摘要
半胱氨酸蛋白酶家族(CASPASEs)由 N 端结构域以及大、小催化亚基共同组成，可在特定的天冬氨酸残基上水解底物，从而在病原感染和环境胁迫等诱导的多种程序性细胞死亡中发挥功能。为深入探究高密度养殖水体中氨氮积累背景下，CASPASEs 调控大口黑鲈(Micropterus salmoides)程序性细胞死亡的作用机制，本研究针对大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的序列进行分析，筛选合适的表达区段设计引物后 PCR 扩增获得目的片段，随后以 pET-32a 为载体构建原核重组质粒，将其转化到大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，分别以 1.0 mmol/L 和 0.6 mmol/L 的 IPTG 于 16 ℃过夜诱导表达重组蛋白；通过 Ni-NTA Beads 6FF 重力柱对获得的上清液蛋白进行纯化，并以 SDS-PAGE 分析获得 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 重组蛋白，从而确认重组蛋白表达和纯化成功。之后，将纯化的 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白分别与弗氏佐剂乳化后各免疫 1 只日本大耳兔和 3 只 Balb/C 小鼠制备多克隆抗体，通过酶联免疫法和蛋白印迹法检测效价和特异性。结果表明，免疫后获得的抗血清均能特异性识别大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白和内源性蛋白，有单一且与预期分子量大小一致的目的条带；同时，CASPASE-1 和 CASPASE-3 的兔源/鼠源抗血清效价均分别为 1∶1.024×107 /1∶1.024×106 和 1∶1.024×107 /1∶1.024×103 。随后，使用氨氮对大口黑鲈进行胁迫，通过组织病理学检测可发现其肾脏组织出现明显病变，表现为肾小体细胞增生、肾小囊腔扩大，远曲小管和近曲小管上皮细胞肿胀和细胞死亡。以本研究制备的 CASPASE-1 和 CASPASE-3 多克隆抗体进行蛋白质印迹实验，检测到肾脏中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白的表达水平显著增加，这 2 个蛋白可能介导了后续的程序性细胞死亡，这与组织病理学的结果一致。本研究成功制备了可特异性识别大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的兔源和鼠源多克隆抗体，并探究了水体氨氮胁迫对其表达的影响，为深入研究氨氮胁迫下大口黑鲈的程序性细胞死亡机制提供了重要的基础。
Abstract
CASPASEs are a class of highly conserved cysteine-dependent endoproteases, whose member is composed of an N-terminus domain and large and small catalytic subunits. CASPASEs can hydrolyze substrates at specific aspartic acid residues, thereby playing a role in programmed cell death induced by pathogenic infections and environmental stress. Studies in mammals have shown that CASPASE-3/6/7/8/9/10 are mainly involved in cell apoptosis, while CASPASE-1/4/5/11/12 is associated with inflammatory responses. The activated CASPASE-1 can cleave GASDERMIN D (GSDMD), thereby promoting the formation of cell membrane pores and cell lysis, and initiating cell pyroptosis. Several reports have reported on the role of CASPASE-3 and CASPASE-1 in apoptosis, pyroptosis, and inflammatory response in fish, but it is not possible to conduct research at the protein level to reveal the relevant regulatory mechanisms due to the lack of specific antibodies. Under high-density aquaculture conditions, accumulated ammonia in water can lead to tissue damage and cell death in fish. Largemouth bass (Micropterus salmoides) is a representative species in intensive aquaculture models. In order to further explore the regulatory mechanism of CASPASEs in ammonia-induced programmed cell death in largemouth bass, this study analyzed the antigenic epitopes, hydrophilicity, and structural domains of CASPASE-1 and CASPASE-3 in largemouth bass. Their 0–200aa and 0–150aa regions were selected as the target expression fragments, respectively, and pET-32a-MsCASPASE-1 and pET-32a-MsCASPASE-3 prokaryotic recombinant plasmids were constructed by PCR amplification, double enzyme digestion, and ligation. Sequencing results showed that the constructed recombinant plasmids contained the target gene fragments. Subsequently, the two successfully constructed recombinant plasmids were transformed into BL21 (DE3) competent cells and induced for expression under optimal conditions (1.0 mmol/L and 0.6 mmol/L IPTG induced overnight at 16 ℃). The expressed soluble supernatant proteins were purified by affinity chromatography using a Ni-NTA Beams 6FF gravity column, and single bands with protein molecular weights of approximately 46 kDa and 36 kDa were identified by SDS-PAGE, demonstrating the successful acquisition of recombinant MsCASPASE-1 and MsCASPASE-3 proteins. Afterwards, the purified recombinant MsCASPASE-1 and MsCASPASE-3 proteins were introduced into one Japanese large eared rabbit and three Balb/C mice, respectively, to obtain anti-sera. The titers and specificity of antibodies were detected by enzyme-linked immunosorbent assay and western blotting. Results showed that the anti-sera obtained after immunization could specifically recognize the recombinant proteins CASPASE-1 and CASPASE-3 and endogenous proteins of largemouth bass, with a single target band that was consistent with the expected molecular weight, with molecular weights of 46 kDa/44 kDa and 36 kDa/31 kDa, respectively. At the same time,the rabbit/mouse serum titers of CASPASE-1 and CASPASE-3 were 1:10,240 K/1:1,024 K and 1:10,240 K/1:1,024 K, respectively. These results suggest that the present study has successfully prepared the antibodies against CASPASE-1 and CASPASE-3 proteins in largemouth bass, which exhibits good specificity and high titers, and is available for subsequent analysis. Thus, an ammonia-stress experiment was subsequently conducted in largemouth bass to detect the regulatory roles of CASPASE-1 and CASPASE-3. The kidney is the urinary organ in fish including largemouth bass, and is composed of renal corpuscles and tubules. The renal corpuscle, which functions as the filtering unit of the kidney, is mainly composed of a small group of capillaries that form the glomerulus and is responsible for filtering waste and excess fluid from the blood into the renal small sac cavity to become primary urine. The renal tubules include structures such as distal tubules and proximal tubules. The surface of the proximal tubules is covered with wrinkled microvilli, which can reabsorb nutrients and water from the filtered fluid. The inner wall of the distal tubules has no microvilli, and the lumen inside the tubules is larger, which secretes and reabsorbs different ions to further adjust urine and make it suitable for excretion from the body. In the present study, histopathological results revealed significant pathological changes in the kidney of largemouth bass. After being exposed to ammonia stress, the renal corpuscle cells proliferated, and the renal capsule cavity expanded in the kidney of largemouth bass, and structural changes significantly affected the filtration function of glomeruli. On the other hand, under ammonia stress, the epithelial cell structure of the distal tubules of the kidney was gradually destroyed, and the intercellular space gradually increased. The epithelial cells of the proximal tubules expanded and dissociated, with the cell structure also disrupted. These changes indicate that ammonia stress changed the kidney structure, thus affecting its secretion function and its ability to reabsorb nutrients and water in the filtrate. Using the polyclonal antibodies against CASPASE-1 and CASPASE-3 prepared in this study, western blotting experiments detected significantly increased protein levels of CASPASE-1 and CASPASE-3 in the kidneys of largemouth bass after ammonia stress. Increased CASPASE-1 and CASPASE-3 in kidney is responsible for the subsequent programmed cell death, consistent with histopathological results. Therefore, this study successfully prepared rabbit- and mouse-derived polyclonal antibodies that can specifically recognize CASPASE-1 and CASPASE-3 in largemouth bass, and revealed the effect of ammonia stress on their expression, providing an important basis for further research on the programmed cell death mechanism of largemouth bass under environmental stress.
Keywords
半胱氨酸蛋白酶（CASPASEs）是一类内源性蛋白酶，它们高度保守，并且依赖半胱氨酸残基来发挥催化作用。可靶向水解底物中的天冬氨酸残基（Lamkanfi et al，2002），在细胞程序性死亡和炎症中发挥功能。 CASPASEs 通常由不同大小的 N 端前导结构域及 2 个分子量为 20 kDa 和 10 kDa 的大、小催化亚基共同形成，其中 CASPASE-1/4/5/11/12 主要参与炎症反应，而 CASPASE-3/6/7/8/9/10 与凋亡相关。凋亡型 CASPASEs 又包括凋亡启动蛋白酶（CASPASE-8/9/10）和凋亡执行蛋白酶（CASPASE-3/6/7），分别参与了外源性和内源性凋亡（Ramirez et al，2018; Brentnall et al，2013）。CASPASE-1/4/5/11/12 等与凋亡无关，而是参与了细胞因子成熟和炎症反应，其中 CASPASE-1 最早被鉴定为白细胞介素-1β 转化酶（ICE），主要负责人类单核细胞中促炎细胞因子 IL-1β 蛋白水解成熟（Lamkanfi et al，2014），后续研究发现 CASPASE-1 也可驱动 IL-18 成熟和分泌。在 CASPASE-1 的 N 端也存在 CARD 结构域，上游蛋白通过 CARD 与 CARD 的相互作用募集 CASPASE-1 共同形成炎性小体复合物，进而激活 CASPASE-1。激活后的 CASPASE-1 可切割焦孔素 D（gasdermin D，GSDMD），从而促进细胞膜孔的形成和细胞裂解，并起始了细胞焦亡（de Vasconcelos et al，2019）。在哺乳动物上的研究陆续表明，CASPASE-1/4/5 均在细胞焦亡的调节中发挥重要作用（Shi et al，2015），并且凋亡性和炎症性的半胱天冬酶都会导致细胞死亡，并可以指导从免疫调节到细胞命运规范的多种细胞功能（Fujita et al，2008; Kang et al，2008; Bruey et al，2007）。在鱼类中也有 CASPASE-3 和 CASPASE-1 在细胞凋亡、细胞焦亡与炎症反应中的功能报道，其中大量研究阐明了 CASPASE-3 与 CASPASE-8、CASPASE-9 等在鱼类细胞凋亡中的功能及其调控机制（Yamashita et al，2008; Anvarifar et al，2017; Krumschnabel et al，2009）。鱼类中细胞焦亡相关研究尚少，现有研究表明鱼类中 NOD 样受体蛋白结构域相关蛋白 1/3（NLRP1/3）被激活后，通过接头蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）募集 CASPASE-1 进而组装成经典 NLRP3 炎症小体，而 CASPASE-1 是鱼类细胞焦亡中发挥功能的炎性半胱氨酸蛋白酶（Sakamaki et al，2009），可进一步触发细胞焦亡和促炎细胞因子的分泌（Liu et al，2021）；而斑马鱼（Danio rerio）中 NLRP3 可通过 ASC 依赖方式结合 CASPASE-a（caspy），或通过 ASC 非依赖形式直接结合 CASPASE-b（caspy2）激活下游通路（Li et al，2020）。近年研究也发现 CASPASEs 家族蛋白在细胞凋亡和细胞焦亡中功能并不完全确定，如 CASPASE-3 可裂解半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）GSDME 执行细胞焦亡功能（Jiang et al，2019），CASPASE-8 也在炎症和免疫中发挥非凋亡作用（Kang et al，2008）；而 CASPASE-1 既可剪切某些细胞因子前体以调控炎症反应，也可剪切其凋亡底物 Bcl-XL 调节细胞凋亡（Bruey et al，2007），故在细胞凋亡和细胞焦亡中都扮演着关键角色。因此，阐明 CASPASE-1 与 CASPASE-3 的功能具有十分重要的意义。
大口黑鲈（Micropterus salmoides）是一种重要的名特优淡水养殖品种，生长迅速、肉质鲜美，当前我国养殖产量已超 80 万 t，然而其养殖业的高质量发展受到环境胁迫、病原感染等因素制约（王志雯，2023; Zhao et al，2020; 逯冠政等，2022）。前期研究表明，大口黑鲈鳃组织在细菌感染后出现明显病变，伴随着 caspase-1 与 caspase-3 的 mRNA 表达水平显著升高，并且受到饲料中蛋白来源的影响（Wang et al，2022）。类似地，其肝脏结构也受到水体氨氮胁迫的显著影响，呈现出明显的炎症反应、相关 mRNA 表达水平显著升高，亟待以特异性的抗体开展蛋白印迹分析以从蛋白质水平上揭示相关调控机制（Zou et al，2023）。因此，本研究利用分子克隆、原核表达重组质粒构建和免疫动物后血清纯化等步骤，制备针对大口黑鲈 CASPASE-1 与 CASPASE-3 蛋白的兔源和鼠源多克隆抗体，在此基础上，研究水体氨氮胁迫对大口黑鲈肾脏组织结构以及 CASPASE-1 与 CASPASE-3 蛋白表达水平的影响，研究结果有利于揭示大口黑鲈 CASPASE-1 与 CASPASE-3 在调控程序性细胞死亡应对氨氮胁迫中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验材料：大口黑鲈购自湖北宜昌的一家养殖场，随后暂养于华中农业大学水产教学实习基地的养殖系统中，暂养 2 周后挑选健康、无明显病征的鱼，分成两组用于后续实验，鱼的平均体长为（15.0±1.6）cm，体重为（33.1±1.9）g。对照组的大口黑鲈在养殖系统中正常养殖，而胁迫实验组参考前期研究的方法（Zou et al，2023），以氯化铵制备母液后取适量加入大口黑鲈的养殖水体以实现（13.0±0.5）mg/L 的总氨氮水平，每天采用希玛氨氮亚硝酸盐检测仪（AR8407）对水体氨氮水平进行检测和调整；在相同时间对对照组和氨氮胁迫组的大口黑鲈的肾脏组织进行采样，分别使用多聚甲醛固定和液氮速冻后存于–80℃冰箱中用于后续分析。
实验试剂：pET-32a 原核表达质粒购自武汉淼灵生物公司，大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞 DH5α 与 BL21（DE3）购自上海昂羽生物科技公司。高保真扩增酶与逆转录酶购自诺维赞生物公司，实时荧光定量 PCR 试剂购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，Trizol 试剂购自金沙生物公司，胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒购自天根生物试剂公司，限制性内切酶与 T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司，Ni-NTA Beads 6FF 重力柱 5 mL 购自天地人和生物公司。
1.2 仪器与设备
仪器设备：包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、石蜡切片机（ThermoFisher）、蛋白凝胶电泳仪（Bio-Rad）、蛋白凝胶成像仪（Bio-Rad）、摇床（天津欧诺）、超声波破碎仪（宁波新芝）、PCR 仪（Eppendorf）、离心机（Eppendorf）、琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一）、核酸凝胶成像仪（Bio-Rad）、冷冻浓缩离心干燥器（太仓市华美生化仪器厂）、台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）和台式高速冷冻离心机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 蛋白结构分析与抗原预测
在 NCBI（https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站下载大口黑鲈 CASPASE-1（NCBI Reference Sequence: XM_ 038694365.1）和 CASPASE-3（NCBI Reference Sequence: XM_038713063.1）的氨基酸序列信息并进行生物信息学分析，随后大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白的免疫原性分别采用 BepiPred 3.0（https: //services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-3.0/）分析，而大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白的亲/疏水性则采用 ExPASy（https: //web.expasy.org/ protscale/）分析。
1.3.2 基因扩增及原核载体构建
参考王俊丽等（2017）的方法，克隆大口黑鲈 caspase-1 与 caspase-3 基因并构建相应的原核表达重组质粒。首先通过 TRIzol法提取对照组健康大口黑鲈肾脏组织总 RNA，并使用超微量分光光度计测定 RNA 样品浓度和质量，根据逆转录试剂使用说明，以总 RNA 为模板逆转录为 cDNA 模版。本研究选择的原核表达载体为 pET-32a，并使用 Primer 5.0 设计带有 EcoRⅠ和 Xho Ⅰ酶切位点的特异性引物，交由奥科鼎盛测序公司合成，引物信息见表1。
表1PCR 扩增引物
Tab.1PCR amplification primers
1.3.3 原核表达诱导与纯化
参考王俊丽等（2017） 的方法，诱导表达大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白。将上述成功构建的 pET-32a-Ms-CASPASE-1 和 pET-32a-Ms-CASPASE-3 重组质粒分别转化至 BL21（DE3）感受态细胞中，分别挑取单菌落在 5 mL 的 LB 液体培养基中扩大培养，37℃恒温摇菌箱过夜培养，之后按 1∶100 的比例将 2 mL 菌液加入到 200 mL 液体 LB 培养基中，37℃摇床培养至菌液的 OD600 nm 值为 0.6~0.8，加入不同浓度梯度的 IPTG，16℃、120 r/min 的恒温摇菌箱过夜诱导表达大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白，最终选择终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导浓度。随后诱导的 BL21（DE3）菌体以超声波破碎仪进行破碎，12 000 r/min 离心 10 min 后收集上清液和沉淀。将上清液利用 0.45 μm 滤膜过滤后加入已用 10 mmol/L 咪唑平衡后的 Ni-NTA Beads 6FF 重力柱， 4℃摇床孵育 30 min 后旋开按钮使液体流净，倒入含 50 mmol/L 咪唑的 Wash buffer 清洗杂蛋白，最后加入含 250 mmol/L 咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，同时利用考马斯亮蓝 G-250 是否变蓝检测流出液中是否出现蛋白，以获得纯化的 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 重组蛋白。
1.3.4 兔源和鼠源多克隆抗体的制备
参考陈曦（2023）的方法，针对大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白进行多克隆抗体的制备，分别选择日本大耳兔和 3 只 Balb/C 小鼠作为免疫动物，首次免疫时分别以 400 μg 和 100 μg 的纯化重组蛋白与弗氏完全佐剂（1∶1）混匀乳化后对每只免疫动物进行皮下注射；随后每隔 2 周分别以 150 μg 和 50 μg 的纯化重组蛋白与弗氏不完全佐剂（1∶1）混匀后进行加强免疫 3 次，通过耳后缘或眼眶采血的方式获得抗血清后，通过 Sepharose4B 亲和纯化柱完成抗血清的纯化。
1.3.5 兔源和鼠源多克隆抗体的效价检测
采用间接 ELISA 法测定抗血清的效价，首先将 MsCASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 蛋白使用碳酸盐包被液包被酶标板，随后以梯度稀释的兔源和鼠源抗血清为一抗，以 HRP 标记的羊抗兔（或鼠）IgG 为二抗，经四甲基苯胺（TMB）溶液显色后用酶标仪测定 OD450 nm 值，并以兔（或鼠）免疫前的血清为阴性对照，每个样本重复 3 次，结果取平均值。以检测孔与阴性对照孔 OD450 nm 的比值≥2.1 时的最大稀释度判定为该抗血清的效价。
1.3.6 兔源和鼠源多克隆抗体的特异性检测
将表达重组 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 蛋白的 BL21（DE3）菌株和健康大口黑鲈肾脏组织分别以 RIPA 中性裂解液进行裂解获得蛋白上清液后，加入 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，以 95℃金属浴加热 5 min 并离心后取上清液样品进行 western blotting 检测。上述样品首先经过 90 V/2 h 的 SDS-PAGE 电泳，随后将分离开的蛋白通过半干转方式转至 PVDF 膜上，并以 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h；随后加入一抗[1∶1 000 稀释的兔源（或鼠源）多克隆抗体]于 4℃过夜孵育， PBST 清洗 4 次，每次 5 min；再加入 1∶10 000 稀释的 HRP 标记的山羊抗兔（或鼠）IgG 作为二抗，室温孵育 2 h，PBST 清洗 4 次，每次 5 min；最后采用化学发光法（ECL）显色并拍照。
1.3.7 大口黑鲈肾脏组织病理学切片制作及分析
将对照组和氨氮胁迫组的大口黑鲈肾脏组织以多聚甲醛固定后，以不同浓度的无水乙醇进行梯度渐进式脱水，采用二甲苯透明处理，以温度为 60℃的石蜡进行 3 次浸蜡，使用 JB-L5 型包埋机进行包埋处理，并将蜡块在 HM325 型切片机上制备厚度定为 5 µm 的切片。将切片进行脱蜡处理后，分别使用苏木精和伊红进行 HE 染色，并将染色完成的切片以中性树胶封片。最后，采用 AXIOVISION 软件在显微镜（Olympus）中获取图像并进行分析处理。
1.3.8 蛋白质印迹检测 CASPASE-1 与 CASPASE-3 的表达水平
将对照组和氨氮胁迫组的大口黑鲈肾脏组织分别使用 RIPA 中性裂解液进行裂解获得蛋白上清液，参考 1.3.6 方法进行 SDS-PAGE 电泳，将电泳分离的蛋白转移至 PVDF 膜并封闭处理后，使用制备的兔或鼠源 CASPASE-1 与 CASPASE-3 抗体作为一抗进行过夜孵育，随后以 HRP 标记的山羊抗兔（或鼠）IgG 作为二抗室温孵育，采用化学发光法（ECL）显色并拍照。
1.3.9 RT-qPCR 检测 caspase-1 与 caspase-3 的 mRNA 表达水平
通过 TRIzol 法提取氨氮胁迫前后大口黑鲈肾脏组织中 mRNA，随后使用反转录试剂盒（诺唯赞）将其反转录为 cDNA 作为模版；以表1中相关实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）引物，利用 RT-qPCR 试剂盒（翌圣生物科技公司），按照说明书在 Roche LightCycler® 480 系统开展 RT-qPCR。最后，以 18S 基因为内参，通过 2–ΔΔCt法检测 caspase-1 与 caspase-3 基因的 mRNA 表达水平。
1.3.10 数据分析
通过 SPSS 27.0 软件对大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 与 CASPASE-3 在氨氮胁迫前后的 mRNA 表达和蛋白表达水平进行 Student’s t 检验， *表示 P<0.05，**表示 P<0.01，***表示 P<0.001。
2 结果与分析
2.1 目的蛋白序列分析
通过分析大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白抗原表位、亲水性和结构域等相关信息，发现 CASPASE-1 抗原表位整体分布较为均匀（图1a），靠近 N 端的蛋白序列处于 0 轴以下的区域相对较多（图1b），说明 CASPASE-1 蛋白的 N 端亲水性较好；CASPASE-3 抗原表位较为明显地集中在 N 端区域（图1c），其亲水性也是 N 端区域较高（图1d）。因此，CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白目的表达区段应该靠近 N 端区域。进一步对蛋白结构域分析显示，CASPASE-1 主要由半胱天冬酶募集结构域（CARD）和半胱天冬氨酸（CASc）结构域组成（图1e），而 CASPASE-3 的 N 端很短，主要结构域为 CASc 结构域（图1f）。CARD 结构域主要功能是作为接头分子结合 ASC 等蛋白从而起组装作用；CASc 结构域主要由 p10 和 p20 亚基组成，具备蛋白水解活性，能够切割自身以及其他相应蛋白。因此目的表达区段应尽量避开 C 端的 CASc 结构域。
因此，综合蛋白的抗原表位、亲水性和结构域功能等相关因素，本研究确定 CASPASE-1 的 0~200 氨基酸区域作为CASPASE-1的原核表达目的区段，CASPASE-3 的原核表达目的区段为 0~150 氨基酸区域，且 2 个蛋白的所选区段均无信号肽，避免了对蛋白表达的影响。
图1大口黑鲈 CASPASE-1 蛋白抗原表位（a）、疏水性（b）及 CASPASE-3 蛋白抗原表位（c）、疏水性（d）分析以及 CASPASE-1（e）和 CASPASE-3（f）蛋白结构域和原核表达目的区段、蛋白结构域和原核表达目的区段
Fig.1Analysis of CASPASE-1 protein antigen epitope (a) , hydrophobicity (b) , and CASPASE-3 protein antigen epitope (c) and hydrophobicity (d) in largemouth bass, as well as CASPASE-1 (e) and CASPASE-3 (f) protein domain and prokaryotic expression target segment.
2.2 原核表达重组质粒的构建与鉴定
根据目的区段添加酶切位点设计引物（表1），以大口黑鲈肝脏 cDNA 为模板，使用高保真酶进行 PCR 扩增，经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，显示 caspase-1 和 caspase-3 的扩增条带大小与预计相符，分别为 600 bp 和 450 bp（图2 a）。将 caspase-1 和 caspase-3 含有酶切位点的 PCR 产物进行纯化、酶切、连接后转化到 DH5α 中，均匀涂布在含有氨苄抗生素的 LB 平板上，分别获得具有氨苄抗性的 caspase-1 和 caspase-3 目的区段单菌落（图2b、图2c）。
分别挑取单菌落后，使用针对 caspase-1 和 caspase-3 目的区段的特异性引物和针对 pET-32a 质粒多克隆位点区的载体引物进行 PCR 扩增，经 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳后，将鉴定为阳性的 DH5α 单菌落送测序公司进行测序。经比对测序结果，发现 caspase-1 和 caspase-3 重组质粒序列与 NCBI 上的 caspase-1 和 caspase-3 源序列完全相同（图2d~图2e），说明 pET-32a-CASPASE-1 和 pET-32a-CASPASE-3 原核表达重组质粒构建成功。
2.3 重组蛋白的表达和纯化
将上述 pET-32a-Ms-CASPASE-1 和 pET-32a-MsCASPASE-3 原核重组质粒转化到 BL21（DE3）感受态细胞，分别进行扩大培养后，加入梯度浓度的 IPTG 于 16℃过夜诱导表达原核重组蛋白。将蛋白表达后的样品经 SDS-PAGE 电泳检测显示，在 46 kDa 位置可见单一的 Ms-CASPASE-1 重组蛋白条带，在 36 kDa 位置显示单一的 Ms-CASPASE-3 重组蛋白条带。对比梯度浓度 IPTG 诱导结果发现，Ms-CASPASE-1 在1.0 mmol/L IPTG 的诱导条件下表达效果最佳，MsCASPASE-3 在 0.6 mmol/L IPTG 诱导条件下表达效果最佳；因此，本研究将 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白的最佳 IPTG 诱导浓度分别确定为1.0 mmol/L 和 0.6 mmol/L。随后，在此条件下进行大量诱导，将表达有 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 重组蛋白的 BL21（DE3）感受态细胞超声波破碎，收集上清液和包涵体。SDS-PAGE 结果显示，在上清液和包涵体中均可检测到 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 重组蛋白。随后纯化上清液，发现经过镍柱纯化获得的 pET-32a-CASPASE-1 和 pET-32a-CASPASE-3 重组蛋白上清液条带单一，蛋白分子量大小约 46 kDa（图3a）和 36 kDa（图3b），与预计大小相符。上述结果表明，pET-32a-Ms-CASPASE-1 和 pET-32a-Ms-CASPASE-3 重组蛋白成功表达在上清液中，并完成纯化，可将该上清液用于后续的动物免疫。
图2caspase-1 和 caspase-3 的 PCR 扩增（a）及阳性菌（b、c）和测序结果比对（d、e）
Fig.2PCR amplification (a) and positive bacteria (b and c) with sequencing results (d and e) of caspase-1 and caspase-3
M：蛋白 Marker；1：caspase-1 原核表达区段扩增条带；2：caspase-3 原核表达区段扩增条带。
M: Protein Marker; 1: Amplified bands of caspase-1 prokaryotic expression region; 2 : Amplified bands of caspase-3 prokaryotic expression region.
2.4 多克隆抗体效价检测
将上述纯化的蛋白上清液分别免疫 1 只日本大耳兔和 3 只 Balb/C 小鼠，收集经过 4 次免疫的兔源和鼠源 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 抗血清，以间接 ELISA 方法检测抗体的效价，取 3 次重复实验结果的平均值，阳性血清 OD450 nm与阴性血清 OD450 nm的比值大于 2∶1 的血清稀释度为抗体的效价，阴性血清作为空白对照，其值均小于 0.1。结果显示，针对 Ms-CASPASE-1的1只兔源和3只鼠源抗血清的效价分别为 1∶1.024×107、1∶1.024×106、1∶1.024×106、1∶ 1.024×106（图4a、图4b），针对 Ms-CASPASE-3 的 1 只兔源和3 只鼠源抗血清的效价分别为 1∶1.024×107 、1∶ 1.024×106、1∶1024×106、1∶1.024×103（图4c、图4d）。
2.5 多克隆抗体的特异性检测
分别取含有原核重组 Ms-CASPASE-1 和 MsCASPASE-3 蛋白的 BL21（DE3）阳性菌和健康大口黑鲈组织均以 RIPA 中性裂解液进行裂解，获得蛋白上清液进行免疫印迹分析。结果显示，在 Ms-CASPASE-1 重组蛋白的泳道中检测到分子量约为 46 kDa 的单一条带，这与重组 pET-32a-Ms-CASPASE-1 条带的大小相符（图5a）。同时，在大口黑鲈肝脏组织蛋白的泳道中也检测到单一且清晰的蛋白条带，分子量约为 44 kDa，与内源性 CASPASE-1 条带大小相符（图5b）。以上结果表明，本研究制备的兔源和鼠源 Ms-CASPASE-1 多克隆抗体可特异性识别大口黑鲈 CASPASE1 原核重组蛋白和内源性蛋白。
类似地，在 Ms-CASPASE-3 重组蛋白的泳道中检测到分子量约为 36 kDa 的单一条带，与重组 pET-32a-Ms-CASPASE-3 条带的大小相符（图5c）；而大口黑鲈肝脏组织的内源性 CASPASE-3 蛋白中检测到蛋白分子量约为 31 kDa（图5d），与预期大小相符。结果表明，本研究制备的兔源和鼠源 Ms-CASPASE-3 多克隆抗体也可特异性识别大口黑鲈 CASPASE-3 原核重组蛋白和内源性蛋白。
2.6 氨氮胁迫后不同时间对大口黑鲈肾脏结构的影响
如图6所示，在对照组的大口黑鲈肾脏切片染色后可以看到清晰的肾小体结构，其作为肾脏的滤过单位，主要由一团微小的毛细血管组成肾小球，负责将血液中的废物和多余液体过滤到肾小囊腔中成为原尿。而肾小管包括远曲小管、近曲小管等结构，其中近曲小管的表面由褶皱丰富的微绒毛覆盖，可重新吸收滤过液中的营养物质和水分，而远曲小管内壁无微绒毛，管内空腔更大，它通过分泌和重吸收不同的离子，对尿液进行进一步的调整，使其适合排出体外。本研究中，氨氮胁迫后大口黑鲈的肾小体细胞增生（绿色箭头），肾小囊腔扩大（黑色箭头），结构的变化显著影响了肾小球的滤过功能。同时，氨氮胁迫下肾脏远曲小管的上皮细胞结构逐渐被破坏，细胞间隙逐渐增大（蓝色箭头），同时，近曲小管上皮细胞膨胀、解离，细胞结构也发生了紊乱（黄色箭头）。这些变化表明，氨氮胁迫影响了肾脏的分泌功能以及对滤过液中营养物质和水分的重吸收能力。
图3SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达和纯化电泳图
Fig.3Expression and purification of recombinant protein by SDS-PAGE
a：CASPASE-1 重组蛋白；b：CASPASE-3 重组蛋白。M：蛋白 Marker；1：含空质粒的 BL21（DE3）菌体； 2：转化重组质粒的 BL21（DE3）工程菌（未诱导）；3~7：分别为以 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L IPTG 诱导的工程菌； 8：破碎后的工程菌上清液；9：破碎后的工程菌包涵体；10：纯化后的工程菌上清液。
a: Recombinant CASPASE-1 protein; (b) Recombinant CASPASE-3 protein. M: Protein Marker; 1: BL21 (DE3) empty bacteria; 2: The BL21 (DE3) positive cells that convert recombinant plasmid; 3–7: Engineering bacteria induced by 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1.0 mmol/L IPTG; 8: Supernatant of broken bacterial cells; 9: Inclusion body of broken bacterial cells; 10: Purified supernatant of broken bacterial cells.
图4大口黑鲈 CASPASE-1 的兔源（a）、鼠源（b）和 CASPASE-3 的兔源（c）和鼠源（d）多克隆抗体效价曲线
Fig.4Titer curve of rabbit and mouse originated CASPASE-1 (a, b) and CASPASE-3 (c, d) polyclonal antibody
2.7 氨氮胁迫对大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白和基因水平的影响
为探究 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白在氨氮胁迫前后的大口黑鲈肾脏中的表达情况，首先通过 RT-qPCR 法检测了 caspase-1 和 caspase-3 的 mRNA 表达水平，结果发现氨氮胁迫后大口黑鲈肾脏中caspase-1 和 caspase-3 的 mRNA 表达水平显著升高（图7a）。进而以本研究制备的 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 多克隆抗体对胁迫前后的肾脏组织进行免疫印迹检测，图7b结果显示在氨氮胁迫后的大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01），类似地，在氨氮胁迫后大口黑鲈肾脏中 CASPASE-3 的蛋白表达水平也极显著高于对照组（P<0.001），表明氨氮胁迫显著升高了大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的蛋白水平。
3 讨论
CASPASE-1 和 CASPASE-3 是半胱氨酸蛋白酶家族中的 2 个代表性蛋白，分别在炎性细胞坏死（细胞焦亡）和细胞凋亡中发挥关键功能。前期研究发现，细菌感染诱导鱼类 caspase-1 和 caspase-3 等相关 mRNA 表达水平显著升高，介导了鱼类细胞凋亡和焦亡反应（Jiao et al，2021; Song et al，2025）。然而，受限于目前针对大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的特异性抗体缺乏，导致相关功能研究受制约。因此，本研究首次利用原核表达系统制备大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白，并通过动物免疫实验获得了针对Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 的兔源和鼠源多克隆抗体，为后续在蛋白水平研究大口黑鲈中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的功能提供了重要的基础材料。
图5兔源和鼠源 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 多克隆抗体的免疫印迹分析
Fig.5Western blotting analysis of Ms-CASPASE-1 and Ms-CASPASE-3 polyclonal antibodies from rabbit and mouse sources
a：CASPASE-1 多克隆抗体检测原核重组 Ms-CASPASE-1 蛋白：1. 空质粒的 B21（DE3）菌体蛋白； 2. 转化 pET-32a-CASPASE-1 的工程菌蛋白（未诱导）；3. 以 1.0 mmol/L IPTG 诱导的工程菌蛋白。b：CASPASE-1 多克隆抗体检测大口黑鲈组织内源性蛋白：1、2、3 泳道为平行组。c：CASPASE-3 多克隆抗体检测原核重组 Ms-CASPASE-3 蛋白：1. 空质粒的 B21（DE3）菌体蛋白；2. 转化 pET-32a-CASPASE-3 的工程菌蛋白（未诱导）；3. 以 0.6 mmol/L IPTG 诱导的工程菌蛋白。d：CASPASE-3 多克隆抗体检测大口黑鲈组织内源性蛋白：1、2、3 泳道为平行组。
a: Detection of recombinated Ms-CASPASE-1 protein by CASPASE-1 polyclonal antibody: 1: Pure bacterial protein of B21 (DE3) with empty plasmid; 2: Engineering BL21 (DE3) bacteria protein transfected with pET-32a-CASPASE-1 without induction: 3: Engineering BL21 (DE3) bacteria protein with 1.0 mmol/L IPTG induction. b: Detection of CASPASE-1 in largemouth bass tissue protein by CASPASE-1 polyclonal antibody with three replicates. c: Detection of recombinated Ms-CASPASE-3 protein by CASPASE-3 polyclonal antibody: 1. Pure bacterial protein of B21 (DE3) with empty plasmid; 2. Engineering BL21 (DE3) bacteria protein transfected with pET-32a-CASPASE-3 without induction; 3. Engineering BL21 (DE3) bacteria protein with 0.6 mmol/L IPTG induction. d: Detection of CASPASE-3 in largemouth bass tissue protein by CASPASE-3 polyclonal antibody with three replicates.
图6氨氮胁迫前后大口黑鲈肾脏组织的病理切片观察
Fig.6The histological structure of kidney in largemouth bass before and after ammonia stress
绿色箭头：肾小体细胞；黑色箭头：肾小囊腔；蓝色三角箭头：远曲小管；黄色三角箭头：近曲小管。
Green arrows: Renal corpuscle cell; Black arrows: Renal capsule space; Blue triangle arrow: Distal convoluted tubule; Yellow triangle arrow: Proximal tubule.
3.1 大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的原核表达和多克隆抗体制备
本研究以原核表达系统来制备大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的重组蛋白，选用的原核表达质粒为 pET-32a，其中含有的 T7 启动子能够与 BL21（DE3）表达菌株中的 T7 RNA 聚合酶相互作用（叶静，2022），表现出相对于正常大肠杆菌 RNA 聚合酶快将近 6 倍的速度（解庭波，2008），从而极大提高了 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白的表达速度。在蛋白表达区段选择方面，越长的蛋白序列含有的抗原表位越多，可能在免疫动物后获得的效果越好（Jiao et al，2021），但蛋白分子量过大会抑制表达效率，因此，原核表达中通常选择亲水性较高、免疫原性较强的区段。冯军厂等（2018）选择鲤（Cyprinus carpio）TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10 和 TGF-β 等基因中含有部分抗原决定簇的片段（217~387 bp 编码序列）用于原核表达，而前期我们课题组选择大口黑鲈 NLRP3 蛋白的第 40~190 氨基酸区域设计特异性引物并添加特定的酶切位点，获得了 37 kDa 的原核重组蛋白（陈振威等，2024）。考虑到大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白的 C 端都含有 CASc 催化结构域，具有水解自身和其他蛋白的能力，因此本研究主要从 N 端区域筛选目的区段以避开 C 端的 CASc 结构域。大口黑鲈 CASPASE-1 的 N 端含有 CARD 结构域，抗原表位分布较为平均但亲水性较 C 端强；CASPASE-3 的 N 端区域抗原表位分布很集中，亲水性也较强。因此， CASPASE-1 和 CASPASE-3 的原核表达目的区段最终确定为 N 端的 0~200 和 0~150 氨基酸序列，表达的蛋白区段大小分别约为 24 kDa 和 16 kDa，结合 pET-32a 载体上约 20 kDa 的标签蛋白，最终表达的 pET-32a-CASPASE-1 和 pET-32a-CASPASE-3 重组蛋白大小分别为 44 kDa 和 36 kDa。
图7氨氮胁迫前后大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的 mRNA（a）与蛋白表达水平（b）
Fig.7Relative mRNA (a) and protein expression levels (b) of CASPASE-1 and CASPASE-3 in the kidney of largemouth bass before and after ammonia stress
b：1~3 为对照组；4~6 为氨氮胁迫组。*表示 P<0.05，**表示 P<0.01。
b: 1–3: Control group; 4–6: Ammonia stress group. *: P<0.05，**: P<0.01.
为了将原核重组质粒获得最佳的表达效果，需要在表达菌株及表达条件（温度、时间和 IPTG 诱导浓度）等方面进行优化。考虑到 BL21（DE3）菌株同时含有 T7 RNA 聚合酶和大肠杆菌 RNA 聚合酶，因此，本研究选择 BL21（DE3）菌株作为 pET-32a-CASPASE-1 和 pET-32a-CASPASE-3 原核重组质粒的表达菌株。在表达条件的选择方面，本研究设置 0.2、0.4、0.6、 0.8 和 1.0 mmol/L 等 5 个 IPTG 梯度以诱导重组蛋白的表达，发现 CASPASE-1 重组蛋白在 1.0 mmol/L 的 IPTG 浓度诱导条件下，重组蛋白表达效果最佳， CASPASE-3 重组蛋白最适诱导浓度则为 0.6 mmol/L； 另一方面，为了防止温度过高导致重组蛋白过快表达而来不及正确折叠、形成不溶性的包涵体形式等情况的发生（董旭等，2007），本研究将表达菌株的诱导条件设为 16℃、过夜诱导，藉此收集并破碎菌体后获得更多表达于上清液中的蛋白。在上清液重组蛋白的纯化方面，考虑到重组蛋白中含有 6×His 标签蛋白，因此，本研究选择 Ni-NTA Beads 6FF 重力柱与带有 6×His 标签的重组蛋白特异性地结合，之后使用高浓度的咪唑进行洗脱以获得目标蛋白（常恒祯等，2021）。随后将纯化后的上清液蛋白样品进行 SDS-PAGE 分析，根据分子量大小判断目的蛋白被成功纯化（苏杭等，2022），结果显示，镍柱纯化后的 2 种上清液蛋白在 SDS-PAGE 后均获得单一且分子量大小分别约 44 kDa 和 36 kDa 的条带，与 pET-32a-CASPASE-1 和 pET-32a-CASPASE-3 重组蛋白的预期大小相符。因此，本研究成功获得了纯度较高的大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白，可用于免疫动物以制备大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白的多克隆抗体。
3.2 大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 多克隆抗体的性能评价
考虑到不同动物针对免疫原产生的免疫反应可能有很大差异，因此，为了获取更多可能的多克隆抗体，本研究将上述制备的大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白纯化后分别免疫 1 只日本大耳兔和 3 只 Balb/C 小鼠，收集经过 4 次免疫的兔源和鼠源 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 抗血清。随后，通过蛋白印迹法检测获得的多克隆抗体是否能特异性识别用作免疫原的 CASPASE-1 和 CASPASE-3 重组蛋白以及大口黑鲈组织内源性蛋白，结果发现，本研究针对大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 获得的 4 种多克隆抗体，可识别的重组蛋白片段大小约 44 kDa 和 36 kDa，这与 pET-32a 标签蛋白（20 kDa）加上 CASPASE-1 和 CASPASE-3 表达区段（24 kDa 和 16 kDa）的大小一致；同时 4 种多克隆抗体识别到的内源性蛋白大小约 44 kDa 和 31 kDa，这与大口黑鲈组织内源性 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白大小一致，表明制备的抗体具有很好的特异性。最后，通过 ELISA 检测 4 种抗血清的效价，结果发现，针对大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的兔源抗血清效价均为 1∶1 024×104，而鼠源抗血清效价均为/1∶ 1 024×103；这显著高于前人报道中针对大口黑鲈 G6pc 和 Gck 的鼠源抗体效价（1∶3 000 和 1∶10 000）（夏如等，2024）以及针对鲤 PepT1 转运载体的兔源多克隆抗体效价（4×105 ）（闫潇等，2016），这表明本研究获得的兔源和鼠源多克隆抗体具有优秀的效价；同时，尽管 PVDF 膜曝光时间差异导致鼠源抗体的 SDS-PAGE 检测略佳，但兔源的抗体效价高于鼠源抗体效价。因此，本研究成功制备了兔源和鼠源的大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 多克隆抗体。
3.3 水体氨氮胁迫对大口黑鲈肾脏结构以及 CASPASE-1 和 CASPASE-3 蛋白表达的影响
肾脏是参与解毒的主要器官之一，已有研究表明氨氮胁迫会导致肾小管和肾小体肿胀、堵塞和出血。在团头鲂（Megalobrama amblycephala）的研究中发现，氨氮胁迫后肾脏出现肾小管扩张和严重的组织病理学损伤，伴随明显的肾小管上皮空泡化和变性（Zhang et al，2018）。氨氮胁迫还导致莫桑比克奥利亚罗非鱼（Oreochromis mossambicus）肾小管上皮细胞空泡化和变性，并随着胁迫时间的延长导致损伤程度加剧（Ravindrababu et al，2012），同时还可引起罗非鱼（Oreochromis niloticus L.）肾小球肾炎和充血等病理特征（Benli et al，2008），甚至引起大菱鲆（Scophthalmus maximus）肾上腺素 EPI 水平的显著升高（孟振等，2020）。本研究以氨氮胁迫大口黑鲈后检测到肾小体细胞增生、肾小囊腔扩大，结构的变化显著影响了肾小球的滤过功能；同时肾脏远曲小管的上皮细胞结构逐渐被破坏，细胞间隙逐渐增大，同时近曲小管上皮细胞膨胀、解离，细胞结构也发生了紊乱并出现死亡，这与上述报道类似。
已有研究表明，氨氮胁迫诱导的大口黑鲈鳃组织出现明显的病理学改变，表现为次级鳃丝出现卷曲，鳃上皮细胞增生、鳃小片融合及坏死等；上述过程伴随着大口黑鲈肝脏、鳃和脑中 caspase-3 的基因表达水平显著升高（Zhao et al，2020）。类似地，对罗非鱼（Abdel-Latif et al，2022）和暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）（Cheng et al，2015）的研究表明，氨氮胁迫导致次级鳃丝上皮细胞死亡脱落、炎性细胞浸润，而肝细胞核固缩、细胞变性死亡、充血，同样检测到肝脏中 caspase-3 的基因表达水平。然而由于缺少特异性抗体，鱼类中 CASPASE-3 相关的蛋白功能研究比较缺少。而目前尚无关于氨氮胁迫后 caspase-1 表达的报道。考虑到氨氮胁迫导致的大口黑鲈肾脏组织结构损伤和细胞死亡，为进一步探究具体的调控机制，以本研究制备的 Ms-CASPASE-1 和 Ms-CASPASE-3 多克隆抗体对胁迫前后的肾脏组织进行免疫印迹检测，结果可见在氨氮胁迫后大口黑鲈肾脏中 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的蛋白表达水平显著高于对照组的肾脏中表达水平，综合前述氨氮胁迫后肾脏组织病变及细胞死亡的结果，表明 CASPASE-1 和 CASPASE-3蛋白可能参与了氨氮胁迫后大口黑鲈肾脏组织病变和细胞程序性死亡。
4 结论
本研究首次获得大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的原核表达重组蛋白，并以此免疫动物成功制备了针对二者的兔源和鼠源多克隆抗体，均表现出很好的特异性和很高的效价。在此基础上，探明了氨氮胁迫诱导了大口黑鲈肾脏组织病变以及 CASPASE-1 和 CASPASE-3 的 mRNA 和蛋白表达，这为后续深入探究大口黑鲈 CASPASE-1 和 CASPASE-3 在细胞程序性死亡中的功能奠定了基础。
