仿刺参(Apostichopus japonicus),也称为刺参,是经济效益很高的增养殖种类之一。海参作为世界八大珍品之一,以高蛋白、黏多糖丰富及不含胆固醇著称,随着其价值知识的普及,刺参逐渐进入寻常百姓餐桌。刺参需求量的增大,引起养殖产业和饲料产业的迅速扩大,而关于海参营养需求的研究尚处于摸索阶段,营养需求标准缺乏,饲料研究落后于产业的发展。鼠尾藻(Sargassum thunbergii)和马尾藻(Sargassum)被认为是最优质的刺参饵料,由于过度开采已经不能满足产业发展的需要。天然海域中,刺参主要以沉积物中的单细胞藻类、原生动物、细菌、大型海藻碎屑及海泥为食,因为刺参优先选择栖息在富含大型海藻的海域,充足的大型海藻碎屑是海参的主要食物来源,所以大型海藻成为人工配合饲料的主要原料。目前已有不少研究报道,部分大型海藻用于刺参养殖取得了不错的投喂效果(Wen et al, 2016; 殷旭旺等, 2015; 李猛等, 2017; 唐薇等, 2014; 葛立保等, 2017; 朱建新等, 2007)。石莼(Ulva lactuca L.)和海带(Saccharina japonica)是中国北方很受欢迎且价格较低的大型海藻,含有丰富的纤维素、碳水化合物、蛋白质、各种微量元素和多糖类,目前已广泛应用于刺参养殖中。铜藻(Sargassaum horneri)是中国暖温带海域浅海区海藻场的主要连片大型褐藻物种,植株高大,枝叶繁茂,多生长在潮下带浅海岩礁上,成片漂浮水面,堪称“海中森林”,铜藻不但含有丰富的藻胶、纤维素、半纤维素及矿物质,而且生物活性物质含量相当高,作为工业、食品原料资源具有极大的开发潜力,可惜目前还没有被广泛开发利用(郑海羽等, 2008)。海带渣为工业提胶的剩余产品,干海带加水浸泡后切碎,甲醛固色,在加热条件下,利用碳酸氢钠消化后过滤,滤液用于提取海藻酸钠,不溶性组分干燥后得到海带渣原料,所以,海带经过有效成分提取后,仍存在许多粗蛋白、粗纤维和矿物质等营养物质,用来制作刺参饵料可实现海带渣的高值化利用,这一部分资源的利用可使海带干物质的利用率高达45%左右(张俊杰等, 2010)。本研究在刺参幼参配合饲料中添加海带粉、海带渣粉、铜藻粉及石莼粉,与鼠尾藻的饲喂效果作对比研究,并探讨混合藻粉的应用效果,以期为大型海藻在刺参人工配合饲料中的应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验饲料以鱼粉、小麦粉、海泥等为主要原料,对照组为鼠尾藻粉(D1购自莱州市海福饲料有限公司),分别用铜藻粉(D2采集于江苏省盐城市大丰区养殖水域; 菌落总数20840 CFU/g; 大肠杆菌16 MPN/100 g; 沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌均未检出)、海带粉(D3购自青岛汇福林海洋生物科技有限公司)、海带渣(D4购自青岛汇福林海洋生物科技有限公司)、石莼粉(D5购自青岛海之源饲料科技有限公司)及5种海藻粉等比例混合(1:1:1:1:1; D6)替代鼠尾藻,配制成6种实验饲料,每种实验饲料包含30%的藻粉。将所有实验原料逐级混匀,与适量新鲜蒸馏水混合,用螺旋挤压机加工成厚度为2 mm的片状饲料,室温风干至水分为5%左右,储存于–20℃冰箱备用。饲料配方及基本营养组成见表 1,实验饲料氨基酸组成见表 2。
实验用刺参幼参购于山东安源水产股份有限公司,正式实验前,于实验所用循环水养殖系统中,用对照组(鼠尾藻组)饲料投喂14 d,使刺参幼参适应养殖系统的条件及实验饲料。选取540头规格统一、体质健康、初始体重为(10.02±0.03) g的刺参随机分配到18个玻璃钢水槽内(Φ 65 cm×80 cm),实验分为6组,每组3个平行,每个平行30头刺参,每个桶内放置2个聚乙烯波纹板筐作为刺参的遮蔽物。每天定时定量投喂1次(16:00),初始投喂量为刺参总湿重的2%,观察摄食情况并及时调整投喂量。每3 d采用虹吸法吸出残饵及粪便,实验周期为56 d,实验期间每天换水量为1/3,控制水温为(18±2)℃,溶氧 > 6 mg/L,pH为7.6~8.2,盐度为28~32,NO2–-N < 0.05 mg/L,NH4+-N < 0.05 mg/L,光照周期为自然光周期。
1.3 样品采集实验中期开始收集刺参粪便,用镊子从每个桶内小心夹取完整粪便,用电热鼓风干燥箱60℃烘干,用于酸不溶性灰分的测定。饲养结束后禁食48 h,分别对每桶刺参进行计数并称总重,每桶随机选取10头刺参,解剖分离内脏、体壁及肠道,称重后保存于–80℃冰箱备用。另每桶随机取3头刺参,沿腹中线的右侧解剖(避免破坏腹肠系膜),剔除呼吸树后,取中肠0.8 cm左右并固定于Bouin’s液中24 h后,保存于70%酒精中,经脱水、透明、浸蜡、包埋后,进行常规石蜡连续切片,切片厚度为7.0 μm,然后经H.E染色后,中性树胶封片并编号,在徕卡高清摄像系统(LEICA ICC50 HD)下观察并拍照。从–80℃冰箱中取出刺参肠道,冰浴解冻匀浆,4℃离心20 min (2500 r/min),上清液(粗酶液)于4℃保存,用于消化酶和免疫酶活性的测定(24 h内测定)。
1.4 计算公式与实验方法增重率(Weight gain rate, WGR, %),特定生长率(Specific growth rate, SGR, %/d),存活率(Survival rate, SR, %),肠体比(Ratio of intestine weight to body weight, IBR, %),脏体比(Ratio of viserosomatic weight to body weight, VBR, %),根据以下公式计算:
WGR=(Wf–Wi)×100/W1;
SGR=(lnWf–lnWi)×100/T;
SR=(存活数量/初始数量)×100;
IBR=(肠道质量/体重)×100;
VBR=(内脏质量/体重)×100
式中,Wi和Wf分别为每个桶内刺参的平均初始体质量和终末体质量,T为养殖天数。
饲料及刺参体壁的水分、粗灰分、粗脂肪及粗蛋白含量分别根据GB/T6435-2006、GB/T6433-2007、GB/T6433-2006和GB/T5009.5-2003测定,饲料能量采用氧弹燃烧法测定(PARR 6100),酸不溶性灰分(Acid-insoluble ash)根据GB/T23742-2009测定;肠道粗酶液蛋白浓度(考马斯亮蓝法)、胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、α-淀粉酶(α-Amylase)、脂肪酶(Lipase)、总超氧化物歧化酶(Total-superoxide dismutase, T-SOD)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)活性及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定,测定方法均参考试剂盒说明书;饲料氨基酸测定参照国标测定方法(GB/T 14924.10- 2008),采用全自动氨基酸测定仪(Hitachi L-8900, 日本)测定。
1.5 数据分析所有数据采用SPSS 18.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA),用Duncan’s检验进行多重比较,P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著,P > 0.05为差异不显著。统计数据以平均值±标准误(Mean±SE)的形式表示。
2 结果 2.1 不同藻粉对刺参生长性能、形体指标及存活率的影响不同海藻粉对刺参的生长性能具有显著影响,如表 3结果显示,混合藻粉组与对照组的刺参WGR和SGR显著高于其他各组(P < 0.01),铜藻组与海带组差异不显著(P > 0.05),但显著低于石莼组(P < 0.01),海带渣组最低;海带渣组刺参的IBR和VBR均显著低于其他各组(P < 0.05),其他各组间差异不显著(P > 0.05);不同海藻粉对刺参SR影响不显著(P > 0.05)。
表 4结果显示,饲料中添加海带、海带渣、石莼及混合藻粉均能提高刺参的体壁粗蛋白含量,但与对照组差异不显著(P > 0.05),不同海藻粉对刺参体壁水分、粗灰分和粗脂肪影响不显著(P > 0.05)。
鼠尾藻和混合藻粉组刺参肠道胰蛋白酶活性显著高于海带、海带渣和石莼组(P < 0.05),铜藻组与对照组差异不显著(P > 0.05);海带渣及石莼粉组刺参肠道的糜蛋白酶活性显著低于其他各组(P < 0.05),其他各组间差异不显著(P > 0.05);不同处理组α-淀粉酶和脂肪酶活性差异不显著(P > 0.05);铜藻组刺参粪便的酸不溶性灰分显著高于对照组(P < 0.01),其他各组均显著低于对照组(P < 0.01)(表 5)。
由表 6可见,不同海藻对刺参非特异性免疫具有显著影响,海带渣组刺参肠道T-SOD活性显著低于其他各组(P < 0.01),混合藻粉组显著高于铜藻、海带及石莼组(P < 0.01);海带渣组刺参肠道MDA含量显著高于其他各组(P < 0.01),石莼组显著低于对照组(P < 0.01),混合藻粉组与对照组差异不显著(P > 0.05);不同藻粉对刺参的ACP、AKP活性具有显著影响(P < 0.01),海带渣组刺参的ACP活性显著低于对照组及混合藻粉组(P < 0.01),其余各组与对照组差异不显著(P > 0.05);铜藻、海带渣及石莼组肠道AKP活性显著低于对照组(P < 0.01),混合藻粉组与对照组差异不显著(P > 0.05)。
图 1为6组饲料投喂下刺参的中肠横切组织结构。由图 1可见,不同海藻对刺参肠道组织结构影响显著,鼠尾藻和混合藻粉组刺参肠道皱襞高度明显大于其他各组,且皱襞面积较大,铜藻组及海带渣组皱襞高度最小,且皱襞面积最小,海带组及石莼组皱襞高度居中。
海藻为刺参生长所必需,饲料中添加30%的藻粉能最大程度提高刺参的生长性能(Yuan et al, 2006),而鼠尾藻是公认的刺参优质饵料,在本实验条件下,铜藻粉、海带粉、海带渣及石莼粉对刺参的增重效果均不如鼠尾藻,然而,混合藻粉却达到了与鼠尾藻相同甚至更优的增重效果,这可能是因为,多种海藻粉混合营养更全面,弥补了单一海藻营养不均衡的问题,与Gao等(2011)对刺参的研究结果一致。铜藻的氨基酸组成与鼠尾藻相似(表 2),但促生长效果却明显不及鼠尾藻,可能是因为其谷氨酸含量(2.78)明显低于鼠尾藻组(3.33),而谷氨酸是一种呈味氨基酸(刘长琳等, 2015),能增强动物食欲,提高摄食量。本研究中海带渣组刺参的IBR和VBR均显著低于其他各组,可能是因为海带渣在提取褐藻酸钠过程中,为了保证提取物的色泽而加入的甲醛等固色剂部分残留,影响了刺参的消化功能,而海带渣组的SR与其他各组差异不显著,表明海带渣对刺参的SR无不利影响,但不利于肠道的消化吸收,郝继浦(2014)研究表明,利用海带渣生产刺参饵料,刺参的生长性能显著低于配合饲料组(P < 0.05),与本研究结果相似。
刺参食道和胃都很短,仅起到运输和机械处理内吞食物的作用,刺参无特化的消化腺(崔龙波等, 2000; 李旭等, 2013),前肠和中肠有腺细胞,能分泌消化酶,对食物进行细胞外消化(王吉桥等, 2007),本研究中,刺参肠道蛋白酶活性较高,且受不同藻类影响显著,而脂肪酶活性较低,表明刺参对不同藻类蛋白的吸收能力不同,对脂肪的耐受性低(Seo et al, 2011),多项研究也证明了刺参肠道具有较高的蛋白酶活性和较低的脂肪酶活性(唐黎等, 2007; 姜令绪等, 2007; 赵斌等, 2015),与本研究结果一致。铜藻和海带渣组刺参肠道消化酶活力较低,证明刺参对其消化吸收能力较弱。与此一致,本研究中铜藻及海带渣组刺参肠道皱襞高度明显低于对照组及混合藻粉组,细胞数目明显减少,而肠绒毛的完整性及高度是营养物质被消化吸收的基本保障,可能是因为消化道内褐藻酸酶活力较低(唐黎等, 2007),刺参对铜藻和海带渣的吸收能力较弱,绒毛之间的隐窝细胞分裂速度降低,不能及时分化迁移,补充正常脱落的绒毛上皮(王吉桥等, 2007; 孙丽娜, 2013),消化吸收的表面积减少,从而影响了对营养物质的吸收。此外,酸不溶性灰分是指示饲料消化率的有效指标(Li et al, 2008),本研究中,海带、石莼及混合藻粉组的酸不溶性灰分均显著低于对照组,铜藻显著高于对照组,海带渣与对照组差异不显著,表明刺参对海带、石莼及混合藻粉的消化吸收率较高,对铜藻和海带渣的消化吸收率低,可能因为较铜藻而言,海带和石莼的质地较软,易被刺参肠道破坏。
T-SOD、ACP和AKP是评价刺参机体免疫力的重要指标。T-SOD是机体清除活性氧的关键防御酶,其活性直接指示免疫系统的状态及清除自由基的能力(杨宁等, 2016; 秦搏等, 2015; 董晓亮等, 2013),MDA是自由基作用于脂质发生过氧化的终产物,会引起蛋白质、核酸等生物大分子交联聚合(Wakita et al, 2011)。在本研究中,海带渣组刺参的氧化产物MDA含量显著高于其他各组,T-SOD活性显著低于其他各组,表明该组刺参体内脂质过氧化反应较为严重,机体清除自由基的能力较弱,混合藻粉组T-SOD活性与对照组差异不显著,但均显著高于其他各组,表明多种藻粉混合饲喂刺参可以有效提高机体清除自由基的能力,提高刺参的抗氧化性能。ACP和AKP是溶酶体酶的重要组成部分(郑慧等, 2014),同时还是刺参体内参与免疫防御活动的重要水解酶,在刺参抵抗疾病、免疫反应及细胞损伤修复过程中具有一定的生物学意义(李继业, 2007)。在本研究中,海带、海带渣、石莼及混合藻粉组的刺参肠道ACP和AKP活性显著高于对照组和铜藻组,可能是因为海带和石莼中含有较多微量元素及多糖成分,能激活免疫相关酶活性,从而有效提高刺参的免疫性能(李丹彤等, 2014)。研究证实,刺参大部分的免疫反应都是由阿米巴吞噬细胞介导,Canicatti(1990)在刺参H. polii阿米巴吞噬细胞中发现ACP、AKP、β-葡萄糖酶、氨基多肽酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和脂酶等多种溶酶体酶,同时在包囊体中也检测到了ACP活性。
4 结论通过对刺参生长性能、非特异性免疫及消化机能的研究可知,混合藻粉具有跟鼠尾藻相似的饲喂效果,因此建议刺参幼参养殖中多种海藻粉混合使用,以保证刺参营养均衡。
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