大银鱼(Protosalanx hyalocranius)为1年生的小型鱼类，隶属于胡瓜鱼目(Osmeriformes)、银鱼科(Salangidae)、大银鱼属(Protosalanx)，对环境变化反应敏感，是典型的r-选择物种(王忠锁等, 2002)。大银鱼广泛分布于我国钱塘江河口、长江口、长江下游湖泊及黄海、渤海沿岸河口和朝鲜西海岸，为近海河口洄游或淡水定居鱼种。大银鱼肉味鲜美，营养丰富，经济价值较高，曾经是我国重要的出口创汇水产品。近年来，由于环境污染、过度捕捞、水利工程以及生境破碎化等多种因素的影响，大银鱼的种群数量急剧下降，天然资源已逐渐枯竭(王忠锁等, 2002)。因此，开展大银鱼资源保护已经迫在眉睫。

鱼类遗传多样性的研究一方面能够掌握渔业种质资源遗传多样性现状，另一方面可以为渔业资源的可持续发展提供重要的科学依据。鱼类线粒体DNA (mtDNA)是遗传物质的主要载体，具有进化速率快、严格的母系遗传和几乎无重组等特点，是揭示群体遗传多样性及遗传结构的理想材料(吕国庆等, 1998)。线粒体细胞色素b (Cytochrome b, Cytb)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome c oxidase subunitⅠ, COⅠ)基因序列具有进化速度较快、易扩增等优点，适用于种群水平遗传多样性的检测，已被广泛地应用于鱼类等水生生物的系统学和种群遗传学研究中(孙鹏等, 2011; 胡静等, 2014; 李大命等, 2015a)。

洪泽湖面积为1597 km²，是江苏省第二大湖泊，也是我国第四大淡水湖泊(朱松泉等, 1993)。洪泽湖渔业资源丰富，对湖区经济发展具有重要作用(王欣等, 2008)。在20世纪六七十年代，洪泽湖大银鱼资源非常丰富，每年都形成大规模的银鱼鱼汛，创造了巨大的经济效益(江苏省地理研究所等, 1977)。近年来，洪泽湖大银鱼天然资源量急剧下降，已无法形成有效的捕捞群体。有关洪泽湖大银鱼的研究主要集中在生长、摄食、繁殖及增殖等生物学方面(江苏省地理研究所湖泊室洪泽湖银鱼增殖研究课题组, 1975; 张开翔等, 1981; 林明利等, 2013)。张颖(2005)¹⁾和薛丹(2015)²⁾采用分子生物学技术探究了我国不同地理分布大银鱼群体的遗传多样性及遗传结构，而有关洪泽湖大银鱼的遗传学特征则尚未见报道。本研究通过对洪泽湖大银鱼的Cytb和COⅠ序列片段进行扩增、测序，分析其遗传多样性及遗传结构，不仅有利于丰富我国大银鱼的遗传学资料，同时可为洪泽湖大银鱼资源的保护及合理利用提供一定的参考。

1) Zhang Y. The study on the genetic diversity of Protosalanx hyalocranius. Master's Thesis of Tianjin Normal University, 2005, 1-63 [张颖.大银鱼遗传多样性的研究.天津师范大学硕士研究生学位论文, 2005, 1-63]

2) Xue D. Genetic diversity of 9 populations of Protosalanx hyalocranius in China based on Cyt b sequences. Master's Thesis of Jinan University, 2015, 1-53 [薛丹.基于细胞色素b的中国9个大银鱼群体遗传多样性研究.暨南大学硕士研究生学位论文, 2015, 1-53]

2015年8月从洪泽湖的韩桥水域(33°24'05''N, 118°41'20''E)采集40尾大银鱼样本，体长在3.5-7.0 cm之间(平均值为5.2 cm)，体重在0.1562-0.7680 g之间(平均值为0.4375 g)。剪取大银鱼尾鳍，放入无水乙醇中保存，带回实验室备用。

剪取大银鱼尾鳍组织约100 mg，装入1.5 ml离心管，剪碎。采用广谱性基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa, 日本)提取大银鱼基因组DNA，将DNA溶于200 μl TE溶液中，置于-20℃保存备用。

本研究中，Ctyb扩增和测序引物为L14321 (5'-CCAGTGACTTGAAAAACCACCG-3')、H15634 (5'-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGGT-3')(Zhang et al, 2007)。COⅠ扩增和测序引物为F1(5'-TCAACC-AACCACAAAGACATTGGCAC-3')、R1 (5'-TAGACT-TCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3') (Ward et al, 2005)。PCR反应总体积均为50 μl，其中10×PCR Buffer (含Mg²⁺) 5 μl，Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.4 μl，dNTP (各2.5 mmol/L) 4 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，DNA模板2 μl (50 ng/μl)，ddH₂O补足体积。PCR扩增反应程序均为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸90 s(Cytb)或50 s(COⅠ)，30个循环，72℃最后延伸10 min。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，经DNA胶回收试剂盒(TaKaRa, 日本)纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。为保证所测序列的准确性，所有样品均采用双向测序。

所得序列用ClustalX软件进行编辑、校对和排序(Thompson et al, 1997)。用DnaSP4.10分析软件(Rozas et al, 2003)计算多态位点数目(Number of polymorphic sites)、单倍型数目(Number of haplotypes)、单倍型多样性(Haplotype diversity)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity)和平均碱基差异数(Average number of nucleotide differences)。用MEGA 4.0软件(Tamura et al, 2007)统计碱基组成，并基于Kimura双参数模型计算单倍型之间的遗传距离。以太湖新银鱼(Neosalanx taihuensis)的同源序列(GenBank登录号为JX524196.1)作为外群，采用邻接法(Neighbor-joining method, NJ)分别构建Cytb和COⅠ基因单倍型系统进化树，进化树中节点的自举置信度水平由自引导值(Bootstrap value)估计，共1000次循环。

用Fu’s F_s中性检验和核苷酸不配对分布(Mismatch distribution)检测洪泽湖大银鱼种群的历史动态。

经PCR扩增、测序和校对，获得洪泽湖大银鱼线粒体Cytb基因全长序列，其长度为1141 bp。40条Ctyb基因同源序列包含6个变异位点，其中有4个简约信息位点，2个单一信息位点。碱基A、T、G和C的平均含量分别为21.7%、29.3%、16.7%和32.3%，其中A+T的含量(51.0%)略高于G+C含量(49.0%)。40条Ctyb基因序列定义了7个单倍型(Hb1-Hb7)，其中，单倍型Hb1数量最多(16个)，单倍型Hb2和Hb6数量最少，均只有1个。

经PCR扩增、测序和校对，获得洪泽湖大银鱼线粒体COⅠ基因序列片段，其长度为630 bp。40条COⅠ基因同源序列共有5处变异位点，其中，有4个简约信息位点，1个单一信息位点。碱基A、T、G和C的平均含量分别为21.6%、26.0%、19.2%和33.2%，其中，A+T的含量(47.6%)略低于G+C含量(52.4%)。40条COⅠ基因序列定义了6个单倍型(Hc1-Hc2)，其中，单倍型Hc3数量最多(17个)，单倍型Hc2数量最少(1个)。

采用DnaSP软件获得洪泽湖大银鱼的遗传多样性参数(表 1)。从表 1可以得出，Cytb基因单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.755±0.045和0.00129± 0.00010，碱基平均差异数为1.469；COⅠ基因单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.700±0.047和0.00207±0.00016，碱基平均差异数为1.303。结果显示，Cytb和COⅠ基因的遗传多样性水平均表现出较高的单倍型多样性和低的核苷酸多样性模式。

表 1(Tab. 1)

表 1 洪泽湖大银鱼遗传多样性参数 Table 1 Genetic diversity parameters of P. Hyalocranius population in the Hongze Lake 群体 Population 样本数 Sample number 基因 Gene 多态位点数 Polymorphic sites 单倍型数 Haplotypes number 单倍型多样性 Haplotype diversity 核苷酸多样性 Nucleotide diversity 碱基平均差异数 Average number of nucleotide differences 大银鱼 P. hyalocranius 40 Cytb 6 7 0.755±0.045 0.00129±0.00010 1.469 COⅠ 5 6 0.700±0.047 0.00207±0.00016 1.303

表 1 洪泽湖大银鱼遗传多样性参数 Table 1 Genetic diversity parameters of P. Hyalocranius population in the Hongze Lake

采用Mega软件分别计算Cytb和COⅠ基因单倍型之间的遗传距离。Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001-0.004之间(表 2)；COⅠ基因单倍型之间的遗传距离在0.002-0.005之间(表 3)。由此可以得出，洪泽湖大银鱼的Cytb和COⅠ基因单倍型之间的遗传距离较小。

表 2(Tab. 2)

表 2 大银鱼Cytb基因单倍型间的遗传距离(基于Kimura-2 parameter法) Table 2 Genetic distance of the haplotypes of Cytb of P. hyalocranius (by Kimura-2 parameter method) 单倍型 Haplotypes Hb1 Hb2 Hb3 Hb4 Hb5 Hb6 Hb7 Hb1 - Hb2 0.001 - Hb3 0.001 0.002 - Hb4 0.002 0.003 0.001 - Hb5 0.002 0.003 0.001 0.002 - Hb6 0.003 0.004 0.002 0.003 0.001 - Hb7 0.003 0.004 0.002 0.003 0.001 0.002 -

表 2 大银鱼Cytb基因单倍型间的遗传距离(基于Kimura-2 parameter法) Table 2 Genetic distance of the haplotypes of Cytb of P. hyalocranius (by Kimura-2 parameter method)

表 3(Tab. 3)

表 3 大银鱼COⅠ基因单倍型间的遗传距离(基于Kimura-2 parameter法) Table 3 Genetic distance of the haplotypes of COⅠ of P. hyalocranius (by Kimura-2 parameter method) 单倍型 Haplotypes Hc1 Hc2 Hc3 Hc4 Hc5 Hc6 Hc1 - Hc2 0.002 - Hc3 0.002 0.003 - Hc4 0.003 0.005 0.005 - Hc5 0.002 0.003 0.003 0.002 - Hc6 0.003 0.005 0.005 0.003 0.002 -

表 3 大银鱼COⅠ基因单倍型间的遗传距离(基于Kimura-2 parameter法) Table 3 Genetic distance of the haplotypes of COⅠ of P. hyalocranius (by Kimura-2 parameter method)

以太湖新银鱼作为外类群，采用NJ法构建了洪泽湖大银鱼Cytb和COⅠ基因单倍型的系统树(图 1和图 2)。由图 1和图 2可知，Cytb和COⅠ基因单倍型聚为一支，表明单倍型之间的遗传关系较近，这与Cytb和COⅠ基因单倍型之间的遗传距离(表 2和表 3)具有一致性。单倍型之间的遗传距离及系统进化树表明，洪泽湖大银鱼单倍型之间未出现遗传分化。

图 1(Fig. 1)

图 1 洪泽湖大银鱼Cytb基因单倍型的NJ系统发生树 Figure 1 Neighbor-joining tree of Cytb haplotypes in P. hyalocranius

图 1(Fig. 1)

图 2 洪泽湖大银鱼COⅠ基因单倍型的NJ系统发生树 Figure 2 Neighbor-joining tree of COⅠ haplotypes in P. hyalocranius

中性检验分析结果显示，Cytb和COⅠ基因的Fu’s F_s值均为负值，分别为-0.32836和-0.52548，但统计检验均不显著(P > 0.1)，显示种群偏离中性进化。碱基歧点分布(Mismatch distribution)分析图谱呈现单峰型(图 3、图 4)，中性检验和碱基歧点分布图均表明，洪泽湖大银鱼在历史上可能经历了种群扩张事件。

图 1(Fig. 1)

图 3 大银鱼mtDNA Cytb基因序列错配碱基分布 Figure 3 The distribution of mismatched bases in mtDNA Cytb gene sequences of P. hyalocranius

图 1(Fig. 1)

图 4 大银鱼mtDNA COⅠ基因序列错配碱基分布 Figure 4 The distribution of mismatched bases in mtDNA COⅠ gene sequences of P. hyalocranius

本研究基于线粒体DNA的Cytb和COⅠ基因序列探讨了洪泽湖大银鱼的遗传多样性。通过对Cytb和COⅠ基因分析得出序列的碱基组成呈现出不均一性，与鱼类线粒体DNA碱基组成具有一致性(孙鹏等, 2011; 胡静等, 2014)。其中，Cytb基因序列碱基A、T、G和C的平均含量分别为21.7%、29.3%、16.7%和32.3%，COⅠ基因序列碱基含量分别是21.6%、26.0%、19.2%和33.2%，2个基因序列中碱基G含量最低，C含量最高，表现出明显的偏倚性(张迪等, 2012; 罗旭光等, 2014)。另外，Cytb基因的A+T含量(51.0%)略大于G+C含量(49.0%)，而COⅠ基因片段的A+T含量(47.6%)略小于G+C含量(52.4%)，说明大银鱼线粒体DNA不同基因的A+T含量与G+C含量存在差异。

遗传多样性是指生物种内的遗传变异度，是生物适应环境与进化的基础。单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数是衡量一个物种群体多样性的两个非常重要的指标(Vrijenhoek, 1994)。本研究结果显示，基于Cytb和COⅠ基因序列的洪泽湖大银鱼单倍型多样性分别为0.755±0.045和0.700±0.047，核苷酸多样性分别为0.00129±0.00010和0.00207±0.00016，呈现出高单倍型多样性和低核苷酸多样性特征，与太湖和三峡水库的大银鱼及银鱼科其他种类的多样性特征具有一致性。比如，太湖大银鱼单倍型和核苷酸多样性分别为0.850±0.045和0.02960±0.00017(李大命等, 2015b)，三峡水库大银鱼的单倍型和核苷酸多样性分别为0.804±0.032和0.00146±0.00009(罗宏伟等, 2009)。大银鱼的遗传多样性特征显示，该类型鱼类群体可能经历过历史扩张事件，即由一个较小的有效群体在短时间内快速成长为一个大的群体(Grant, 1998)。本研究结果显示，Cytb和COⅠ基因的Fu’s F_s值为负值，且碱基歧点分布图谱呈现单峰型，均表明洪泽湖大银鱼历史上经历了种群扩张。在种群扩张的过程中，随着种群数量的增加，单倍型多样性会有所提高，但没有足够的时间来积累核苷酸产生的变异，因此，会造成单倍型多样性较高而核苷酸多样性较低的遗传多样性模式(Grant, 1998)。另外，Cytb基因单倍型高于COⅠ基因单倍型多样性，说明大银鱼中Cytb基因较COⅠ基因序列变异速率快，这与其他鱼类中的规律相似(毕潇潇等, 2009; 孙鹏等, 2011; 胡静等, 2014)。

已有研究结果显示，洪泽湖的太湖新银鱼单倍型和核苷酸多样性分别为0.686±0.039和0.0021±0.0003 (Zhao et al, 2008)，乔氏新银鱼(Neosalanx jordani)单倍型和核苷酸多样性分别为0.583±0.109和0.00067± 0.00017(赵亮等, 2010)。本研究的洪泽湖大银鱼的遗传多样性高于太湖新银鱼和乔什新银鱼，但低于太湖及三峡库区的大银鱼遗传多样(罗宏伟等, 2009; 李大命等, 2015b)。从整体来看，洪泽湖银鱼种质资源遗传多样性处于较低水平。一般来说，物种的遗传多样性高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。丰富的遗传多样性意味着较高的适应生存潜力、丰富的育种和遗传改良潜力。相反，物种遗传变异的减少可能导致严重的后果，如成活率、生长与繁殖效率变低，降低种群个体对环境变化的适应能力(Yang et al, 2007)。因此，需要加大洪泽湖银鱼资源保护力度，逐步恢复银鱼资源量，提高其遗传多样性，为洪泽湖银鱼资源可持续发展及利用奠定基础。

从单倍型间的遗传距离和NJ系统树可以看出，洪泽湖大银鱼单倍型之间的遗传距离非常低，且所有单倍型聚为一支，表明大银鱼种群内没有出现遗传分化。这表明洪泽湖大银鱼个体间不存在地理隔离，且有频繁的基因交流，导致大银鱼具有遗传同质性。同样地，太湖及三峡库区大银鱼群体的单倍型之间也具有相似规律(罗宏伟等, 2009; 李大命等, 2015b)。本研究表明，洪泽湖大银鱼单倍型组成有较大差异，比如，在Cytb基因的7个单倍型中，单倍型Hb1数量有16个，而单倍型Hb2和Hb6数量均只有1个；在COⅠ基因的6个单倍型中，单倍型Hc3数量有17个，而单倍型Hc2数量仅有1个。相较而言，对单倍型数量较少的大银鱼种质资源保护显得尤为重要。目前，增殖放流是恢复渔业资源量及维持渔业资源可持续发展的重要措施，但增殖放流群体对野生鱼类资源遗传结构及遗传多样性的影响缺乏科学评价(张燕萍等, 2013; 陈文静等, 2013)。通过分析研究增殖放流群体与野生资源之间的遗传关系，尽可能补充单倍型数量较少的群体数量，才能更有利于恢复和提高鱼类种质资源的遗传多样性。因此，本研究也可以为开展洪泽湖大银鱼增殖放流提供重要参考依据。