线粒体是细胞的能量工厂，通过氧化磷酸化为细胞活动提供能量(熊伟等, 2014)。线粒体功能的实现不仅依赖于线粒体基因组的完整性和核基因组的调控，还依赖其基因组的拷贝数(Hock et al, 2009)。不同细胞中的mtDNA拷贝数并不固定，从几个到几万个不等，这主要取决于细胞及机体所处的生理状况，如在人类(Homo sapiens)胚胎发育的不同阶段，肝脏和肌肉中的mtDNA拷贝数与胚龄呈显著正相关(Pejznochova et al, 2010)，人类心肌细胞中的mtDNA拷贝数在不同年龄段也存在着较大的差异(Pohjoismäki et al, 2010)。mtDNA拷贝数在一定程度上反映了线粒体的数量，可作为衡量组织需氧及能量的一种指标(Kaaman et al, 2007; Justo et al, 2005)。在不同的生理状况下，mtDNA拷贝数的调控机制至今尚不清楚。目前，对于mtDNA拷贝数的研究主要集中在人类疾病发生方面，尤其是恶性肿瘤，如肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等(高原等, 2016; Linkowska et al, 2015; Lemnrau et al, 2015; Kim et al, 2014)。在此类疾病的发生过程中，mtDNA拷贝数会显著升高或者降低(Akbar et al, 2016; Mambo et al, 2005)，如在肠癌等病变组织中，mtDNA拷贝数较正常组织显著升高(Qu et al, 2011)，而在肺癌等病变组织中，mtDNA拷贝数较正常组织显著降低(Lin et al, 2008)。除此之外，在小鼠(Mus musculus)、猪(Sus scrofa)、斑马鱼(Danio rerio)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)等物种中关于mtDNA拷贝数的研究也表明，机体在不同的生理状况下，其细胞中mtDNA拷贝数会出现显著的变化(Ikeda et al, 2015; 成文敏等, 2012; 周莉娟等, 2013; 叶侃, 2011)，而在甲壳动物中，除了张培等(2016)对脊尾白虾mtDNA拷贝数响应汞胁迫的变化特征外，关于mtDNA拷贝数的研究则未见报道。

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是我国的一种重要海洋经济虾类，具有繁殖周期短、生长速度快和环境适应性广等优点(Xu et al, 2010)，3~4个月可繁殖1代，可以在短时间内观察到其不同生长阶段的特征，是开展甲壳动物基础遗传和遗传育种研究的良好模式生物。伴随着脊尾白虾的生长，其机体各项生理活动及指标也会变化。目前，脊尾白虾不同生长阶段的研究主要集中在消化和免疫防御、胚胎和幼体存活率、饵料系数等方面(Babulo et al, 2008; 索帅等, 2015; 李玉全, 2014; 冯艳艳等, 2017)，而对于mtDNA拷贝数的研究甚少。mtDNA拷贝数的变化一定程度上反映了机体生命活动耗能的多少，也从侧面体现了生物体代谢与生长的快慢。本研究在建立一种快速、精确的脊尾白虾mtDNA拷贝数检测方法的基础上，研究了不同发育期脊尾白虾mtDNA拷贝数的变化特征，希望通过对脊尾白虾生长过程中mtDNA拷贝数的变化特征分析，为脊尾白虾在生长过程中的生长情况观测提供新的生物指标。

实验用脊尾白虾取自江苏省连云港赣榆佳信水产开发有限公司的养殖池塘，是由池塘中的野生群体自繁而来。在实验室养殖环境条件下暂养24 h后，进行后续实验。实验期间正常投喂(早晚各1次)，连续充气，水温保持在25℃左右，盐度为26，溶氧量≥5 mg/L，pH为8.0~8.5。

根据ANT(腺苷酸转移酶基因，GenBank No. KP892663.1，核基因组单拷贝基因)和ATP6(三磷酸腺苷合成酶6，GenBank No. NC012566.1，线粒体基因组单拷贝基因)2个基因序列，设计实时定量PCR (qRT- PCR)扩增引物及TaqMan探针(已申请国家专利，申请号为201610906439.X)。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

提取脊尾白虾组织总DNA，并以此为模板，分别用ANT和ATP6引物进行扩增，10 µl PCR体系：7.0 µl ddH₂O，1.0 µl 10×PCR缓冲液，0.6 µl MgCl₂ (25 mmol/L)，0.2 µl dNTPs (10 µmol/L)，0.2 µl Taq DNA聚合酶(5 U/µl)，上、下游引物各0.4 µl (10 µmol/L)，0.2 µl mix-DNA (20 ng/µl)。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min、35个循环；最后，72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经胶回收纯化后，按pEASY-T3 Zero Cloning Kit操作说明，把相应的片段连接到质粒载体中，再转化入Trans1-T1 phage Resistant感受态细胞，利用蓝白斑筛选获得阳性克隆菌株，挑取含有阳性克隆的单克隆菌落扩大培养，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。经鉴定为阳性质粒的，用NanoDrop 2000测定质粒浓度，利用双链DNA拷贝数计算器(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)将质粒质量换算成拷贝数(拷贝/µl)，作为mtDNA和nDNA标准品。

表 1(Tab.1)

表 1 ANT、ATP6基因实时定量PCR引物及TaqMan探针 Tab.1 Quantitative real-time PCR primers and TaqMan probes of ANT and ATP6 引物及探针Primer and probe 序列Sequence (5'~3')         ANT-F GGGTTGAAAGAGGGAATG         ANT-R CAAGCATTATATTTTGTACAGAC         ATP6-F TGCATGGTCCTCTCTCACGCT         ATP6-R AGTGAGACGAAGACAAGGGTGCC         ANT-Probe FAM-CTTACTACAGGGCATGTCGCTCC-TAMRA         ATP6-Probe FAM-CCTTTTAGGGCCAGCCAACC-TAMRA

表 1 ANT、ATP6基因实时定量PCR引物及TaqMan探针 Tab.1 Quantitative real-time PCR primers and TaqMan probes of ANT and ATP6

使用无DNA酶的ddH₂O将质粒标准品10倍梯度稀释成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝，各1000 μl，并以此制作标准曲线。

qRT-PCR采用10 μl扩增体系，反应体系：5 μl Premix Ex Taq(qPCR Probe)，0.2 μl上、下游引物(10 µmol/L)，0.2 μl 50×ROX Reference Dye，0.2 μl gDNA(20 ng/μl)，0.4 μl TaqMan探针(0.6 μmol/L)。采用StepOnePlus™型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems Inc.)进行扩增，扩增程序：95℃ 20 s；95℃ 1 s、60℃ 20 s，40个循环。

脊尾白虾胚胎发育的过程一般分为2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、囊胚期、原肠期、无节幼体期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、溞状幼体Ⅵ期和仔虾等时期(梁象秋等, 1988; 武文魁, 1984; 王绪峨, 1991)。本研究选取了受精卵期、溞状幼体Ⅰ期，溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期8个时期的样品，每个时期各取3尾，经液氮研磨后用DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取总DNA，将DNA浓度稀释至20 ng/μl备用。

采用SPSS 19.0对数据进行相关性分析。从脊尾白虾核型初步推测其为二倍体，因此，每个细胞中的线粒体基因组拷贝数的计算公式为：

mtDNA拷贝数=2×ATP6拷贝数/ANT拷贝数

以10倍梯度稀释重组质粒后，选取10⁷~10²的稀释标准品进行qRT-PCR扩增，分别获得ANT基因与ATP6基因的扩增曲线。ATP6基因的标准曲线的回归方程y=-3.402x+15.928；ANT基因的标准曲线的回归方程y=-3.439x+15.248，相关系数R > 0.99，见图 1。

图 1(Fig. 1)

图 1 ATP6(A)与ANT(B)荧光定量PCR扩增曲线及标准曲线 Fig.1 Quantitative PCR amplification curves and standard curves of ATP6 and ANT

利用qRT-PCR，根据标准曲线获得各个样本平均每个细胞中线粒体基因组拷贝数，统计结果显示，各发育期的mtDNA拷贝数随着生长发育总体呈上升趋势(图 2)。受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期8个时期的mtDNA拷贝数均值分别为2366、2648、2644、2873、3559、9948、6452和8872，溞状幼体Ⅴ期和成虾期mtDNA拷贝数最多，分别是受精卵期的4.2倍和3.7倍。进一步统计分析发现，mtDNA拷贝数和发育时间存正相关性，相关系数为0.83，且溞状幼体Ⅴ期、仔虾和成虾期与其他发育期存在显著性差异(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同发育期线粒体基因组拷贝数变化 Fig.2 Variation of mitochondrial genome copy number at different developmental stages 1：受精卵期；2：溞状幼体Ⅰ期；3：溞状幼体Ⅱ期；4：溞状幼体Ⅲ期；5：溞状幼体Ⅳ期；6：溞状幼体Ⅴ期；7：仔虾期；8：成虾期。不同字母表示差异显著(P < 0.05) 1: Zygote; 2: Zoea Ⅰ; 3: Zoea Ⅱ; 4: Zoea Ⅲ; 5: Zoea Ⅳ; 6: Zoea Ⅴ; 7: Post larvae; 8: Adult shrimps. Different letters indicated significant differences (P < 0.05)

目前，检测mtDNA拷贝数的方法主要有SYBR GreenⅠ染料法(何静等, 2014)和TaqMan探针法(Chiu et al, 2003) 2种。由于SYBR GreenⅠ染料法的特异性不强，多数mtDNA拷贝数测定还是采用TaqMan探针法。采用TaqMan探针法建立的标准曲线具有良好的重复性，且引物、探针序列和引物探针相互作用关系的双重保证克服了普通PCR假阳性的缺陷(Pohjoismäki et al, 2010)。本研究通过构建脊尾白虾线粒体及核基因组单拷贝基因的质粒作为标准品，建立了一种快速、高效、精确的检测脊尾白虾mtDNA拷贝数的方法，并在此基础上，对脊尾白虾不同发育期的mtDNA拷贝数进行了精确定量。

早期胚胎中的ATP水平代表着机体胚胎的发育水平(Dumollard et al, 2008)，线粒体产ATP能力又与细胞内mtDNA拷贝数有密切联系(Dumollard et al, 2007; Tsai et al, 2015)，至今有许多学者将mtDNA拷贝数作为评估卵母细胞发育水平的一个指标(Van Blerkom, 2011; Santos et al, 2006; Zeng et al, 2007)，即mtDNA拷贝数越高，卵母细胞成熟度越高，受精能力越强，胚胎发育潜能越高。所以，mtDNA拷贝数对机体的胚胎发育有着深远影响。本研究结果显示，随着脊尾白虾的生长，细胞内的mtDNA拷贝数在不断增加，总体呈上升趋势，这与谢燕梅(2014)在对猪不同生长阶段不同组织mtDNA拷贝数变化研究中得到的结论相似，即伴随着脊尾白虾的生长，其活动量增加，机体能量需求增大，mtDNA拷贝数也会随之增加。mtDNA拷贝数在一定程度上反映了脊尾白虾不同生长阶段的能量需求情况，为评估脊尾白虾生长发育状况提供了一个生物指标。

甲壳动物具有独特的蜕皮生长方式，在蜕皮生长期间会出现幼体前期的慢生长和幼体后期的快生长，并伴随着机体变态，二者相对独立又互相联系(Gore et al, 1985; Anger et al, 1987)。在十足类幼体发育阶段，变态期间的快速生长期一般仅限制在幼体生长的倒数第一期和第二期，此时机体形态变化大、消耗能量多，是早期幼体慢生长及能量积累的结果。进入成体之后，机体蜕皮生长间隔变长，能量累积也随之变缓(McConaugha, 1982、1985)。机体内能量需求越大，mtDNA拷贝数越高，这可能是本研究中溞状幼体Ⅴ期mtDNA拷贝数高于其他时期的原因之一。另外，还有可能是机体内mtDNA拷贝数调控机制的作用，目前报道的mtDNA拷贝数受线粒体转录因子A (Lu et al, 2013)、同源重组修复蛋白Rad51(Sage et al, 2011)、DNA聚合酶γ(Kelly et al, 2012)等因素影响，具体如何调控有待进一步研究。