2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071;
3. 天津市水产技术推广站 天津 300321;
4. 青岛远大海洋生物科技有限公司 青岛 266035
2. Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071;
3. Tianjin Fisheries Technology Extension Station, Tianjin 300321;
4. Qingdao Grand Marine Biological Technology Co. Ltd, Qingdao 266035
近年来，在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖中，流行一种新的疾病——统称为急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)，其传播速度快、致病力强、死亡率高。该病以肝胰腺坏死为主要特征，患病对虾体色发红，壳软，肝胰腺变为红褐色、肿大后呈纤维化萎缩，空肠，空胃，3~5 d死亡率可达90%以上(徐含颖等, 2015)。该病最初于2010年在我国海南省首次发现，随后迅速传播至全国大部分对虾养殖区，排塘率高达80%，对凡纳滨对虾养殖业造成了巨大损失(徐含颖等, 2015)。越南和马来西亚分别在2010年和2011年相继报道了该疾病的发生(Leano, 2012)。
目前，对于AHPND病原尚存在不同的看法(Suebsing et al, 2013; 刘群等, 2014)。Lightner等(2012)首先报道了AHPND的致病原是副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，之后有学者指出副溶血弧菌分为致病株和非致病株，并非所有菌株具有致病性(Kondo et al, 2014; Yang et al, 2014)。随后，又有多篇报道证明AHPND是由副溶血弧菌引起。虽然尚不清楚是否所有的AHPND都是由一个或多个特定的副溶血弧菌菌株引起，但通过控制弧菌可以大大减少AHPND暴发的风险(Gomez-Gill et al, 2014; De et al, 2014)。我国海岸线漫长，养殖环境复杂，该病的致病原具有病原的多样性，AHPND有多种细菌性致病原，其中，副溶血弧菌检出率最高(黄志坚等, 2016)。2013~2016年间，作者先后在山东、天津、河北、浙江、江苏等地进行了凡纳滨对虾AHPND流行病学调查和病原学研究。在多地患病对虾样品中，副溶血弧菌、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和Vibrio sp. Ex25具有较高检出率，分离的4株菌均可引起与AHPND相似的临床症状。因此，副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp. Ex25都是AHPND的疑似致病菌(另文报道)。
目前，在养殖生产中对虾疾病防控的常规措施有：投放健康、无特定病原的苗种；养殖环境定期消毒；使用微生态制剂调控水质和生态菌群结构；投喂卫生饵料以及口服专用药物等(张水波, 2013; 赵永锋等, 2014)。一般情况下，养殖者对养殖环境进行定期消毒是最常见的防控手段。常用的消毒剂是聚维酮碘(PVPI)和二氧化氯(ClO2)(张继平等, 2004; 吴岗等, 2016)，聚维酮碘对病毒、细菌、真菌及霉菌孢子都有较强的杀灭作用，二氧化氯能高效率消灭原生动物、孢子、霉菌、水藻和生物膜，但这两种消毒剂在养殖生产上的应用具有一定的缺点：碘是国家战略物资，使用成本较高，同时它也具有着色和腐蚀作用；二氧化氯对大部分生物有药害作用，同时，容易伤害单胞藻而形成倒藻。而双氧水(H2O2)、聚六亚甲基胍(PHMG)作为新兴消毒剂，具有价格适中、高效杀菌、安全、无残留等优点(李志富等, 2009; 张慧等, 2010)。
本研究拟从聚六亚甲基胍、双氧水、聚维酮碘及二氧化氯对4株致性弧菌的杀灭效果分析入手，筛选出适合对虾健康养殖的高效消毒剂，以期为AHPND防控和对虾健康养殖提供技术支撑和理论参考。
1 材料与方法 1.1 菌种来源及菌悬液的制备实验用的菌种为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌和Vibrio sp. Ex25(编号分别为PV130903A、PV140731A、PV150526A和PV140821A)，该4株菌株均从患AHPND凡纳滨对虾肝胰腺组织内分离，且经人工感染实验证实可引起与AHPND相似的临床症状和组织病理特征，证实为AHPND的致病菌(姜燕, 2016)。
将4株细菌于TSB培养基在28℃下培养24 h，在无菌条件下挑到1.5%的灭菌生理盐水中混匀，用麦氏比浊管初测菌悬液的浓度，然后将其稀释到105 CFU/ml左右；枪吸取0.1 ml菌悬液加入到0.9 ml灭菌生理盐水中使其稀释10倍，依次稀释100倍、1000倍，取0.1 ml稀释液涂布到TSB培养基上对菌悬液进行准确定量，每种菌悬液设3个平行组，菌悬液的浓度为3组数据的平均值。
1.2 消毒剂及培养基的制备聚六亚甲基胍[(C7H16N3Cl)n]，淡琥珀色溶液，有效活性成分25%，由上海黛龙生物工程科技有限公司提供。双氧水，过氧化氢(H2O2)有效含量为30%，无色透明液体，由国药集团化学试剂有限公司提供。聚维酮碘(C6H9I2NO)，棕黄色细滑粉末，为聚乙烯吡咯烷酮和碘的有机复合物，纯度98%，由上海索桥生物有限公司提供。二氧化氯(ClO2)，白色颗粒，含有效氯8%，由山东西亚化学股份有限公司提供。TSB和TCBS培养基均由南京美博生物科技有限公司提供。
1.3 初试杀菌实验参考各种消毒剂在水产中实际应用的泼洒浓度，适当扩大和缩小一定倍数后设计消毒实验浓度。将各种实验药物分别用灭菌蒸馏水配制成一定浓度的消毒剂，定量加入到菌悬液中制成含有一定消毒剂浓度的菌悬液，按照实验设计反应一定时间后，分别从各个试管取0.1 ml混合液均匀涂布在TSB培养基上，28℃生化培养箱中培养48 h后，肉眼观察菌落生长情况以检测灭菌效果，每个浓度梯度设2个平行组，同时，设定1个空白对照组(施慧等, 2006)。通过初试杀菌实验，选取各消毒剂合适的杀菌浓度，分别设定如下：0、0.1、0.5、1.0 μl/L的PHMG；0、0.1、0.5、1.0 μl/L的H2O2；0、6.0、8.0、10.0 μl/L的PVPI；0、0.5、1.0、2.0 μl/L的ClO2。
1.4 对4种病原菌的杀灭实验 1.4.1 含消毒剂菌悬液配制配制菌悬液，按照初试结果加入消毒剂，配制含有一定消毒剂的菌悬液。
1.4.2 消毒剂杀灭病原菌效果的检测从加入消毒剂开始计时，在10 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h和24 h分别从每个试管中取0.1 ml混合液加入到0.9 ml灭菌的生理盐水中，混匀后从中取0.1 ml涂布到TSB固体培养基上，在28℃生化培养箱中培养24~48 h，观察细菌生长情况，每个浓度梯度设2个平行组。
1.5 聚六亚甲基胍对对虾养殖池水的杀菌作用观察 1.5.1 对虾养殖池水水质指标养殖水源为自然海水，经过送水渠引入蓄水池，再经消毒、沉淀后以60目筛绢过滤进入养殖池。投苗密度为约3~3.3万尾/池，投放消毒剂时，池塘内养殖对虾规格约为180尾/kg。养殖期间，水温为28℃~29℃，盐度为29~30，pH为7.3~7.8，溶解氧保持在4.5 mg/L以上。
1.5.2 聚六亚甲基胍使用剂量与杀灭弧菌效果检测养殖池1~3号、4~6号、7~9号全池泼洒PHMG，终浓度分别为0.5、1和2 μl/L；10~12号池为对照组，不采取消毒措施。投苗后第55天开始泼洒PHMG，1~9号养殖池实验期间每15 d全池泼洒PHMG一次。
泼洒PHMG进行消毒前，取水样进行弧菌培养计数，统计初始弧菌总量；泼洒PHMG后，每日16:00取水样进行弧菌培养计数，追踪每日弧菌总量的变化。水样的采集和弧菌计数方法：使用2 L有机玻璃采水器，取水面以下50 cm的水样，每池塘固定4个取样点，然后用灭菌的三角烧瓶各收集水样200 ml均匀混合在一起；将采集的水样用1.5%的灭菌生理盐水稀释10倍、100倍、1000倍，每个浓度取100 μl液涂布于选择性弧菌培养基TCBS平板上，每个浓度2个平行，28℃倒置培养24~48 h，计数，取平均值，计算出每毫升水中的总弧菌数。
2 结果 2.1 空白对照组菌悬液浓度随时间的变化从空白对照曲线发现，在1.5%的生理盐水中，最初10 min内，4株病原菌的浓度均有小幅度增长，增幅为0.18%~0.59%；其中，Vibrio sp. Ex25浓度增长最少，溶藻弧菌浓度增长最高，这可能和细菌的初始浓度不同有关；随着时间的推移，4株病原菌的浓度有所下降，但下降趋势比较平缓，在24 h后仍然保持较高的浓度，细菌浓度降低4.77%~13.58%；其中，溶藻弧菌浓度下降最小，而Vibrio sp. Ex25细菌浓度下降最大；4种细菌浓度下降幅度不大，说明生理盐水对细菌的存活与繁殖影响不大。
2.2 4种消毒剂对4种病原菌的杀灭在杀菌浓度及杀菌时间的关系上，0.5 μl/L PHMG作用3 h、1 μl/L PHMG作用10 min均可完全杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25三种细菌；1 μl/L PHMG作用2 h可完全杀灭溶藻弧菌。
0.5 μl/L的H2O2作用2 h可完全杀灭Vibrio sp. Ex25；1 μl/L的H2O2作用10 min可完全杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25；1 μl/L的H2O2作用2 h可完全杀灭溶藻弧菌；
6 μl/L的PVPI作用2 h、8 μl/L的PVPI作用1 h均可完全杀灭副溶血弧菌和Vibrio sp. Ex25；8 μl/L的PVPI作用6 h可完全杀灭哈维氏弧菌和溶藻弧菌；10 μl/L的PVPI作用10 min即可完全杀灭4种细菌。
2 μl/L的ClO2作用10 min可完全杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25三种细菌；2 μl/L的ClO2作用1 h可完全杀灭溶藻弧菌。
低浓度实验中，0.1 μl/L PHMG作用24 h，对4种细菌的杀灭率分别为10.24%~38.84%、15.43%~41.36%、7.24%~35.95%和12.36%~44.42%；0.5 μl/L PHMG作用3 h，对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25三种细菌的杀灭率分别从50.95%、67.55%、64.67%增长到100%；0.5 μl/L PHMG作用24 h，对溶藻弧菌的杀灭率为34.14%~75.94%。
0.1 μl/L的H2O2对副溶血弧菌作用2 h达到杀菌峰值，杀灭率为37.48%；0.1 μl/L的H2O2对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp. Ex25作用3 h达到杀菌峰值，杀灭率分别为47.73%、39.78%和40.21%；0.5 μl/L的H2O2对副溶血弧菌作用1 h达到杀菌峰值，杀灭率为89.95%；0.5 μl/L的H2O2对哈维氏弧菌、溶藻弧菌作用2 h达到杀菌峰值，杀灭率分别为89.98%和72.46%；各浓度组在杀菌峰值之后杀灭率逐步降低。
0.5 μl/L的ClO2对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25作用3 h达到杀菌峰值，杀灭率分别为75.53%、80.49%和78.99%；1 μl/L的ClO2对副溶血弧菌作用2 h达到杀菌峰值，杀灭率为81.68%；1 μl/L的ClO2对哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25作用3 h达到杀菌峰值，杀灭率分别为86.54%和85.98%；0.5 μl/L的ClO2、1 μl/L的ClO2对溶藻弧菌作用6 h达到杀菌峰值，杀灭率分别为66.01%和75.72%；各浓度组在杀菌峰值之后杀灭率逐步降低。
2.3 聚六亚甲基胍对养殖池水的杀菌作用养殖池塘中PHMG在0.5 μl/L浓度作用下第1、2、3和4天，弧菌的下降总量分别为48.32%、67.29%、75.98%和79.14%，第4天下降到最低值；PHMG在1 μl/L浓度下第1、2、3天弧菌的下降总量分别为56.20%、74.51%和82.48%，第3天达到最低值。PHMG在2 μl/L浓度下第1、2、3天弧菌的下降总量分别为63.92%、81.24%和87.30%，第3天达到最低值。各实验组弧菌总量达到最低值后，其对虾池水中的弧菌总量缓慢回升；在第11天，上述3个实验组弧菌总量仍然低于初始值的3.58%、5.53%和6.10%(图 1)。
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图 1 空白对照组菌悬液浓度随时间的变化 Figure 1 The variation of bacterial concentration in the control |
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图 2 PHMG对养殖池塘池水的杀菌效果 Figure 2 Efficacy of PHMG in killing Vibrio |
从杀灭实验的结果发现，随着药物浓度的升高，总体杀灭细菌的时间都呈现了缩短的趋势，说明合适的消毒剂在适当的浓度范围内可以有效地控制和杀灭4株病原菌。实验发现，较低浓度的PHMG和双氧水具有较好的杀菌效果，而二氧化氯及聚维酮碘杀灭4株病原菌需较高的浓度。结果发现，溶藻弧菌对本次选用消毒剂的耐受力都稍微高于其他3种致病菌，这或许与起始时溶藻弧菌的浓度稍微较高以及溶藻弧菌特殊的适应机制和存活策略的多样性和有效性有关(姚刚等, 2012)，其中的作用机理有待于进一步研究。由于各种消毒剂的消解及稳定性不同，在杀菌时间上，10 min内PHMG和双氧水杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp. Ex25三种细菌的最低浓度均为1 μl/L，而二氧化氯杀灭这3种细菌的最低浓度为2 μl/L，聚维酮碘则需高达10 μl/L才能完全杀灭4种病原菌；在1 h内，2 μl/L二氧化氯可完全杀灭4株病原菌；在2 h内，1 μl/L聚六亚甲基胍和双氧水可完全杀灭4种病原菌；随着时间的推移，聚六亚甲基胍和聚维酮碘显示出持续杀菌的能力，杀菌率随时间的推移逐渐升高，双氧水和二氧化氯的杀菌率在达到峰值之后均有不同程度的下降，浓度越高，达到峰值杀菌率的时间越短，这可能与双氧水和二氧化氯自身的消解作用有关。在本研究结果中，PHMG使用较小浓度可以在短时间内完全杀灭4株病原菌，且在一定时间范围内随着时间的推移对4种细菌的杀灭率逐渐增高，显示出高效且持续杀菌的能力。综上所述，这4种消毒剂杀菌能力强弱的排序为聚六亚甲基胍＞双氧水＞二氧化氯＞聚维酮碘。
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表 1 种消毒剂对副溶血弧菌的杀灭实验 Table 1 Efficacy of four disinfectants in killing Vibrio parahemolyticus |
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表 2 4种消毒剂对哈维氏弧菌的杀灭实验 Table 2 Efficacy of four disinfectants in killing Vibrio harveyi |
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表 3 4种消毒剂对溶藻弧菌的杀灭实验 Table 3 Efficacy of four disinfectants in killing Vibrio alginolyticus |
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表 4 4种消毒剂对Vibrio sp. Ex25的杀灭实验 Table 4 Efficacy of four disinfectants in killing Vibrio sp. Ex25 |
在养殖池塘池水的弧菌杀灭实验中，0.5 μl/L PHMG可使水体中弧菌总量第4天下降到最低值，下降总量为79.14%；1 μl/L PHMG可使水体中弧菌总量第3天下降到最低值，下降总量为82.48%；2 μl/L PHMG可使水体中弧菌总量第3天下降到最低值，下降总量为87.30%；各实验组弧菌总量达到最低值后缓慢回升，第11天时，3个实验组弧菌总量仍然低于初始值的3.58%、5.53%和6.10%。结果表明，使用PHMG全池消毒后可在第3~4天将养殖池水体内的弧菌总量杀灭到最低值，有效持续控制养殖水体内弧菌总量处于较低水平，显示出长久的持续抑菌和杀菌能力；根据PHMG对4株病原菌和池塘养殖水体内弧菌的杀灭效果来看，使用0.5、1、2 μl/L三种浓度的PHMG进行养殖水体消毒，均可维持弧菌总量处于较低水平上，PHMG三种浓度下弧菌下降总量分别为79.14%、82.48%和87.30%，效果相差不大。考虑到成本，在养殖生产中建议使用PHMG浓度为0.5~1 μl/L，每15 d使用1次，可有效预防AHPND的发生。在泼洒0.5、1.0、2.0 μl/L三种浓度下，PHMG消毒剂未引发养殖对虾的应激反应，整个实验期间，对虾体色正常、活力强、摄食状态良好，保持健康的生理状态。需要指出的是，本次实验在水色较浓的养殖水体内进行应用，获得了高效的杀菌效果，关于不同养殖水体内有机物总量对PHMG的作用以及PHMG对单胞藻、水质因子、浮游动物的影响，今后尚需要进一步精细化研究和追踪分析。
目前，研究表明，在水产养殖业中使用二氧化氯作为消毒剂杀灭养殖水体中病原菌的同时，也能够杀死大量藻类，因此，过量使用二氧化氯易引发养殖水体中藻类大量死亡(贾瑞宝等, 2003; 李绍秀等, 2012)；大量的死亡藻体分解，不仅会增加氧气的消耗，还会产生大量的氨氮和亚硝酸盐，导致对虾缺氧、中毒死亡。
聚维酮碘对多种细菌、芽孢、病毒、真菌等有杀灭作用。其作用机制是释放游离碘，起到一种缓释作用，以保持较长时间的杀菌力，具有较好的杀菌效果。本研究中，聚维酮碘完全杀灭4株病原菌，需要较高浓度(6~8 μl/L)，低浓度的聚维酮碘对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌和Vibrio sp. Ex25的杀菌效果并不理想。相关研究表明，聚维酮碘对不同菌株的杀菌效果存在很大差异，高晓华等(2013)通过聚维酮碘对30种病原菌的杀菌力研究，得出聚维酮碘对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌的敏感性较差。因此，聚维酮碘在养殖生产上预防AHPND的效果不理想。
双氧水是一种公认的环境友好型水产用药，在本研究中，双氧水对4株病原菌的杀灭作用在峰值杀菌率之后有所降低，这可能和双氧水本身的快速消解作用有关(张清等, 2010; 刘志伟等, 2011)。在室外池塘的养殖生产过程中，养殖环境复杂多变，底泥、粪便及残饵中含有大量有机物会降低双氧水的杀菌作用。细菌等微生物在底泥的作用下可不断繁殖并扩散到池水中，因此，在室外池塘选用一种具有持续杀菌能力的消毒剂显得格外重要。相比较而言，室内工厂化养殖水体小、换水快，残饵和粪便等排除率高，更适于应用双氧水进行消毒。
PHMG是一种环保型高分子聚合物，在工业、农业、医用和日常生活中有广泛的用途，而且价格低廉，无污染(黄新宇, 2015)，用于水产类消毒不会产生细菌、病毒的耐药性，且不会对单胞藻造成伤害，是一种高效、安全的新型消毒剂(李妮妮等, 2015)。
综上所述，PHMG杀菌浓度低、杀菌速度快、持续时间长，对致病性弧菌具有良好杀菌效果。双氧水次之，具有较好的杀菌速度和低浓度杀菌效果，但杀菌的持续时间不长。比较而言，前二者优于二氧化氯和聚维酮碘。上述结果对正确选择和使用消毒剂，有效开展AHPND防控，实施对虾健康养殖具有重要的现实意义和指导作用。
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