随着全球对虾养殖产业的不断发展，其病害也日趋严重，给养殖户造成了严重的经济损失(Nakano et al, 1994; Wongteerasupaya et al, 1995; Karunasagar et al, 1997)。据Nakano等(1994)不完全统计，自20世纪90年代白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)病害暴发以来，出现了大幅度的上升趋势，并且已经成为遏制养殖产业健康发展的致命点(蔡生力等, 1995; Lo et al, 1999; Flegel, 1997)。探究对虾病害的流行变异特点和规律，显得愈发重要和突出。

引起全球范围对虾病害暴发，并导致巨大经济损失的主要病因为病毒类疾病。到目前为止，在已经发现的数十种病毒中，白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)造成的灾害最为严重。WSSV可感染40余种甲壳纲动物以及水生浮游动物，在全球养殖区均有流行，它是一种大型、双链、环状的DNA病毒，其基因组大小约为300 kb，隶属于线头病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)(Marks et al, 2005; Mayo, 2002)。

同已经在GenBank上公布的中国株(WSSV-CN)、台湾株(WSSV-TW)和泰国株(WSSV-TH)基因组全序列相比较，发现有约99%的核苷酸保持一致性(于力等, 2008; Marks et al, 2004)。虽然多数基因高度保守，但在有些位点上会出现差异，主要表现在大片段插入/缺失、单核苷酸替换和在开放性阅读框(Open Reading Frames, ORFs)出现的重复序列单元数目的差异(Variable Number Tandem Repeat, VNTR) (van Hulten et al, 2001; Yang et al, 2001)。WSSV毒株间最大的差异往往表现在ORF75、ORF94和ORF125 VNTR区的变化，VNTR已被应用于WSSV分子流行病学的研究(Gudkovs et al, 2014; Dieu et al, 2004; Musthaq et al, 2006; 于洪涛, 2008¹⁾)。

1) 于洪涛. 中国境内白斑综合征病毒(WSSV)分离株的序列差异分析. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2008, 32−63

本研究对中国境内2014年1−8月病害暴发期间采集到的48份WSSV阳性样本，进行ORF75、ORF94和ORF125重复片段的VNTR分析，以此获取2014年WSSV病毒ORF75、ORF94和ORF125重复片段变化情况。

实验用患病样本取自中国各地2014年1−8月间出现发病症状的养殖池(表 1)。所有样本采集后置于−20℃保存备用。

表 1(Tab. 1)

表 1 WSSV样本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125重复数 Table 1 WSSV samples and repeat units (RUs) present in ORF75, ORF94 and ORF125 序号 No. 采集时间编号 Date No. 产地/来源Source 品种Species 75 RU (45 bp) 75 RU (102 bp) 94 RU (54 bp) 125 RU (69 bp) 1 140104001 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei – – 14 – 2 140104002 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei 8 2 – 5 3 140104003 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei 8 2 – 5 4 140104004 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 日本囊对虾M. japonicus – – – 5 5 140104005 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 日本囊对虾M. japonicus 8 2 – 5 6 140104006 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 日本囊对虾M. japonicus 8 2 – 5 7 140104007 河北曹妃甸Caofeidian, Hebei 日本囊对虾M. japonicus 8 2 – 5 8 140409002 浙江宁波Ningbo, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 9 140416001 山东即墨Jimo, Shandong 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 10 140418001 山东日照Rizhao, Shandong 日本囊对虾M. japonicus – – – – 11 140418010 江苏如东Rudong, Jiangsu 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 12 140418013 江苏赣榆Ganyu, Jiangsu 中国明对虾F. chinensis – – 14 7 13 140418014 江苏赣榆Ganyu, Jiangsu 脊尾白虾E. carinicauda 8 3 14 7 14 140418015 江苏如东Rudong, Jiangsu 三疣梭子蟹P. trituberculatus – – 14 7 15 140419001 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 16 140419002 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 17 140419003 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 18 140419004 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 19 140419005 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 20 140419009 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 21 140419010 浙江湖州Huzhou, Zhejiang 罗氏沼虾M. rosebergii – – – – 22 140422002 辽宁Liaoning 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 23 140422003 辽宁Liaoning 中国明对虾F. chinensis – – 14 – 24 140428002 福建厦门Xiamen, Fujian 凡纳滨对虾L. vannamei 3 1 14 3 25 140428003 福建漳浦Zhangpu, Fujian 凡纳滨对虾L.vannamei – – – 3 26 140508001 山东青岛Qingdao, Shandong 凡纳滨对虾L. vannamei – – – 3 27 140522002 江苏南京Nanjing, Jiangsu 克氏原螯虾P. clarkii 11 2 – 3 28 140522003 江苏南京Nanjing, Jiangsu 克氏原螯虾P. clarkii 9 3 4 6 29 140522004 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 30 140522005 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 31 140522006 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 32 140522007 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 33 140522008 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 34 140522009 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei 9 3 4 6 35 140522010 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 36 140522011 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 37 140522012 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 38 140522014 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 39 140522015 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 40 140522016 浙江温州Wenzhou, Zhejiang 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 6 41 140625002 广东湛江Zhanjiang, Guangdong 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 42 140625008 广东江门Jiangmen, Guangdong 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 43 140716007 山东青岛Qingdao, Shandong 凡纳滨对虾L. vannamei – – – – 44 140801003 河北黄骅Huanghua, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei 3 1 – 0 45 140801004 河北黄骅Huanghua, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei – – – 0 46 140801005 河北黄骅Huanghua, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei – – – 0 47 140801006 河北黄骅Huanghua, Hebei 凡纳滨对虾L. vannamei – – 4 0 48 140801007 河北黄骅Huanghua, Hebei 中国明对虾F. chinensis 3 1 – 0 -.未检出；-. Not detected

表 1 WSSV样本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125重复数 Table 1 WSSV samples and repeat units (RUs) present in ORF75, ORF94 and ORF125

取约30 mg鳃组织，按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)的说明书进行DNA提取。对WSSV DNA样本的检测采用GB/T28630的套式PCR方法。PCR产物通过用1×TBE电泳缓冲液配制的1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

将所有WSSV核酸样本进行ORF75、ORF94和ORF125的PCR扩增。主要混合物与体积在3种PCR扩增中均一致：10× PCR反应缓冲液(含Mg²⁺) 2.5 μl，双蒸水17.3 μl，脱氧核酸混合物2 μl，正向与反向引物各0.5 μl，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μl，WSSV模板1 μl，总体积为25 μl。PCR扩增中使用的引物与反应条件见表 2 (Dieu et al, 2004; 于洪涛等, 2008¹⁾; Kathy et al, 2013; Wongteerasupaya et al, 2003)。

1)于洪涛.中国境内白斑综合征病毒(WSSV)分离株的序列差异分析. 中国海洋大学硕士研究生学位论文, 2008, 32-63

表 2(Tab. 2)

表 2 PCR扩增引物与反应条件 Table 2 PCR primers and cycling conditions 引物 Primer 序列 Sequence 预变性 Pre-denaturation PCR条件 PCR cycling conditions 延伸 Extension ORF-75F ORF-75R CTTTCACCGCTCTCA GGGTTCACCAGAGAGACAGG 94℃ 5 min 35 cycles：94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 2 min 72℃ 7 min ORF-94S ORF-94A CTGGGTGGCATCGGTTAG CGTCACTTTCGTGCGTAGT 94℃ 5 min 35 cycles：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min 72℃ 7 min ORF-125F ORF-125R CGAAATCTTGATATGTTGTGC CCATATCCATTGCCCTTCTC 94℃ 5 min 35 cycles：94℃ 30s，54℃ 30 s，72℃ 1 min 72℃ 7 min

表 2 PCR扩增引物与反应条件 Table 2 PCR primers and cycling conditions

VNTR扩增后的PCR产物用胶回收试剂盒获得纯化目的片段DNA，用NanoDrop 2000测得DNA浓度后，通过pMD^®18-T Vector连接转化后的菌液送至上海生工进行测序。采用DNAMAN软件分析ORF75、ORF94和ORF125重复单元数目的差异。

在WSSV病害暴发区采集到的48份样本中，共有6份在第1轮检测中出现阳性条带，其余42份样本均在第2轮检测中出现阳性条带。

在48份WSSV样本中，3次PCR扩增均仅有部分地区的样本可检出。其中，共有12份(2#、3#、5#、6#、7#、13#、24#、27#、28#、34#、44#、48#)出现ORF75检测条带，未检出的有36份，包括山东即墨、日照、青岛，浙江宁波、湖州，江苏如东，辽宁，福建漳浦，广东湛江、江门的样本。ORF75的检出率为25.0%，其中，24#、44#与48#样本扩增条带比其他样本扩增条带略小(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 ORF75扩增 Figure 1 Amplification of ORF75 M: DNA Marker DL2000；+：阳性对照；-：阴性对照；1-48：样本编号 M: DNA Marker DL2000; +: Positive control; -: Negative control; 1-48: No. of samples

PCR扩增ORF94共有18个样本(1#、12#、13#、14#、23#、24#、28#、29#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、40#、47#)出现检测条带，有30份样本未检出，包括山东即墨、日照、青岛，浙江宁波、湖州，福建漳浦，广东湛江、江门的样本。ORF94检出率为37.5%，其中，前6个样本与之后的条带相比，扩增片段略大(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 ORF94扩增 Figure 2 Amplification of ORF94 M: DNA Marker DL2000；+：阳性对照；-：阴性对照；1-48：样本编号 M: DNA Marker; +: Positive control; -: Negative control; 1-48: No. of samples

ORF125的PCR扩增中，共有28份(2#、3#、4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#、24#、25#、26#、27#、28#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、36#、37#、40#、44#、45#、46#、47#、48#)样本出现条带，未检出的样本主要来自山东即墨、日照，浙江宁波、湖州，辽宁，广东湛江、江门。检出率为58.3%，其中，样本24#、25#较之其他样本的扩增片段略小(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 3 ORF125的扩增 Figure 3 Amplification of ORF125 M: DNA Marker DL2000；+：阳性对照；-：阴性对照；1-48：样本编号 M: DNA Marker DL2000; +: Positive control, -: Negative control; 1-48: No. of samples

ORF75主要扩增出6种不同大小的片段，分别为2205 bp (河北曹妃甸)、2308 bp (江苏赣榆)、2013 bp (福建厦门)、2431 bp (江苏南京)、2352 bp (江苏南京、浙江温州)和1738 bp (河北黄骅)，将测得的目的片段与重复单元序列比对，结果显示，45 bp的75RU数目对应为8、8、4、11、9和3，而102 bp的75 RU数目对应为2、3、1、2、3和1。在ORF94的扩增中，主要有两种不同大小的片段，902 bp (河北曹妃甸、江苏赣榆和如东、辽宁、福建厦门)和519 bp (江苏南京、浙江温州、河北黄骅)，其中的重复单元数目分别为14和4。而对于ORF125的扩增，扩增出的片段长度有720 bp (河北曹妃甸)、851 bp (江苏赣榆、如东)、633 bp (福建厦门、漳州)、726 bp (山东青岛、江苏南京)、789 bp (江苏南京、浙江温州)以及812 bp (河北黄骅)，其中的重复单元数目对应为5、7、3、3、6和0 (表 1)。

本研究分析2014年采集的48份WSSV检测阳性样本，样本涉及从北向南分布的7个省份，即辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建和广东，样本采集时间为当地白斑病暴发期间。ORF75、ORF94和ORF125可扩增出来的概率分别为25.0%、37.5%和58.3%，但不同地区、不同样本之间还是存在明显的差异，其中，浙江的湖州、宁波，广东的湛江、江门，山东的即墨、日照地区的样本3种重复单元均未扩增出，并且一致性较高。仅在江苏的赣榆、南京部分样本和福建厦门地区的样本中，3种重复单元序列同时被扩增出。其他地区的样本有1个或者两个ORFs可以被扩增出来，但不同样本之间差异性较大。

在各地区样本的ORF75中，重复单元数目差异比较明显，在ORF75中或许存在相对活跃的变异位点或者序列，江苏南京的样本中含有的重复片段最多，且南京样本之间也有差异，而河北黄骅样本含有的重复片段最少，推测是由于DNA序列缺失较多；从ORF94的扩增结果中可以看出，仅存在两种重复单元数目，序列相对比较保守；在ORF125的扩增结果中，出现了4种重复单元数目，在这4种情况中，福建厦门、漳浦、山东青岛和江苏南京的样本序列中重复片段较之其他样本有差异，且其片段偏小，河北黄骅的样本中，片段大小虽有812 bp，但却无重复片段，猜测此样本序列有很大程度的变异。

在Kathy等(2013)对非洲马达加斯加岛、莫桑比亚和沙特阿拉伯王国地区采集的13个样本进行的研究中发现，3个地区ORF75的重复单元数目均为3，没有出现差异的情况；而ORF94大多数序列缺失，仅有沙特阿拉伯地区的两个样本出现了重复单元数目，分别为7和13；ORF125的重复单元数目为6、7、8不等(Kathy et al, 2013)。Gudkovs等(2014)研究表明，ORF94的重复单元数目在海水与淡水虾类及淡水鳌虾中也有相对的稳定性。然而，在Waikhom等(2006)的实验中却显示，在相同或不同对虾物种以及其他少量敏感甲壳纲动物宿主的不同株中，表现出了ORF94的不稳定性(Sindhuprriya et al, 2014; Waikhom et al, 2006)。通过实验研究，发现3种ORFs的重复单元数目并不确定，出现了隔离区上的差异，不同地区之间的差异性比较明显，推测这可能与不同WSSV毒株的致病力强弱有关。

不同WSSV毒株在核苷酸序列上的差异必然会造成开放性阅读框和蛋白编码的改变，差异序列的存在，可能会使病毒自身更适应环境，更利于自身复制并建立感染。因此，为了更好地做好病害的防御工作以及确保养殖产业的健康发展，研究WSSV不同毒株之间的核苷酸序列差异，可为WSSV的流行病学研究提供重要的参考依据。