摘要
紫菜腐霉(Pythium porphyrae 和 P. chondricola)具有极强的环境适应力，能够在环境中长期生存，是影响紫菜(Porphyra sensu lato)栽培最为严重的病原之一。前期研究发现，在紫菜腐霉基因组中可以注释到重要抗逆代谢物四氢嘧啶合成关键基因 EctC，该基因相较于陆地卵菌中同源基因呈显著扩张，推测其可能在紫菜腐霉环境适应中发挥关键作用。本研究利用大豆疫霉(Phytophthora sojae)转化体系构建了 EctC 敲除株(PsΔEctC-RFP)、异源回补株(PsΔEctC-PpEctC)、异源表达株 (Ps-hePpEctC)及过表达株(Ps-oeEctC)，探究了 EctC 在病原环境适应与致病中的作用。结果显示，与野生株相比，PsEctC 缺失显著降低病原菌丝的生长及抗高盐、高 pH 和氧化胁迫能力和致病性，而异源回补 PpEctC 能一定程度恢复病原生长、抵御胁迫和致病能力。此外，异源表达 PpEctC 和过表达 PsEctC 能显著提高病原对渗透压和氧化胁迫的耐受力及对宿主的侵染力。综上所述，EctC 基因在卵菌生长、抵抗环境胁迫和致病过程中发挥关键作用，为后续开发病害精准防控策略提供重要靶标。
关键词
Abstract
Pythium porphyrae and Pythium chondricola, collectively known as red rot pathogens, pose a severe threat to nori (Pyropia/Porphyra) cultivation, causing substantial global economic losses. A critical factor underpinning their success as pathogens is their remarkable resilience and adaptability to fluctuating environmental conditions, which enable their persistent survival and infection. In our preliminary work, we annotated the key ectoine biosynthetic gene EctC, which is responsible for the synthesis of ectoine—an important stress-protective metabolite—from the Pythium porphyrae genome; notably, compared with homologs in terrestrial oomycetes, this gene shows a marked expansion Ectoine is a potent stress-protectant molecule that is well characterized in prokaryotes for its role in the osmoprotection and stabilization of macromolecules under various abiotic stresses, including high salinity, drought and oxidative stress. Its presence and potentially functional role in eukaryotic oomycetes, particularly in plant pathogens, represent a paradigm shift, as it was historically considered a prokaryotic-specific metabolite. This study aimed to functionally characterize the role of EctC from P. porphyrae (PpEctC) in oomycete growth, environmental stress tolerance, and pathogenicity. We employed a heterologous functional genomics approach using the established Phytophthora sojae transformation system. We generated a comprehensive set of transgenic strains in strain P6497 to investigate the function of EctC. Using the CRISPR/Cas9-mediated gene replacement strategy coupled with homology-directed repair (HDR), we successfully created a PsEctC knockout mutant (PsΔEctC-RFP), in which the native PsEctC gene was replaced with a red fluorescent protein (RFP) marker. We generated a heterologous complementation strain (PsΔEctC-PpEctC) by replacing PsEctC with the PpEctC gene from P. porphyrae. Additionally, we constructed a strain overexpressing PsEctC (Ps-oeEctC) and strain expressing PpEctC (Ps-hePpEctC) in the wild-type (WT) P. sojae background using a plasmid-based expression system. Successful gene editing, deletion, and altered expression levels of all transgenic strains were validated using PCR, qRT-PCR, and phenotypic screening. Phenotypic characterization under standard conditions revealed that the deletion of PsEctC significantly impaired mycelial growth, as evidenced by significantly smaller colony diameter of the PsΔEctC-RFP mutant compared with that of the wild-type and empty vector control (CK). Intriguingly, heterologous complementation of the PsΔEctC-PpEctC strain with PpEctC fully restored mycelial growth to that of the WT, demonstrating functional equivalence and cross-species compatibility of the P. porphyrae EctC insupporting basic P. sojae vegetative growth. In contrast, neither the knockout nor complementation significantly affected sporangia formation or zoospore production, except for an unexplained reduction in zoospore yield in the PsΔEctC-PpEctC strain. This suggests that EctC is primarily involved in hyphal expansion but not in the specific developmental reproductive stages under non-stress conditions. We then investigated the role of EctC in stress tolerance. Under high salinity stress (35% NaCl), the PsΔEctC-RFP knockout mutant exhibited a dramatic reduction in relative growth, highlighting its increased sensitivity to osmotic stress. The heterologous complementation strain (PsΔEctC-PpEctC) displayed a growth tolerance phenotype, which was statistically indistinguishable from that of the WT and CK, confirming that PpEctC could effectively restore osmotolerance. Strikingly, both the PsEctC overexpression (Ps-oeEctC) and PpEctC heterologous expression (Ps-hePpEctC) demonstrated superior growth under high-salt conditions, significantly outperforming the WT. This indicates that elevated EctC expression, whether from a native or heterologous source, confers a distinct advantage under osmotic stress. A similar trend was observed under alkaline pH stress (pH 9), in which the EctC knockout mutant was severely compromised, whereas the complemented and overexpression mutants maintained robust growth, underscoring the role of ectoine in pH stress mitigation. Given the critical role of reactive oxygen species in plant defense, we assessed the total antioxidant capacity of the transformants. We found that the PsΔEctC-RFP mutant showed a significant decrease in antioxidant capability. Conversely, both the Ps-oeEctC and Ps-hePpEctC mutants exhibited substantial enhancement in their antioxidant capacities, with the latter exhibiting a more potent effect. The complementation strain (PsΔEctC-PpEctC) showed a partial but significant recovery in antioxidant capacity compared to the knockout, although it did not reach that of the WT. This result shows a clear link between the EctC-mediated ectoine synthesis and pathogen’s oxidative stress defense system, which is crucial for countering host-induced oxidative bursts during infection. Pathogenicity assays on etiolated soybean hypocotyls provided compelling evidence for the role of EctC in virulence. The PsΔEctC-RFP knockout strain caused minimal lesions and showed a significantly lower relative in planta biomass than the WT, indicating severely attenuated virulence. Complementation with PpEctC (PsΔEctC-PpEctC) partially restored pathogenicity, leading to a higher biomass than the knockout although not to the WT levels. Most notably, heterologous expression of PpEctC (Ps-hePpEctC) resulted in hypervirulence, with significantly greater pathogen biomass recovered from the infected tissues than from the WT. The overexpression mutant (Ps-oeEctC) also showed enhanced virulence than the WT. These findings strongly suggest that EctC is a critical virulence factor and that its enhanced expression can potentiate pathogen infectivity and colonization ability, likely by bolstering resistance to host-imposed environmental and oxidative stresses. In conclusion, our study provides comprehensive functional evidence that the ectoine synthase gene EctC, particularly the PpEctC variant from P. porphyrae, plays a multifaceted and pivotal role in oomycete biology. It is integral for optimal mycelial growth, essential for tolerance to high salinity and alkaline pH, crucial for enhancing antioxidant capacity, and is a major determinant of pathogenicity. Successful heterologous complementation and the hypervirulent phenotype induced by heterologous expression confirmed functional potency of PpEctC. This study not only elucidates a previously uncharacterized stress adaptation mechanism in a destructive eukaryotic pathogen but also pinpoints EctC and the ectoine biosynthesis pathway as promising and novel targets for developing precise disease control strategies against red rot disease in nori aquaculture. Future work will focus on directly validating these findings in P. porphyrae upon the establishment of a robust transformation system.
紫菜（Porphyra sensu lato）作为一种经济价值极高的海藻，广泛栽培于中国、日本和韩国，是重要的 “海洋蔬菜”（Wang et al，2020; 李娜等，2026）。紫菜富含蛋白质、膳食纤维、矿物质和维生素，是低热量、高营养的健康食品（田雨等，2021; 杨贤庆等，2020）。中国是全球最大的紫菜生产国，年产量达 21.76 万 t，约占全球紫菜生产总量的 80%（Lee et al，2024）。病害问题是我国紫菜产业的主要挑战，每年因病造成的损失达 30 亿元（Cottier-Cook et al，2022）。由紫菜腐霉（Pythium porphyrae 和 P. chondricola）感染引起的赤腐病（red rot disease）是影响紫菜产量和品质最严重的卵菌病害之一（Liu et al，2024; 翁佩文等，2023）。目前，赤腐病防控多依赖紫菜高抗逆特性，如干出、酸洗和冷藏栽培网帘（Kim et al，2023）。然而，紫菜腐霉对不利环境具有极强的适应能力，导致现有防控方法效果有限。因此，探究紫菜腐霉抗逆机制对开发赤腐病精准防控策略具有重要意义。
四氢嘧啶（ectoine，1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid）是一种微生物合成的抗逆代谢物，能通过调节胞内渗透压和稳定蛋白质、核酸等生物大分子以保护细胞膜结构、提高生物对高盐、干旱、温度、氧化胁迫等逆境的适应能力。如，盐单胞菌（Halomonas elongata）在高盐环境中合成和积累四氢嘧啶作为兼容溶质，维持胞内渗透压平衡（Yu et al，2024），盐胁迫冲击下盐单胞菌的四氢嘧啶合成水平迅速提升，最高可达 1 450 mg/（L·h），及时缓解渗透压上升带来的压力（Yu et al，2024）。Salmannejad 等（2017）研究表明，在热诱导条件下，添加四氢嘧啶或四氢嘧啶的羟基化衍生物——羟基四氢嘧啶能显著降低重组干扰素（rhIFN）的蛋白质聚集，保持其活性，从而增强蛋白质对热应激等环境压力的适应能力。Meyer 等（2017）研究表明，在较低 pH 条件下，小分子相容性溶质四氢嘧啶会吸附于质粒 pUC19 双链 DNA 周围带负电的磷酸骨架从而改变 DNA 的构象，提高 DNA 对外部 pH 胁迫的抗损伤能力。微生物利用二氨基丁酸乙酰转移酶（diaminobutyric acid acetyltransferase，EctA）、二氨基丁酸转氨酶（diaminobutyric acid transaminase，EctB）和四氢嘧啶合成酶（ectoine synthase，EctC）生成四氢嘧啶，其中 EctC 是微生物是否具备四氢嘧啶生物合成途径的分子标志（Czech et al，2018）。四氢嘧啶曾被认为是原核生物独有的抗逆代谢物，然而，近年来在原生动物（Halocafeteria seosinensis 和 Pharyngomonas kirbyi）（Harding et al，2016）和卵菌（Phytophthora plurivora 和紫菜腐霉）（Vetukuri et al，2018; 杨慧超，2023）的基因组中发现了 EctC 基因打破了这一认识。通过比较基因组分析发现，紫菜腐霉 EctC 基因相较陆地卵菌同源基因显著扩张，其中紫菜腐霉基因组中 EctC 基因之间的相似度为 99.50%~100%，与陆地卵菌 EctC 基因之间发相似度为 48.45%~63.75%（杨慧超，2023），但其在真核微生物特别是卵菌环境抗逆中的功能尚未解析。
基因敲除、沉默和过表达等是探究基因功能的有效手段（Hannon，2002; Shalem et al，2015），然而紫菜腐霉尚未建立合适的基因转化方法限制了这些技术的应用。前期研究中，本团队建立了基于大豆疫霉（Phytophthora sojae）转化体系的紫菜腐霉基因功能研究方法（Yang et al，2025）。基于此，本研究构建了大豆疫霉 EctC 基因敲除株和过表达株、紫菜腐霉 EctC 基因异源回补株和异源表达株，探究 EctC 基因在病原生长、抵抗胁迫和致病力方面的作用，为开发基于病原抗逆的赤腐病防控策略提供重要靶标。
1 材料与方法
1.1 实验菌株与培养条件
紫菜腐霉 NBRC 33253 购自日本国立技术研究所生物资源中心（NITE Biological Resource Center）。其菌丝在 24℃和 100 r/min 转速下培养于半海水葡萄糖-谷氨酸液体培养基中（Fujita et al，1977）。大豆疫霉 P6497 由南京农业大学植物保护学院提供。大豆疫霉 P6497 及其转化株在 25℃黑暗条件下培养于 10% V8 琼脂培养基（Li et al，2010）。“合丰 35”大豆购自齐鲁种业公司，在 25℃、相对湿度 80%的条件下培养 10 d 后用于侵染实验。
1.2 核酸提取与实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析
使用 HP Fungal DNA Kit 和 Fungal RNA Kit（Omega Bio-Tek，Inc.，Norcross，Georgia，美国）按照说明书对紫菜腐霉 NBRC 33253、大豆疫霉 P6497 及构建的转化子以及侵染后的大豆幼苗的基因组 DNA 和总 RNA 进行提取。使用 NanoDrop-2000（Thermo Fisher Scientific，美国）测定提取的 DNA 和 RNA 浓度及纯度。使用 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche Diagnostics GmbH，德国）合成 cDNA。使用 PrimerSTAR Max DNA Polymerase（Takara Bio，Inc.，日本）进行基因扩增。qRT-PCR 引物筛选、体系配制和扩增程序参照本团队前期工作进行（Yang et al，2023a、 b）。本研究所用引物见附表1。
1.3 质粒构建与转化子筛选
本研究构建的质粒与转化子见表1和表2。由于紫菜腐霉中 EctC 基因具有极高的相似性，因此本研究随机选取 1 个 EctC 开展后续实验，基因序列已提交至 NCBI GenBank，登录号为 PX693218。利用附表1中的引物分别克隆紫菜腐霉和大豆疫霉 EctC 基因，通过 In-Fusion® Snap Assembly Master Mix（TaKaRa Bio USA，Inc.）将其分别克隆至 pTOR 载体中（Ma et al，2015），构建异源表达质粒 pTOR-PpEctC 和过表达质粒 pTOR-PsEctC。通过 EuPaGDT 和 RNAstructure 在线工具对 PsEctC 基因进行 sgRNA 筛选（Peng et al，2015; Reuter et al，2010）。选择 2 条 sgRNA 分别克隆至 pYF515（Fang et al，2016）获得 pYF515-SgRNA3 和 pYF515-SgRNA271。此外，扩增 PsEctC 基因上下游 1 000 bp 的同源臂分别与红色荧光蛋白基因（RFP）和PpEctC 基因克隆至 pBluescriptⅡKS+载体中，获得 pBluescript Ⅱ KS+-U-RFP-D 和 pBluescript Ⅱ KS+-U-PpEctC-D，用于同源定向修复（homologydirected repair，HDR）介导的基因替换操作。
利用 PEG-CaCl2 介导的原生质体转化法将质粒转入大豆疫霉中（Fang et al，2016）。将 pTOR-PsEctC 和 pTOR-PpEctC 分别转入大豆疫霉中获得 PsEctC 过表达转化子和 PpEctC 异源表达转化子。将重组的 pYF515 和 pBluescriptⅡKS+质粒共转化大豆疫霉获得 EctC 突变转化子和 PpEctC 异源回补转化子。利用 qRT-PCR 以 actin 基因（Fang et al，2016）为内参检测过表达转化子和异源表达转化子 EctC 基因表达水平（Livak et al，2001），选择转录水平最高的转化子用于后续实验。同时，通过 PCR 筛选发生 HDR 的转化子，并选择未扩增出 PsEctC 片段的转化子用于后续研究。
表1本研究构建的质粒
Tab.1Plasmids constructed in this study
表2本研究构建的转化子
Tab.2Transformants constructed in this study
1.4 转化子营养生长、孢囊形成和游动孢子产量分析
为评估各转化子的生长发育情况，将直径 5 mm 的菌落边缘琼脂块接种于 10%的 V8 琼脂培养基上，置于 25℃、黑暗条件下培养 4 d 后，用游标卡尺测量菌落直径。待菌丝生长至培养基边缘时，使用 Olympus BX53 显微镜（Olympus，日本）随机选取 10 个十倍物镜视野统计孢囊数量。游动孢子的诱导采用浸水法（Chen et al，2014）：在培养结束后将平板浸入去离子水，连续冲洗多次，每次 30 min，直至出现游动孢子时，将平板置于 15℃黑暗条件中孵育 18 h 以促进诱导孢子释放。使用血球计数板统计游动孢子浓度，以“个/mL”表示释放量。每个转化子设置 3 个生物学重复，并独立重复 3 次。
1.5 转化子胁迫耐受能力分析
为探究 PpEctC 在病原应对盐度和 pH 胁迫条件的作用，以 10% V8 琼脂培养基为基础培养基，并以 25℃、0‰ NaCl、pH 6 为基本培养条件。使用灭菌打孔器自不同转化子菌落边缘切取直径 5 mm 的琼脂菌块，分别接种于盐度 20 和 35‰、pH 3 和 pH 9 的 10% V8 琼脂培养基中黑暗条件培养 4 d，使用游标卡尺测量菌落直径。每个转化子的每种处理设置 5 个生物学重复，整个实验独立重复 3 次。
1.6 感染实验
将黄化大豆幼苗下胚轴分别浸入浓度为 104 个/mL 的不同转化子游动孢子液中 30 min，随后将黄化大豆幼苗下胚轴取出并置于 25℃、相对湿度约 80%的黑暗条件下侵染。在侵染后第 2 天记录症状并测定病原相对生物量（Ma et al，2017）。实验独立重复 3 次，每组设置 3 个生物学重复。
1.7 总抗氧化能力测定
将转化子在 10% V8 液体培养基中于 25℃黑暗静置培养 3 d。随后收集菌丝体，使用无菌纱布吸干菌丝表面水分后，用液氮冷冻并研磨成粉末。每个样品取约 0.1 g 湿重菌丝，使用真菌蛋白提取试剂盒（南京建成生物工程研究所）提取总蛋白，并通过 BCA 蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定蛋白浓度。使用总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS 法）（南京建成生物工程研究所）按照说明书操作测定不同转化子的抗氧化能力。在 96 孔板中加入 10 μL 蛋白提取液与 200 μL ABTS 工作液，于室温避光反应 6 min 后，在 490 nm 波长下利用酶标仪（Multiskan FC，Thermo Fisher Scientific，美国）读取吸光值。实验同时绘制 Trolox 标准曲线，并将样品结果换算为 Trolox 当量（TE），以表示单位蛋白的总抗氧化能力（Prior et al，2005; Re et al，1999）。每种转化子设置 3 个生物学重复，实验独立重复 3 次。
1.8 统计分析
转化子胁迫实验设置 5 个生物学重复，其余实验设置 3 个生物学重复，每个重复包含 3 个技术重复。所得数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。样品间的显著性差异使用 IBM SPSS Statistics 20.0 软件中的单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合 Duncan 多重检验确定，P<0.05 视为差异显著。
2 结果
2.1 转化子筛选
为研究 PpEctC 基因的功能，利用 EuPaGDT 和 RNAstructure 在线工具筛选了 2 个 sgRNA（sgRNA-3 和 sgRNA-271）用于引导 Cas9 蛋白对 PsEctC 的靶向破坏（图1A）。构建含有 PsEctC 上下游各 1 kb 同源臂的供体 DNA（RFP 或 PpEctC）用于 HDR 介导的基因替换。利用 F1/R1（RFP 和 PpEctC 替换 PsEctC 后目标大小分别为 1 689 bp 和 1 209 bp）和 F2/R2（RFP 和 PpEctC 替换 PsEctC 后目标大小分别为 1 989 bp 和 1 900 bp）引物对筛选发生供体 DNA 替换 PsEctC 的转化子（图1B~F）。利用 PsEctC 基因的特异引物 F3/R3 对发生基因替换的转化子进行 PCR 验证，选择不能扩增出目的条带的 PsEctC 基因完全替换转化子 PsΔEctC-RFP和PsΔEctC-PpEctC用于后续实验（图1G）。
图1CRISPR/Cas9 及同源重组（HDR）介导的 PsEctC 基因替换与异源补回
Fig.1CRISPR/Cas9-and homologous recombination (HDR) -mediated replacement and heterologous complementation of the PsEctC gene
A：设计两条靶向 PsEctC 的 sgRNA，引导 Cas9 在目标位点产生双链断裂（DSB）；在含同源臂的供体 DNA 存在下，通过 HDR 方式将 PsEctC 替换为 RFP 或 PpEctC，构建敲除株 PsΔEctC-RFP 和异源回补株 PsΔEctC-PpEctC；B：引物对 F1/R1 与 F2/R2 用于筛选 HDR 转化子；引物对 F3/R3 用于验证 EctC 位点被替换。F1/R1、F2/R2 和 F3/R3 引物扩增片段大小和序列与预期一致，表明 EctC 已成功被 RFP 或 PpEctC 替换。F1/R1 与 F2/R2 为同源臂外和供体片段内设计的引物，用于判定是否发生基因替换；F3/R3 为 PpEctC 的特异引物，用于判定 PsEctC 基因是否被完全替换；C：PsΔEctC-RFP（F1/R1）：扩增得到与预期一致的 5′端连接位点特异条带，指示目标位点 5′端发生正确的 HDR 事件；D：PsΔEctC-RFP（F2/R2）：扩增得到与预期一致的 3′端连接位点特异条带，进一步证明 EctC 位点已被 RFP 选择标记完整替换，敲除构建成功；E： PsΔEctC-PpEctC（F1/R1）：补回株在 5′端连接位点仍呈阳性条带，表明补回构建在目标位点保持正确的同源重组结构；F： PsΔEctC-PpEctC（F2/R2）：补回株在 3′端连接位点亦呈阳性条带，与（C）共同说明补回构建在目标位点定点整合；G：F3/R3 未在转化子中扩增出 PsEctC 特异条带，说明 PsΔEctC-RFP 和 PsΔEctC-PpEctC 中 PsEctC 基因被完全敲除。泳道 1 和 2 为 PsΔEctC-RFP 转化子；泳道 3 和 4 为 PsΔEctC-PpEctC；WT 为野生株。
A: Two sgRNAs targeting PsEctC were designed to guide Cas9 to generate double-strand breaks (DSBs) at the target sites. In the presence of donor DNA containing homologous arms, PsEctC was replaced by RFP or PpEctC through the HDR pathway, generating the knockout strain PsΔEctC-RFP and the heterologous complementation strain PsΔEctC-PpEctC; B: Primer pairs F1/R1 and F2/R2 were used to screen HDR transformants, while F3/R3 was used to verify replacement at the EctC locus. PCR products amplified by F1/R1, F2/R2, and F3/R3 showed expected fragment sizes and sequences, confirming successful replacement of EctC by RFP or PpEctC. Primers F1/R1 and F2/R2 were designed across the homologous arm and donor regions to determine gene replacement, while F3/R3 was specific to PpEctC, indicating complete replacement of PsEctC; C: In PsΔEctC-RFP (F1/R1) , a specific 5′-junction band consistent with the expected size was amplified, indicating a correct HDR event at the5′end; D: In PsΔEctC-RFP (F2/R2) , a specific 3′-junction band of the expected size was obtained, further confirming complete replacement of EctC by the RFP selection marker and successful knockout construction; E: In PsΔEctC-PpEctC (F1/R1) , a positive band was amplified at the5′junction, confirming correct homologous recombination structure at the target site in the complementation construct; F: In PsΔEctC-PpEctC (F2/R2) , a positive3′junction band was also observed, together with (C) indicating precise integration of the complementation construct; G: No PsEctC-specific amplicon was detected in the transformants using the F3/R3 primer pair, indicating that the PsEctC gene was completely deleted in both PsΔEctC-RFP and PsΔEctC-PpEctC strains. Lanes 1 and 2 correspond to PsΔEctC-RFP transformants, lanes 3 and 4 correspond to PsΔEctC-PpEctC transformants, and WT denotes the wild-type strain.
此外，利用大豆疫霉转化体系构建 PsEctC 基因过表达转化子和 PpEctC 基因异源表达转化子。为了探究转化子中 EctC 基因的转录水平，针对 PsEctC 和 PpEctC 基因设计定量引物并对引物的特异性和扩增效率进行验证，结果发现，熔解曲线为单一峰，经测序验证扩增序列与目标序列相似度为 100%，这说明定量引物特异性良好。所有引物的扩增效率在 90%~110%，相关系数>0.98，说明定量引物扩增效率良好（图2A、B）。所有定量引物均扩增出与预期大小一致的单一条带（图2C）。对转化子进行 qRT-PCR 分析发现，在 Ps-hePpEctC 转化子中检测到 PpEctC 基因的转录，而 WT 和 CK 中未见转录，且 PpEctC 基因的转录未影响自身 PsEctC 基因的转录（图3A）。 Ps-oeEctC 转化子中 PsEctC 基因的转录水平显著高于 WT、CK 和 PpEctC 异源表达菌株（图3B）。分别选择PsEctC 和 PpEctC 转录水平最高的过表达转化子和异源表达转化子用于后续实验。
2.2 转化子生长发育表型分析
为评估 PpEctC 在病原生长发育过程中的作用，对转化子的菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子产量进行了观察（图4A）。统计结果显示，PsΔEctC-RFP [（43.38±0.59）mm] 的菌落直径显著小于 WT [（45.01±0.51）mm]，而 WT 与 CK [（44.05±0.88）mm]、 PsΔEctC-PpEctC [（44.99± 0.67）mm]、Ps-oePsEctC [（44.91±0.90）mm]和 Ps-hePpEctC [（45.75±0.52）mm] 无显著差异（图4B）。此外，除 PsΔEctC-PpEctC 游动孢子产量显著低于 PsΔEctC-RFP 外，各转化子在孢子囊形成和游动孢子产量无显著差异（图4C、D）。
2.3 转化子对胁迫耐受能力分析
转化子在盐度和 pH 胁迫条件下的菌落生长情况见图5A，比较发现，在 2 0 盐度的胁迫下， PsΔEctC-RFP 转化子的相对生长与 WT 和 CK 无显著差异，而 PsΔEctC-PpEctC 显著高于 PsΔEctC-RFP，且显著低于 Ps-oePsEctC 和 Ps-hePpEctC（图5B）；在 35 盐度的胁迫下，PsEctC 缺失转化子的相对生长显著低于 WT 和 CK，而 PpEctC 回补后转化子与 WT 和 CK 无显著差异。此外，过表达 PsEctC 和异源表达 PpEctC相对生长显著高于 WT 和 CK（图5C）；在 pH 3 条件胁迫下，各转化子的相对生长无显著差异（图5D）；在 pH 9 胁迫下，除 PsΔEctC-RFP 显著低于 WT 和 CK 外，其余转化子相对生长无显著差异（图5E）。
图2EctC 基因 qRT-PCR 引物特异性和扩增效率分析
Fig.2Analysis of qRT-PCR primer specificity and amplification efficiency for the EctC gene
A、B：PsEctC（A）和 PpEctC（B）引物的熔解曲线；C：琼脂糖凝胶电泳检测定量后产物，结果显示各引物均扩增出单一且符合预期大小的条带，表明引物具有良好特异性。泳道 M：DL2000 marker；泳道 1：PpEctC 引物定量紫菜腐霉 cDNA； 泳道 2：PsEctC 引物定量大豆疫霉 PpEctC 异源表达株 cDNA；泳道 3：PpEctC 引物定量大豆疫霉 PpEctC 异源表达株 cDNA。
A, B: Melting curves of PsEctC (A) and PpEctC (B) primers; C: Agarose gel electrophoresis of the qPCR products showed that each primer pair yielded a single band of the expected size, indicating good primer specificity. Lane M: DL2000 DNA marker; lane1: qPCR product amplified with the PpEctC primers using Pythium porphyrae cDNA; lane2: qPCR product amplified with the PsEctC primers using cDNA from the Phytophthora sojae strain heterologously expressing PpEctC; lane3: qPCR product amplified with the PpEctC primers using cDNA from the P. sojae strain heterologously expressing PpEctC.
图3过表达和异源表达转化子 EctC 基因的 qRT-PCR 分析（平均值±标准差，n=3）
Fig.3qRT-PCR analysis of EctC gene expression in overexpression and heterologous expression transformants (Mean±SD, n=3)
A：qRT-PCR 分析 PpEctC 基因在异源表达转化子中的转录；B：qRT-PCR 分析 PsEctC 基因在过表达和异源表达转化子中的转录。WT：大豆疫霉 P6497；CK：空载体对照；Ps-hePpEctC：异源表达株；Ps-oeEctC：EctC 过表达株。不同字母表示样本间存在显著性差异（P≤0.05），下同。
A: Transcriptional analysis of PpEctC in the heterologous expression transformant; B: Transcriptional analysis of PsEctC in the overexpression and heterologous expression transformants: WT: Phytophthora sojae P6497; CK: empty vector control; Ps-hePpEctC: heterologous expression strain; Ps-oeEctC: EctC overexpression strain. Different letters above the bars indicate significant differences among samples (P≤0.05) . The same below.
2.4 转化子致病力分析
为了探究 PpEctC 在病原致病过程中的作用，进行了侵染实验。将不同转化子游动孢子侵染大豆黄化幼苗下胚轴 2 d 后，拍照记录病症（图6A）并测定病原在宿主中的相对生物量。结果显示，PsΔEctC-RFP 侵染组的相对病原生物量最小，而 PsΔEctC-PpEctC 相对生物量显著大于 PsΔEctC-RFP，但仍显著小于 WT 和 CK（图6B）。 Ps-hePpEctC 侵染后的相对病原生物量显著高于 WT 和 CK，且 Ps-oePsEctC 组显著低于 Ps-hePpEctC（图6B）。
图4转化子生长发育表型分析
Fig.4Phenotypic analysis of growth and development in Phytophthora sojae transformants
A：转化子的菌落与孢子囊形态观察；B：转化子菌落直径测量；C：转化子孢子囊数量统计；D：转化子游动孢子产量统计。 WT：大豆疫霉 P6497；CK：空载体对照；Ps-oePsEctC：EctC 过表达株；Ps-hePpEctC：异源表达株；PsΔEctC-RFP：EctC 敲除株；PsΔEctC-PpEctC：异源补回株。柱状体与误差线代表5 个生物学重复的 3 次独立实验的平均值±标准差。
A: Colony morphology and sporangium structure of the transformants. B: Measurement of colony diameters. C: Quantification of sporangium numbers. D: Determination of zoospore production. WT: P. sojae P6497; CK: empty vector control; Ps-oePsEctC: EctC overexpression strain; Ps-hePpEctC: heterologous expression strain; PsΔEctC-RFP: EctC knockout strain; PsΔEctC-PpEctC: heterologous complementation strain. Bars represent the Mean±SD of three independent experiments with five biological replicates each.
2.5 转化子抗氧化能力分析
不同转化子抗氧化能力测定结果显示，Ps-oeEctC 和 Ps-hePpEctC 的抗氧化能力显著高于 WT 和 CK（P<0.05），且 Ps-hePpEctC 显著高于 Ps-oeEctC（图7）。此外，PsΔEctC-RFP 的抗氧化能力显著下降，而回补 PpEctC 后转化子抗氧化能力一定程度恢复，但仍显著低于 WT 和 CK。
3 讨论
四氢嘧啶是微生物应对环境胁迫产生的重要代谢物，而 EctABC 基因簇（四氢嘧啶基因簇，包括编码 L-2，4-二氨基丁酸乙酰转移酶的 EctA、编码 L-2，4-二氨基丁酸转氨酶的 EctB 以及编码四氢嘧啶合成酶的 EctC 基因）是四氢嘧啶合成的关键。如，在 H. elongata 中通过敲除 EctA 基因可完全丧失四氢嘧啶的合成能力（Grammann et al，2002）；在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）中 EctB 基因缺失会使细胞无法合成四氢嘧啶并导致高盐条件下生长受阻（Naughton et al，2009）；在重组大肠杆菌（Escherichia coli）中提高 EctC 基因的表达水平则显著提升四氢嘧啶产量（Naeem et al，2024）。然而，这些基因在真核微生物中的功能尚不清晰。本研究利用大豆疫霉转化体系成功构建了四氢嘧啶合成关键酶基因 PsEctC 的敲除和 PpEctC 异源回补、PsEctC 过表达和 PpEctC 异源表达转化子，表型分析发现 PpEctC 可能在病原生长、应对胁迫和致病过程中发挥重要作用，且与陆地卵菌 EctC 基因功能存在同源性。
图5转化子抗胁迫能力分析
Fig.5Analysis of stress tolerance in Phytophthora sojae transformants
A：转化子在不同培养条件下培养 4 d 的菌落形态；B~E：转化子在盐度 20（B）、盐度 35（C）、酸性 pH3（D）和碱性 pH9（E）胁迫下的相对生长量统计。WT：大豆疫霉 P6497；CK：空载体对照；Ps-oePsEctC：EctC 过表达株； Ps-hePpEctC：异源表达；PsΔEctC-RFP：EctC 敲除株；PsΔEctC-PpEctC：异源补回株。转化子在各胁迫条件下黑暗培养 4 d 后测定菌落直径，以各转化子在正常条件下的菌落直径为基准计算相对生长率。柱状体和误差线表示 3 个生物学重复在 3 次独立实验的平均值±标准差。
A: Colony morphology of transformants cultured for 4 days under different growth conditions. B~E: Relative growth of transformants under salinity stress at 20 (B) , 35 (C) , acidic pH 3 (D) and alkaline pH 9 (E) . WT: P. sojae P6497; CK: empty vector control; Ps-oePsEctC: EctC overexpression strain; Ps-hePpEctC: heterologous expression strain; PsΔEctC-RFP: EctC knockout strain; PsΔEctC-PpEctC: heterologous complementation strain. Transformants were cultured in darkness for 4 days under each stress condition, and colony diameters were measured. Relative growth rate was calculated based on the colony diameter of each transformant under normal conditions. Bars represent the Mean±SD of three independent experiments with three biological replicates each.
图6大豆疫霉转化子的致病力分析
Fig.6Pathogenicity analysis of Phytophthora sojae transformants
A：大豆下胚轴接种不同转化子的症状。照片拍摄于接种后第 2 天，比例尺= 1 cm；B：转化子侵染后的相对生物量比较。 WT：大豆疫霉 P6497；CK：空载体对照；Ps-oePsEctC：EctC 过表达株；Ps-hePpEctC：异源表达株；PsΔEctC-RFP：EctC 敲除株；PsΔEctC-PpEctC：异源补回株。柱状体和误差线表示 3 个生物学重复在 3 次独立实验的平均值±标准差。
A: Symptoms on soybean hypocotyls inoculated with different transformants. Photographs were taken 2 days post-inoculation. Scale bar = 1 cm. B: Comparison of relative biomass in infected tissues among transformants. WT: P. sojae P6497; CK: Empty vector control; Ps-oePsEctC: EctC overexpression strain; Ps-hePpEctC: Heterologous expression strain; PsΔEctC-RFP: EctC knockout strain; PsΔEctC-PpEctC: Heterologous complementation strain. Bars represent the Mean±SD of three independent experiments with three biological replicates each.
3.1 PpEctC 基因与卵菌生长相关
四氢嘧啶作为一种富氮物质常被微生物作为氮源、碳源或能量源使用，在其生长中发挥重要作用。如，嗜盐菌（Chromohalobacter salexigens）能够利用四氢嘧啶作为唯一碳源和能源来支持生长（Vargas et al，2006）。Schulz 等（2017）发现，非致病细菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）在氮源缺乏条件下，通过四氢嘧啶水解酶将四氢嘧啶转化为可用氮源，支持细菌的生长和代谢。在红曲霉中外源添加四氢嘧啶可加速菌体生长、提高孢子产量，并影响次级代谢产物的合成。此外，将细菌 EctABC 基因转入红曲霉中获得的自主合成四氢嘧啶菌株，其生长速率和产孢能力提升，效应与添加外源四氢嘧啶相当（Gong et al，2023）。本研究发现，大豆疫霉 PsEctC 缺失后转化子菌落显著小于 WT，而回补 PpEctC后转化子与 WT无显著差异（图4B），这说明 PpEctC 参与病原菌丝的生长。此外， PsΔEctC-PpEctC 游动孢子产量显著低于 PsΔEctC-RFP，这可能是由于不同物种间基因调控或蛋白质结构的差异导致表达水平不足导致（Yang et al，2025）。其余转化子在孢子囊形成和游动孢子产量无显著差异（图4C、D），这说明 PpEctC 对病原孢子囊形成和游动孢子产生无影响。
图7大豆疫霉转化子的总抗氧化能力分析（平均值±标准差，n=3）
Fig.7Total antioxidant capacity (T-AOC) analysis of Phytophthora sojae transformants (Mean±SD, n=3)
WT：大豆疫霉 P6497；CK：空载体对照；Ps-oePsEctC： EctC 过表达株；Ps-hePpEctC：异源表达株；PsΔEctC-RFP： EctC 敲除株；PsΔEctC-PpEctC：异源补回株。
WT: P. sojae P6497; CK: empty vector control; Ps-oePsEctC: EctC overexpression strain; Ps-hePpEctC: heterologous expression strain; PsΔEctC-RFP: EctC knockout strain; PsΔEctC-PpEctC: heterologous complementation strain.
3.2 PpEctC 基因在病原抗逆中发挥重要作用
四氢嘧啶是微生物抵御渗透胁迫的重要代谢物（邢庆花等，2021）。如，嗜盐菌（Salinivibrio costicola subsp. yaniae）在缺失四氢嘧啶合成基因后丧失了在高盐条件下生长的能力（Zhu et al，2008）。嗜盐菌（Halomonas sp. QHL1）的 EctABC 基因簇异源表达于大肠杆菌 BL21（DE3）后提高了其抵御渗透胁迫的能力（Zhu et al，2014）。本研究发现，PsEctC 缺失后显著降低了病原应对高渗胁迫的能力，而回补 PpEctC 后病原的抗高渗胁迫能力与野生株无显著差异（图5C）。此外过表达 PsEctC 和异源表达 PpEctC 均显著提高病原抵抗胁迫的能力（图5）。以上结果说明 PpEctC 在病原应对高渗胁迫中发挥重要作用。
在 pH 胁迫时，微生物常通过积累四氢嘧啶来保护细胞内环境的稳定。如，嗜盐菌（Halomonas sp. NEC-1）能在 pH 5~11 范围内生长，在 pH 胁迫条件下显著积累四氢嘧啶，并伴有 EctABC 合成基因簇表达上调（Ma et al，2025）。耐盐芽胞杆菌（Bacillus halodurans）产生的木聚糖酶在极低 pH（约 4.5）和极高 pH（约 11~12）条件下，通过外源添加四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶后酶活性显著提高，证明了四氢嘧啶在 pH 胁迫下对蛋白质功能具有明显的保护作用（van Thuoc et al，2013）。在从发酵虾酱中分离的嗜盐细菌中，四氢嘧啶的积累随着外部初始 pH 值的升高而显著增加，从而保护细胞稳态，增强对 pH 变化的适应能力（van Thuoc et al，2021）。本研究发现，在碱性 pH 9 胁迫条件下，除缺失 EctC 的转化子 PsΔEctC-RFP 明显低于 WT 和 CK 外，其余转化子的相对生长率同样没有显著差异（图5E），表明 PpEctC 在病原应对碱性环境胁迫中发挥重要作用。
3.3 PpEctC 基因通过调节病原抗氧化能力参与致病
植物通过产生活性氧（ROS）破坏病原细胞膜结构、氧化蛋白质和核酸，从而抑制病原菌的生长和侵染能力（Torres et al，2006）。拟南芥叶片在遭受灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染后，迅速产生大量 ROS 作为防御反应（van Thuoc et al，2021）。稻米在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵入时通过上调氧化酶提高叶片中 ROS 水平，从而抑制病原菌侵入宿主细胞（Lee et al，2020）。四氢嘧啶在氧化胁迫中能通过清除自由基、稳定膜结构与蛋白质构象、增强细胞抗氧化系统，从而有效减轻活性氧（ROS）造成的损伤，提升细胞在不利环境下的生存能力（Bownik et al，2016）。Bownik 等（2015）发现，当水蚤暴露于 H2O2 诱导的氧化胁迫时，添加四氢嘧啶可显著降低死亡率。这说明病原可能通过产生四氢嘧啶耐受宿主活性氧暴发从而完成侵染。本研究发现，缺失 PsEctC 基因后，病原的抗氧化能力显著下降（图7），表明四氢嘧啶合成能力受损会削弱其应对活性氧的能力；过表达 PsEctC 或异源表达 PpEctC 均能显著提升病原的抗氧化水平，其中异源表达 PpEctC的提升效果更为显著（图7）。此外，在 PsEctC 缺失背景下回补 PpEctC 基因，抗氧化能力有所恢复，但仍低于野生型和对照菌株（图7）。这说明 PpEctC 通过调控四氢嘧啶的合成增强了病原在活性氧胁迫下的生存能力，在其抵御宿主免疫压力的过程中可能发挥关键作用。
综上所述，本研究利用大豆疫霉转化体系探究了紫菜腐霉四氢嘧啶合成关键基因 PpEctC 的功能，发现其可能通过影响病原生长、抵抗高渗、pH 和氧化胁迫能力而参与致病过程。后续研究将在进一步建立紫菜腐霉转化体系的基础上探究 PpEctC 的功能，为基于病原抗逆的病害防控策略开发奠定基础。
附表1 本实验所用引物
Supplementary Tab.1 Primers used in this study
