-1 基因在健康组织及遭受高温胁迫组织中的表达模式
Fig.2Characterization of Echsf-1 gene expression distribution in healthy tissues and tissues subjected to high temperature stress
图 A 为 Echsf-1 在健康组织中的分布，以肝胰腺中表达水平为标准值 1.0； 图 B 和图 C 分别表示高温胁迫后 Echsf-1 在肝胰腺（B）和鳃（C）中的表达，以对照组为标准值 1.0。 E：眼柄；G：鳃；H：肝胰腺；S：胃；M：肌肉。不同字母表示具有显著差异（P<0.05）。
Fig.A represents the distribution of Echsf-1 in healthy tissues, expression in hepatopancreas as 1.0; Fig.B and C represent the expression of Echsf-1 gene in hepatopancreas (B) and gill (C) after high-temperature stress, expression of the control as 1.0. E: Eye stalk; G: Gill; H: Hepatopancreas; S: Stomach; M: Muscle. Different letters indicate significant difference (P<0.05) .
2.3 Echsf-1 敲降对脊尾白虾存活率影响
高温组与高温干扰组存活率如图3A 所示：高温胁迫 24 h 后，高温组和高温干扰组存活率分别为 90%和 73.3%；48 h 后，存活率分别降至 80%和 30%，此时两组之间的存活率具有显著差异。胁迫 96 h 时，高温组存活率显著高于高温干扰组，约为后者的 2.6 倍（P<0.05），上述结果表明，敲降 Echsf-1 显著降低了高温胁迫后脊尾白虾的存活率。
2.4 Echsf-1 敲降对组织损伤的影响
高温组和高温干扰组肝胰腺和鳃组织损伤结果显示：肝胰腺组织胁迫 24 h 后两组转运泡均增大，但高温干扰组基膜边界不清晰；72 h 后高温干扰组星形官腔消失，基膜破裂（图3B）。鳃组织胁迫 24 h 后，高温干扰组鳃丝出现弯曲；72 h 后，两组均表现出次级层片肥大，但高温干扰组还出现细胞排列异常紊乱，鳃丝出现解体现象（图3C）。以上结果表明，在相同胁迫条件下，高温干扰组组织损伤程度显著高于高温组，表明敲降 Echsf-1 加剧高温胁迫对脊尾白虾的组织损伤。
图3Echsf-1 基因干扰后的脊尾白虾存活率（A）及肝胰腺（B）和鳃（C）组织损伤影响
Fig.3Survival rate (A) and hepatopancreas (B) and gill (C) tissue damage in E. carinicauda after Echsf-1 gene disruption
B-1、B-3 为高温胁迫 24 h 肝胰腺 HE 染色切片显微结构；B-2、B-4 为高温胁迫 72 h 肝胰腺 HE 染色切片显微结构； B-1、B-2 注射 PBS；B-3、B-4 注射 dsRNA。C-1、C-3 为高温胁迫 24 h 鳃 HE 染色切片显微结构图； C-2、C-4 为高温胁迫 72 h 鳃 HE 染色切片显微结构图；C-1、C-2 注射 PBS；C-3、C-4 注射 dsRNA。 TV：转运泡；BM：基膜；L：管腔；GF：鳃丝；SL：次级层片；CM：细胞形态；CA：细胞排列。
B-1 and B-3 are microstructures of HE-stained sections of hepatopancreas tissues of the heat stress at 24 h; B-2 and B-4 are microstructures of HE-stained sections of hepatopancreas tissues of the heat stress at 72 h; B-1 and B-2: Injection of PBS; B-3 and B-4: Injection of dsRNA. C-1 and C-3 are microstructures of HE-stained sections of gill tissues of the heat stress at 24 h; C-2 and C-4 are microstructures of HE-stained sections of gill tissues of the heat stress at 72 h; C-1 and C-2: Injection of PBS; C-3 and C-4: Injection of dsRNA. TV: Transport vacuole; BM: Basement membrane; L: Lumen; GF: Gill filaments; SL: Secondary laminates; CM: Cell morphology; CA: Cells align.
2.5 差异表达转录本分析
2.5.1 差异表达基因（DEGs）分析
为探究高温胁迫下与 Echsf-1 相关基因和通路，本研究重点选取高温组和常温组、高温干扰组和常温干扰组两个比较组进行结果展示与分析。对样本组间的差异基因进行分析，与常温组相比，常温干扰组有 122 个基因表达上调和 125 个基因表达下调；高温组有 751 个基因表达上调和 489 个基因表达下调；高温干扰组有 741 个基因表达上调和 323 个基因表达下调。与高温干扰组相比，常温干扰组有 358 个基因表达上调和 124 个基因表达下调，高温组有 141 个基因表达上调和 110 个基因表达下调（图4）。
2.5.2 差异表达基因 KEGG 富集
利用 KEGG 对差异基因的通路进行富集分析，本研究挑选了最显著的 20 条通路条目在散点图中展示（图5）。结果显示，溶酶体、抗原加工和呈递、氨基糖和核苷酸糖代谢、吞噬体、细胞凋亡、半乳糖代谢、自噬–动物、碳水化合物的消化和吸收、鞘脂信号通路、鞘脂代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖胺聚糖降解通路在高温组和常温组、高温干扰组和常温干扰组两个比较组中均呈显著富集（图5）。高温组和常温组比较，酪氨酸代谢、糖酵解/糖异生、黑色素生成、甘油脂代谢、丙酮酸代谢、生物素代谢、果糖和甘露糖代谢、PPAR 信号通路显著富集（图5A）。高温干扰组和常温干扰组比较中，坏死性凋亡、其他聚糖降解、C 型凝集素受体信号通路、叶酸生物合成、NOD 样受体信号通路、鞘糖脂生物合成–神经节系列、胰腺分泌物和胞质 DNA 感应通路显著富集（图5B）。
图4表达差异基因分析
Fig.4Analysis of differentially expressed genes
A：差异表达基因柱状图；B：差异表达基因 Venn 图。 NT：常温组；NTD：常温干扰组；HT：高温组； HTD：高温干扰组。下同。
A: Histogram of DEGs; B: Venn diagram of DEGs. NT: Normal temperature group; NTD: Normal temperature dsRNA group; HT: High temperature group; HTD: High temperature dsRNA group. The same below.
2.5.3 基于 RNA-seq 差异表达基因聚类热图
基于差异表达基因的聚类热图结果显示，所有样本可明显分为两大簇（图6），分别对应于对照组（常温组、常温干扰组）和实验组（高温组、高温干扰组），表明两组样本间存在显著的转录组差异。差异表达基因主要呈现两种表达趋势：在实验组中显著上调的基因群，比如与硫酸乙酰肝素降解相关的基因 gusb、hspe 和 naglu；在实验组中显著下调的基因群，比如与应激相关基因 hsp70、pld、tubb。值得注意的是，部分关键基因（如 pgm2）在高温组和常温组比较中上调，而在高温干扰组和常温干扰组比较中下调，提示该基因可能与高温和 Echsf-1 相关，在高温胁迫中发挥重要作用。
2.5.4 qPCR 验证
随机选取部分差异表达基因，通过 qPCR 对组织样品进行定量分析，来验证转录组数据的可靠性。结果显示，尽管 qPCR 结果与 RNA-seq 在差异倍数上存在差异，但基因表达上下调趋势一致（图7），说明基于转录组数据获得的转录本定量结果可信度较高。
3 讨论
温度是影响水生动物生长、发育和繁殖的关键因素之一（Burel et al，1996），对脊尾白虾等甲壳动物养殖尤为重要。本研究为探究 Echsf-1 在脊尾白虾高温胁迫中的功能，首先对 Echsf-1 基因序列进行生物信息学分析，其次使用实时荧光定量 PCR 技术分析 Echsf-1 在健康脊尾白虾不同组织中表达模式，并进一步探究高温胁迫下肝胰腺和鳃组织中 Echsf-1 的表达变化。通过 RNAi 技术敲降 Echsf-1，观察高温胁迫下脊尾白虾存活率和组织损伤情况，并对 72 h 肝胰腺组织进行转录组测序，筛选与高温和 Echsf-1 相关通路和基因。
生物信息学分析表明，Echsf-1 氨基酸序列与凡纳滨对虾具有同源性。鉴于 Lvhsf-1 在凡纳滨对虾应对高温和缺氧等非生物胁迫中具有关键作用（González-Ruiz et al，2023），且 Echsf-1 与 Lvhsf-1 序列相似，推测 Echsf-1 可能在高温胁迫中对机体具有保护作用。组织分布结果表明，Echsf-1 在脊尾白虾鳃、胃、肝胰腺、肌肉和眼柄中普遍表达，表明该基因在多种组织基因调控中发挥作用。这一结果与凡纳滨对虾和斑节对虾中 hsf-1 多组织表达模式一致（Sornchuer et al，2018; Yan et al，2014）。在高温胁迫下，脊尾白虾肝胰腺和鳃组织中 Echsf-1 mRNA 表达水平在 48 h 显著上升，这与大型溞（Daphnia magna） 和大鼠（Rattus norvegicus）中 hsf-1 表达水平分别在 6 h 和 8 h 显著上调结果相似（Buriro et al，2013; Klumpen et al，2017），时间差异反映了物种间特异性。为探究 Echsf-1 在脊尾白虾高温胁迫中功能，运用 RNAi 技术敲降 Echsf-1，发现高温干扰组脊尾白虾在高温胁迫下存活率显著降低，且组织损伤加剧，证实 Echsf-1 在高温胁迫中具有重要功能。在虎斑猛水蚤（Tigriopus californicus）和秀丽隐杆线虫的研究中发现，hsf-1 减轻热应激对机体的损伤（Harada et al，2020; Furuhashi et al，2015）。这些研究共同表明 hsf-1 在生物体应对高温胁迫中具有重要作用。
图5差异表达基因的 KEGG 富集分析（富集排名前 20）
Fig.5KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (top 20)
A：高温组 vs 常温组；B：高温干扰组 vs 常温干扰组。
A: High temperature group vs Normal temperature group; B: High temperature dsRNA group vs Normal temperature dsRNA group.
图6差异表达基因热图
Fig.6Heat map of differentially expressed genes
图7候选基因 qPCR 验证
Fig.7qPCR validation of candidate transcripts
在 RNAi 后转录组分析显示，高温组和常温组、高温干扰组和常温干扰组两个比较中，脊尾白虾肝胰腺组织差异表达基因主要富集于抗原加工和呈递、糖胺聚糖降解、氨基糖和核苷酸糖代谢以及鞘脂代谢等免疫和代谢相关通路。在高温组和常温组比较中，抗原加工和呈递通路显著富集，其中热休克蛋白 70（HSP70）表达量下调，而重链结合蛋白（BIP）表达量上调，这可能加剧机体损伤。HSP70 是热休克蛋白家族重要成员，通过协调错误折叠蛋白重新折叠，减轻热应激对机体的负面影响。研究表明，HSP70 能够提高凡纳滨对虾在热应激下存活率并减少损伤（Sung et al，2018），同时在大菱鲆（Scophthalmus maximus）中也发现其参与抗热休克损伤过程（Zheng et al，2023）。然而，本研究中 hsp70 表达量下调，表明 HSP70 可能无法有效修复错误折叠蛋白质，导致错误折叠蛋白积累，进而对机体造成损害。重链结合蛋白（BIP）是内质网（ER）中含量最丰富的分子伴侣（Amankwah et al，2022）。ER 在受到刺激后会激活内质网应激（ERS），导致错误折叠或未折叠蛋白质在内质网腔内聚集（Wang et al，2024）。 BIP 能够激活未折叠蛋白质反应（UPR）（Motaung et al，2025），而这一反应的激活会导致两种截然不同的结果：短期 ERS 增强细胞内质网应激能力，恢复内质网稳态；严重的 ERS 则可能导致细胞死亡和机体损伤（Hu et al，2018; Zhang et al，2022）。本研究中，bip 在 72 h 表达上调可能表示严重的 ERS，从而导致细胞死亡和组织损伤。综上所述，高温胁迫下 hsp70 下调和 bip 上调导致错误折叠蛋白累积，且无法得到有效修复，最终引发细胞死亡和组织损伤。
在高温干扰组和常温干扰组比较中，糖胺聚糖降解通路显著富集，其中与硫酸乙酰肝素（HS）分解相关基因（如 gusb、hspe 和 naglu）普遍上调，促进 HS 分解。HS 是一种广泛存在于动物细胞中的线性多糖（Moon et al，2021），通过与核心蛋白结合形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）（Romanovsky et al，2025），在细胞外基质（ECM）组织、细胞粘附、迁移以及信号转导中发挥重要作用（Bernfield et al，1992; Wight et al，1992）。此外，HS 蛋白质结合特性使其能够作为共受体参与多种信号转导事件，并在组织发育和修复中发挥关键作用（Bernfield et al，1999; Ravikumar et al，2020）。本研究中 HS 分解相关基因上调可能导致 HS 过度降解，从而削弱 HSPG 功能，影响组织修复能力，加重组织损伤，最终导致个体死亡。这一发现与高温干扰组中更严重的组织损伤和更低的存活率结果一致。
热应激显著影响脊尾白虾代谢特性，这一发现与斑节对虾热应激转录组结果一致，相关代谢酶表达量显著增加（Zheng et al，2019）。在本研究中，高温组和常温组、高温干扰组和常温干扰组两个比较中发现， N-乙酰基葡萄糖 6-磷酸脱乙酰基酶（naga）和 UDP-N乙酰己糖胺焦磷酸化酶（uap）基因仅在高温组和常温组比较中上调。naga 和 uap 表达上调可促进 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和 N-乙酰基-D-葡糖胺磷酸（GlcNAc-6P）分解。研究表明，GlcNAc 存在抑制机体生长速率（Komatsuzawa et al，2004; Yadav et al，2011），而 GlcNAc-6P 积累对大肠杆菌（Escherichia coli）具有毒性（White，1968）。然而，在高温干扰组和常温干扰组比较中 naga 和 uap 表达未发生变化，表明 Echsf-1 敲降抑制这 2 个基因表达，导致 GlcNAc 和 GlcNAc-6P 在机体内堆积，进而影响生长并对机体造成伤害。磷酸葡萄糖变位酶 2（PGM2）是磷酸戊糖途径（PPP）关键组成部分。PPP 与糖酵解通路平行运行，产生的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）、戊糖和核糖-5-磷酸（R-5-P）是核苷酸合成的重要前体，支持 DNA 复制和 DNA 损伤修复（Lyu et al，2024）。此外，PGM2 主要作用是催化核糖-1-磷酸和脱氧核糖-1-磷酸转化为相应的 5-磷酸肽，促进核苷酸的循环利用（Maliekal et al，2007）。PGM2 活性有助于产物降解，使其再利用，从而减少物质消耗。然而，在高温干扰组和常温干扰组比较中，由于敲降 Echsf-1 导致 pgm2 表达下调使物质无法有效重复利用，影响 DNA 复制和损伤修复，导致机体死亡。
4 结论
本研究发现，在高温胁迫下，Echsf-1 在肝胰腺和鳃组织中的表达具有显著变化，通过敲降 Echsf-1 发现，高温胁迫加重脊尾白虾的组织损伤、降低存活率，说明 Echsf-1 在脊尾白虾应对高温胁迫时发挥重要作用。转录组数据显示，pgm2 在两个比较组中具有相反的表达模式，猜测其不仅与高温胁迫相关，还与 Echsf-1 相关。本研究为进一步选育耐高温脊尾白虾提供了理论依据。
