2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306
2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306
水产养殖行业发展迅猛，而养殖中出现的病害却十分严峻(Nakano et al, 1994; Wongteerasupaya et al, 1995; Karunasagar et al, 1997)。其中，作为危害最为严重之一的白斑病，自20世纪90年代被发现后，给全球各地的水产养殖行业造成了难以估量的损失。白斑病由对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)引起。WSSV基因组约为300 kb，为环状、双链DNA病毒，能够感染数10种甲壳纲动物和水生浮游动物(Mayo, 2002; Hossain et al, 2001)，可使被感染动物在3~10 d内死亡(Lightner, 1996)。
有大约99%的核苷酸会在不同毒株的基因组序列之间表现出一致性，而导致差异存在的主要原因一般为大序列的缺失或者插入、易于发生基因重组的可变区、开放型阅读框(Open reading frames, ORFs)内重复单元差异(Variable number tandem repeat, VNTR)、单核苷酸突变等(童桂香等, 2004; Marks et al, 2004)。有4种毒株已经在GenBank上公布了基因组的全序列，分别是中国台湾株(TW, AF440570) (307287 bp)、泰国株(TH, AF369029)(292967 bp)、中国株(CN, AF332093)(305107 bp)和韩国株(KR, JX515788)。具有最大基因组的WSSV毒株TH-96-Ⅱ(AY864666, 312 kb)被视为祖先株(Balakrishnan et al, 2008)。
同已知毒株基因组序列的比较，可以研究某些基因片段(ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125)的缺失情况以及VNTR数目和单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)，这些方面均已被应用到分子流行病学研究(Gudkovs et al, 2014; Dieu et al, 2004; Musthaq et al, 2006)。在ORF75上有2种重复单元(Repeat units, RUs)，分别为45 bp和102 bp；ORF94上有1种RU，大小为54 bp；而存在于ORF125的1种RU有69 bp。根据之前报道的大多数流行病学研究，从这些RUs的数量上的差异(Dieu et al, 2004、2010; Pradeep et al, 2008; Tan et al, 2011; Shekar et al, 2012)，可以更好地解释分子流行病学的调查结果。
本研究应用2015年4~10月期间在山东、江苏、天津、浙江、海南、广东6省市采集到的57份WSSV阳性的样本，通过特异性扩增目的片段，比较不同地区、不同分离株之间在ORF14/15、ORF23/24上的缺失变异情况，以及ORF75、ORF94和ORF125上的RU数目差异，以此了解我国WSSV在2015年的分子流行变异情况。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验样本主要涉及中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本对虾(Penaeus japonicus)(表 1)，所有样本采集后置于–80℃冰箱保存。
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表 1 WSSV样本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125RU数目 Table 1 WSSV samples and repeat units (RUs) of ORF75, ORF94 and ORF125 |
从样本中取鳃组织约30 mg，提取DNA[海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)]，保存于–20℃备用。
1.2.2 PCR检测按照GB/T 28630.2-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分套式PCR检测法进行DNA样本检测，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.3 PCR扩增将检测呈阳性的DNA样本通过特定的引物进行扩增，体系配置见表 2，实验过程中引物及反应条件见表 3(于洪涛, 2008; Dieu et al, 2004、2010; Marks et al, 2005; Tang et al, 2013; Wongteerasupaya et al, 2003)。
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表 2 反应体系及用量 Table 2 Reaction system and amount |
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表 3 PCR扩增引物以及反应条件 Table 3 PCR primers and reaction conditions |
PCR产物胶回收后用NanoDrop 2000检测DNA浓度，通过pMD®18-T连接转化，将连接成功菌液测序。ORF14/15和ORF23/24片段分别与TH-96-Ⅱ株和中国台湾株(TW)比对(Dieu et al, 2004; Zwart et al, 2010)，分析序列缺失情况。ORF75、ORF94和ORF125测序结果分别与其相应的RU序列比对(Gudkovs et al, 2014)。
2 结果与分析 2.1 PCR检测结果样本核酸提取后，通过套式PCR检测，除10份样本在第二轮中呈现阳性目的条带，47份样本均在第一轮中出现阳性目的条带。
2.2 扩增结果通过特定引物扩增，在ORF14/15中，除1#、2#、3#、5#、6#、7#、8#、12#、21#、23#、25#、26#、27#、28#、29#、30#、31#、40#、52#、53#、54#和55#外，其余35份样本均有目的条带出现，检出率为61.40%。13#、14#、15#、16#、17#、35#、36#和37#样本的条带较之其他条带略大，其中，山东利津3个样本均未检出条带(图 1)。在ORF23/24扩增中，共有14份样本(9#、24#、32#、33#、34#、39#、40#、45#、46#、47#、48#、51#、56#和57#)出现目的条带(图 2)，检出率为24.56%。目的条带之间的大小基本没有差别。山东利津、昌邑、威海、江苏赣榆、天津汉沽、宝坻和广东广州没有目的条带出现。而在ORF75中，共有10份样本(4#、9#、32#、33#、34#、45#、46#、47#、48#和57#)检出(图 3)，检出率为17.54%，山东利津、昌邑威海、潍坊、天津汉沽、宝坻、海南海口和广东广州无样本检出。其中，57#山东潍坊的样本在所有目的条带中，片段最大。在ORF94中，共有40份样本检出，检出率为70.18%，其中，1#和3#的目的片段最小(图 4)。江苏赣榆、天津宝坻和广东广州无目的条带出现。在ORF125，共有44份样本检出，检出率为77.19%，在所有地区的样本中均有发现。仅有1#、2#、19#、20#、21#、23#、24#、25#、27#、28#、29#、30#和31#样本无相应目的条带出现(图 5)。
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图 1 引物ORF14/15的扩增结果 Figure 1 Amplification of primer ORF14/15 M: DNA Marker DL 2000; +:阳性对照; –:阴性对照; 1~57:样本编号。下图同 M: DNA Marker DL 2000; +: Positive control; –: Negative control; 1~57: Sample number. The same as below |
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图 2 引物ORF23/24的扩增结果 Figure 2 Amplification of primer ORF23/24 |
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图 3 引物ORF75的扩增结果 Figure 3 Amplification of primer ORF75 |
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图 4 引物ORF94的扩增 Figure 4 Amplification of primer ORF94 |
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图 5 ORF125扩增 Figure 5 Amplification of primer ORF125 |
在ORF14/15扩增中，共扩增3种不同的片段，分别为1270 bp(山东即墨)、1892 bp(山东即墨、潍坊、寿光、浙江舟山、江苏赣榆、天津汉沽、北辰、宝坻、海南海口和广东广州)、2075 bp(山东威海、昌邑)，通过与TH-96-Ⅱ比对，发现分别缺失6530、5908、5725 bp (图 6)。而在ORF23/24中，所有样本片段大小均为1140 bp，与台湾株相比对，缺失12070 bp (图 7)。
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图 6 WSSV不同毒株ORF14/15区域的序列比对 Figure 6 Scheme of deletion region of ORF14/15 in different WSSV strains 左右两边的矩形表示用引物ORF14/15扩增出的序列，中间的虚线表示与TH-96-Ⅱ毒株进行序列比对缺失的部分 Rectangles mean sequences amplified by ORF14/15. The imaginary lines in the middle mean sequences deletion compared to TH-96-Ⅱ strain |
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图 7 WSSV不同毒株ORF23/24区域的序列比对 Figure 7 Scheme of deletion region of ORF23/24 in different WSSV strains 左右两边的矩形表示用引物扩增出的序列, 中间的虚线表示与TW毒株进行序列比对缺失的部分 The right and left rectangles mean sequences which can be amplified. The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to TW strain |
在ORF75扩增中，有3种片段大小出现，分别为1246 bp(江苏赣榆、天津北辰)、985 bp(山东即墨、寿光、天津北辰和浙江舟山)和1738 bp(山东潍坊)，通过与重复片段比对，45 bp的重复片段数目分别为2、1、3，而102 bp的重复片段均为1(表 1)。在ORF94扩增中，共有5种大小不一的片段出现，分别为523 bp(山东利津)、742 bp(山东即墨、威海)、769 bp(海南海口)、1024 bp(山东即墨、天津北辰)和1135 bp(山东潍坊、即墨、寿光、天津汉沽、浙江舟山)，经比对，重复片段数目分别为4、5、5、10、12(表 1)。在ORF125扩增中，出现5种不同的片段，分别为491 bp(山东利津、昌邑、浙江舟山)、518 bp(山东即墨)、703 bp(山东威海、海南海口、天津汉沽、北辰)、722 bp(山东即墨、浙江舟山)、746 bp(山东昌邑、寿光、潍坊、天津北辰、宝坻、广东广州)，经过比对，其重复片段的数目分别为3、3、5、5、6(表 1)。
3 讨论本研究所用样本来自于山东利津、即墨、昌邑、寿光、威海、潍坊、江苏赣榆、天津汉沽、北辰、宝坻、浙江舟山、海南海口和广东广州，采集时间分布于2015年4~10月WSSV病害暴发期间。ORF14/15和ORF23/24的检出率分别为61.40%和24.56%，大部分扩增ORF23/24成功的样本在ORF14/15中均有目的条带出现，但除去40#样本(海南海口)，其仅在ORF23/24扩增中出现。ORF75、ORF94和ORF125的检出率分别为17.54%、70.18%和77.19%，其中，2#(山东利津)、21#(山东即墨)、24#(山东即墨)和25#(山东即墨)样本在3种扩增中均无条带出现，而9#(山东即墨)、32#(浙江舟山)、33#(浙江舟山)、34#(山东寿光)、46#(天津北辰)、47#(天津北辰)、48#(天津北辰)和57#(山东潍坊)样本却在3种扩增中均有条带出现。在5次PCR扩增中，9#(山东即墨)、32#(浙江舟山)、33#(浙江舟山)、34#(山东寿光)、46#(天津北辰)、47#(天津北辰)、48#(天津北辰)和57#(山东潍坊)样本都出现目的条带，而2#(山东利津)、21#(山东即墨)和25#(山东即墨)样本则在5次扩增中均无扩增出目的片段。
对于ORF14/15，TH-96-Ⅱ最为完整，为7800 bp。与TH-96-Ⅱ相比较，韩国株有5721 bp的缺失，泰国株缺失5316 bp，台湾株缺失5138 bp，而中国株缺失5132 bp。本研究中出现3种缺失程度不一样的片段，且相互之间差别较大，即其中2075 bp的片段与韩国株KR的缺失程度相近。6530 bp和5908 bp的2种缺失情况也出现在之前的研究中，而与6530 bp相近的6533 bp和6540 bp的缺失情况分别在2013年和2014年的研究中出现(孙新颖等, 2016a、2016b)。在Tang等(2013)研究中也有相近程度的情况，即缺失5950 bp，而印度的1株和墨西哥地区的3株WSSV毒株有更接近的缺失程度，4株分离株均缺失5892 bp。从现有研究发现，WSSV在ORF14/15上的缺失均在5000 bp以上，相较于完整的7800 bp，缺失程度较大，可能越短的DNA片段在复制中占据更多优势。
报道中的中国株ORF23/24片段缺失最小，仅为1169 bp；泰国株的缺失程度最大，为13120 bp；而韩国株的缺失程度为中等，为5654 bp。Lan等(2002)发现，在中国厦门发现3种不同宿主感染的WSSV，相对中国株的ORF23/24序列分别缺失5717、5926和9319 bp。而Dieu等(2004)发现，在越南中部和南部采集的3种不同的WSSV分离株，相较于台湾株分别缺少8539、11450和12166 bp。相较于其他地区或大或小的缺失情况，本研究中所有样本在ORF23/24上缺失程度一致，均缺失12070 bp，属于是大片段的缺失，这与2013年样本研究中的缺失情况一致，而2014年样本有2种缺失，即12064 bp和12070 bp，二者仅是在中间位置相差6个碱基(孙新颖等, 2016a、2016b)。ORF23/24的这种大片段缺失在普遍范围上比较稳定，结合ORF14/15较大的缺失情况，推测WSSV的进化可能通过逐渐稳定的缺失和更小的基因组来完成，使得基因组更适合复制，以适应环境且WSSV自身具有更强的毒性。
除了ORF75之外，ORF94和ORF125的检出率都比较高。在是否检出方面，不同地区样本之间的RU数目差异比较大，即使是出自于同一地区的样本之间也依然有差异，如山东即墨的样本。ORF75中的45 bp的RUs数目为3以及102 bp的RUs数目为1的情况在之前2014年样本研究中有出现，新出现了45 bp RU为1和2两种类型；ORF94中RUs为4的情况在2013年和2014年样本中均存在，而RUs为12只出现在2013年样本中，且样本中的RUs或为小数目重复，或为大数目重复，RUs为5和10两种属于新类型；ORF125的RUs数目与2014年样本检测中的数据部分一致(孙新颖等, 2016a、c)。Tang等(2013)研究中仅有1种ORF75的VNTR情况：共3个RU，2个45 bp RU和1个102 bp RU；Durán-Avelar等(2015)发现，ORF75总RU有5~20之间共12种情况，而ORF94包含有13种数目不同的RU，ORF125则只有1种总RU数目为8的情况；此外，Sindhupriya等(2014)的实验中，ORF94上有4、6、7、8和11五种不同的VNTR，而ORF125上有3种(4、5和6)不同的VNTR，部分VNTR情况在不同研究中存在交叉情况。相较于ORF14/15和ORF23/24，ORF75、ORF94和ORF125VNTR的研究更多应用于WSSV类型的归划(Durán-Avelar et al, 2015; Tang et al, 2013)，从而确定WSSV的地理归属，揭示WSSV分子流行情况。
2015年样本在重复片段数目上的差异依然很大，ORF14/15上的缺失出现了新的片段，与韩国株极其相近，在ORF23/24上，虽然出现大片段缺失，却表现出了缺失的稳定性。而各个样本在ORF75、ORF94和ORF125上的RU数目则出现差异性和部分稳定性。因此，推测不同地区WSSV毒株为了更好复制遗传以适应环境，出现了适应性的变异，同时本实验也为系统的分子流行病的研究提供了数据基础。
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