极北海带(Laminaria hyperborea)是一种具有重要经济和生态价值的大型经济海藻，广泛分布于大西洋东北海域，包括葡萄牙至巴伦支海的沿岸以及英国、法罗群岛和冰岛的沿岸(Kain, 1967、1971; Schoschina, 1997)。极北海带柄和叶片的褐藻胶含量分别为25%~30%和17%~33%，属于褐藻胶含量较高的种类(Qin, 2008)。与其他褐藻相比，极北海带有较低的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸比值(M/G)，从而表现出较高的凝胶强度(Phillips et al, 2009; Qin, 2008; 曲艳艳等, 2016)。因此，极北海带在法国、挪威和英国等国家常被用作提取褐藻胶的原料(Bixler et al, 2011)。另外，因矿物元素和维生素等营养成分丰富，极北海带也用作动物饲料添加剂及海藻肥(范晓, 1991; Schiener et al, 2015)。极北海带的生态价值体现在其藻体较大(叶+柄的长度可达2~5 m) (Jupp et al, 1974; Kain, 1962、1971)，多年生(平均寿命一般为8~15年) (Kelly, 2005; Sjøtun et al, 1993)，是形成“海藻森林”的优势种，为海洋生物提供索饵场、产卵场或栖息地，对维护海洋生物多样性发挥重要作用(Smale et al, 2013)。另外，极北海带藻场具有重要的碳汇功能，是地球上具有较高生产力的植被系统之一(Pedersen et al, 2012)。综上可知，极北海带在海洋藻场建设及人工养殖方面具有重要的开发前景。

极北海带在幼苗期对光照的适应能力是决定其存活的关键因素之一(Kain et al, 1965)，也是其应用于藻场建设及人工养殖中需考虑的首要问题之一。大型海藻对光照的适应性一般可从生长、生理、生化等方面的指标进行综合评价。对于极北海带的游孢子、配子体、幼苗、成藻等不同生长发育阶段的光合生理方面，已有学者做了一些初步探索(Drew et al, 1976; Kain et al, 1965; Kremer, 1984; Lüning, 1971; Willenbrink et al, 1975)，他们主要测定了极北海带的光合速率、光饱和点、光补偿点、固碳强度等参数。许多研究表明，大型海藻的藻体生化组分(如色素、可溶性蛋白、丙二醛、抗氧化酶等)的含量或活性，会发生明显的变化以适应不同的光环境条件(姜宏波等, 2009; 卢晓等, 2013; 芦薇薇等, 2016)，光照是造成海藻体内生化组分呈季节性变化的主要因素之一(Lapointe et al, 1984)，而极北海带对不同光照强度的生化响应还没有相关的文献报道。本研究以基于配子体克隆系培育的极北海带幼苗为研究对象，探讨其生长及相关生化指标对不同光强的反应规律，以期探明适宜其生长的光照范围，并揭示其对光照胁迫的生化响应机制，进而为极北海带苗种规模化生产、人工增养殖及海藻场构建提供理论依据。

本研究所用极北海带幼苗是通过配子体克隆育苗技术获得，极北海带配子体采集于法国布列塔尼半岛海区。由配子体培育成幼苗过程中的培养条件：温度为11℃~13℃，光合有效辐射(Photosynthetically active radiation, PAR)为40~50 μmol photons/(m²·s)，光周期为12L︰12D，用灭菌天然海水作为培养液，并添加营养盐(PO₄^3–-P：0.4 mg/L；NO₃^–-N：4 mg/L)。用到的主要仪器：智能光照培养箱(宁波江南仪器厂)，352型酶标仪(Labsystems Multiskan MS公司, 芬兰)，AC8洗板机(Thermo Labsystems公司, 芬兰)，电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)。

以下各个处理组均添加相同浓度的氮/磷营养盐(PO₄^3–-P：0.4 mg/L；NO₃^–-N：4 mg/L)，每个测量实验均至少3个平行。

挑选2~4 cm的极北海带幼苗，置于GXZ智能型光照培养箱，进行相对生长速率的测定实验：在温度为9℃条件下，分别在PAR为20、40、60、80和100 μmol photons/(m²·s)条件下持续培养10 d。实验开始前，挑选藻体完整、无损伤腐烂的极北海带幼苗，各处理组平均鲜重为(1.04±0.05) g，鲜重差异性不显著(P > 0.05)。每隔2 d换水1次，10 d后称量鲜重，计算相对生长速率(Relative growth rate, RGR)，计算公式如下：

式中，W₀为初始藻的鲜重(g)，W_t为实验结束时藻的鲜重(g)，t为实验持续的时间(d)。

相对生长速率测定结束后，立刻用液氮把不同处理组的极北海带幼苗冷冻并储存在超低温冰箱中，待进行生化指标的测定。本研究测定的指标包括：叶绿素a和类胡萝卜素、可溶性蛋白质(Soluble protein)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和超氧阴离子(Superoxide anion, SA)。

参考文献进行叶绿素a (王丽梅等, 2011)和类胡萝卜素含量(Chouhan et al, 2011)的测定，其他指标的测定均采用酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。酶联免疫分析检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行各个指标的测定。SOD、POD和CAT的比活力单位(U/mg prot)以酶活性单位(U)每毫克蛋白表示(李合生, 2000)。

采用SPSS 19.0数据统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan多重比较及Pearson相关性分析，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，用Excel软件绘制图形。

方差分析结果表明，光强对极北海带幼苗的相对生长速率(RGR)有显著影响(P < 0.05)。图 1显示，在9℃时，40、60和80 μmol photons/(m²·s)光强组的RGR均较大，三者相比无显著差异(P > 0.05)。20和100 μmol photons/(m²·s)光强组的RGR均较小，它们与60和80 μmol photons/(m²·s)光强组相比均呈显著性差异(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同光强下处理10 d后极北海带幼苗的相对生长速率(温度为9℃) Fig.1 The relative growth rates (RGR) of young L. hyperborea seedlings cultivated for 10 d under different light intensities (T=9℃) 不同字母表示差异显著，P < 0.05，下同 Different letters indicate significant difference, P < 0.05, the same as below

方差分析结果表明，光强对极北海带幼苗的叶绿素a和类胡萝卜素含量均有显著影响(P < 0.05)。图 2显示，极北海带幼苗的叶绿素a含量随着光强的升高而逐渐降低。20和40 μmol photons/(m²·s)处理组的幼苗叶绿素a含量均较高，二者无显著差异(P > 0.05)。光强≥60 μmol photons/(m²·s)的处理组与光强为20 μmol photons/(m²·s)组均差异显著(P < 0.05)。光强≥40 μmol photons/(m²·s)的处理组之间无显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 2 极北海带幼苗在不同光强下的叶绿素a和类胡萝卜素含量 Fig.2 Chlorophyll-a and carotenoid content of young L. hyperborea seedlings under different light intensities 柱状图上的字母下标为相同数字的作为同一组进行多重比较，同一组的不同字母表示在P < 0.05水平具有显著性差异，下同 The same subscript number at the letters represent the same group. The measured value in the same group are compared. The different letters in the same group represent significant differences, P < 0.05, the same as below

图 2显示，在20~80 μmol photons/(m²·s)光强范围内，极北海带幼苗的类胡萝卜素含量随着光强的升高逐渐降低。当光强升高到100 μmol photons/ (m²·s)时，幼苗的类胡萝卜素含量有所增加。20、40和100 μmol photons/(m²·s)光强组的类胡萝卜素含量均较高，三者无显著差异(P > 0.05)。40~100 μmol photons/(m²·s)光强组之间无显著差异(P > 0.05)。

图 3显示，在本研究光强范围内，随着光强的升高，极北海带幼苗的可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趋势。40、60和80 μmol photons/(m²·s)光强组的可溶性蛋白含量均较高，三者相比无显著差异(P > 0.05)，20、40、80和100 μmol photons/(m²·s)光强组的可溶性蛋白含量之间相比亦无显著差异(P > 0.05)。Pearson相关性分析表明，可溶性蛋白含量与RGR呈极显著正相关关系(相关系数为r=0.712，P < 0.01)。

图 1(Fig. 1)

图 3 极北海带幼苗在不同光强下的可溶性蛋白含量 Fig.3 Soluble protein content of young L. hyperborea seedlings under different light intensities

方差分析表明，光强对极北海带幼苗的MDA含量有显著影响(P < 0.05)。图 4显示，20 μmol photons/ (m²·s)光强组的MDA含量最大，80和100 μmol photons/ (m²·s)光强组次之，40和60 μmol photons/(m²·s)光强组的MDA含量均较低。20 μmol photons/(m²·s)光强组的MDA含量与其他光强组的相比差异显著(P < 0.05)。Pearson相关性分析表明，MDA含量与RGR呈显著负相关关系(相关系数为r=-0.58，P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 极北海带幼苗在不同光强下的丙二醛(MDA)含量 Fig.4 MDA content of young L. hyperborea seedlings under different light intensities

方差分析结果表明，光强对极北海带幼苗的SA含量有显著影响(P < 0.05)。图 5显示，20 μmol photons/ (m²·s)光强组的SA含量最大，与其他光强组相比均显著差异(P < 0.05)。40~100 μmol photons/(m²·s)光强范围内各组的SA含量之间相比无显著差异(P > 0.05)。Pearson相关性分析表明，SA含量与MDA含量呈极显著正相关关系(相关系数为r=0.829，P < 0.01)。

图 1(Fig. 1)

图 5 极北海带幼苗在不同光强下的超氧阴离子含量 Fig.5 Superoxide anion content of young L. hyperborea seedlings under different light intensities

方差分析表明，光强对极北海带幼苗的SOD、POD和CAT的比活力均有显著影响(P < 0.05)。图 6显示，100 μmol photons/(m²·s)光强组的SOD和POD比活力均较大，与其他光强组相比均差异显著(P < 0.05)。20和80 μmol photons/(m²·s)光强组的SOD比活力均较低，与其他光强组相比均差异显著(P < 0.05)。40和60 μmol photons/(m²·s)光强组的SOD比活力无显著差异(P > 0.05)。80 μmol photons/(m²·s)光强组的POD比活力最低，与40和100 μmol photons/(m²·s)光强组相比均差异显著(P < 0.05)，而与20和60 μmol photons/(m²·s)光强组相比均无显著差异(P > 0.05)。20、40和60 μmol photons/(m²·s)光强组的POD比活力之间无显著差异(P > 0.05)。40和60 μmol photons/(m²·s)光强组的CAT比活力均较大，二者无显著差异(P > 0.05)。20 μmol photons/(m²·s)光强组的CAT比活力最小，与40和60 μmol photons/(m²·s)光强组相比均差异显著(P < 0.05)，而与80和100 μmol photons/(m²·s)光强组相比均无显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 6 极北海带幼苗在不同光强下的SOD、POD和CAT比活力 Fig.6 SOD、POD and CAT specific activity of young L. hyperborea seedlings under different light intensities

Pearson相关性分析表明，SOD比活力与MDA含量及SA含量均呈负相关关系(相关系数分别为r=-0.337，r=-0.331)，而相关性均未达到显著水平(P > 0.05)。POD与SOD比活力呈极显著正相关关系(相关系数为r=0.706，P < 0.01)。CAT比活力与MDA含量及SA含量均呈负相关关系(相关系数分别为r=-0.466，r=-0.546)，其中，CAT比活力与SA含量的相关性达到显著水平(P < 0.05)。

生长于水深5 m及以下的极北海带个体一般小于生长于水深2~3 m的个体，如在水深2 m和12 m处，年龄约为2年的极北海带的平均柄长度分别为34 cm和9 cm (Jupp et al, 1974; Kain et al, 1963; Kain, 1971; Larkum, 1972)。极北海带垂直分布上限是略高于最低天文潮位处，而垂直分布下限因地而异，如在英格兰西南部透明度很高的海域，极北海带分布下限可达36 m，而在海水浑浊的环境中仅为1~2.5 m (Kain, 1971)。由此可知，光照是影响极北海带个体大小和垂直分布的重要因素之一。因此，若要把极北海带应用于藻场建设及人工养殖，了解其适宜的光照范围尤为重要。

植物体内可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，其含量可反映植物体内总代谢水平(詹冬梅等, 2013)。本研究中，在40~80 μmol photons/(m²·s)光强范围内，RGR及可溶性蛋白含量均较高，表明该光强范围对极北海带幼苗的生长有利。从RGR及可溶性蛋白含量的相关性可推测，极北海带幼苗代谢水平与其生长速率密切相关。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，如SA自由基(O₂^–)、羟基自由基(•OH)、过氧化氢(H₂O₂)与单线态氧(¹O₂)等，是植物有氧代谢的副产物。大量活性氧可导致蛋白质、膜脂和其他细胞组分的严重损伤。MDA是活性氧攻击膜脂而形成的最终降解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度(杜秀敏等, 2001)。本研究显示，SA含量与MDA含量呈极显著正相关关系，且MDA含量与RGR呈显著负相关关系，由此可推测，极北海带幼苗中SA含量与MDA含量密切相关，膜脂的过氧化可能是导致极北海带幼苗相对生长速率降低的原因之一。

在正常生理条件下，植物本身的抗氧化系统(分为酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统)可对活性氧进行有效清除，酶促抗氧化系统包括SOD、POD、CAT及谷胱甘肽还原酶(GR)等各种抗氧化酶，非酶促抗氧化系统包括维生素C、维生素E、类胡萝卜素等各种抗氧化剂(薛鑫等, 2013)。植物体内活性氧处于不断产生和清除的动态平衡中，抗氧化系统是维持这种平衡的关键。一旦遭受环境胁迫，这种平衡可能就会被破坏，使植物细胞中积累大量的活性氧(薛鑫等, 2013; 尹永强等, 2007)。过饱和光强是植物产生大量活性氧的重要诱因之一，可对植物造成光氧化损害(郭连旺等, 1996)。研究表明，极北海带成体的新生叶片饱和光强在80~100 μmol photons/(m²·s)范围内(Lüning, 1971)，而对于长度为1~15 cm的极北海带幼苗，在5℃~17℃内其饱和光强范围为52.4~100.3 μmol photons/(m²·s)(梁洲瑞等, 2108)。由此可推测，本研究中的光强100 μmol photons/(m²·s)对极北海带幼苗来说可能已达到过饱和光强水平，即处于高光逆境中。

本研究中，当光强升高到100 μmol photons/(m²·s)时，幼苗的类胡萝卜素含量有所增加，这可能与幼苗对高光强的适应性有关。据报道，类胡萝卜素可直接猝灭单线态氧或通过猝灭三线态叶绿素而阻止单线态氧的形成(单线态氧是由O₂和三线态叶绿素作用产生的)，从而消除单线态氧对光合作用结构的破坏(郭连旺等, 1996; 尹永强等, 2007)。由此推测，类胡萝卜素在极北海带幼苗对抗高光胁迫过程中发挥重要作用。SOD是生物体内特异清除SA自由基(O₂^–)的酶，其与O₂^–反应产生H₂O₂和O₂，是抗氧化的第一道保护层；POD是以H₂O₂为电子受体催化底物氧化的酶，CAT可与H₂O₂专一结合，即POD和CAT均可消除H₂O₂(阎成士等, 1999)。本研究中，SOD及CAT的比活力与SA和MDA含量均呈负相关关系，其中，CAT比活力与SA含量的相关性达到显著水平，表明SOD及CAT对于极北海带幼苗中活性氧的清除、降低膜脂的过氧化伤害发挥着关键作用。在100 μmol photons/(m²·s)的高光强环境下，SOD和POD的比活力均较大，与其他光强组相比均呈显著差异，且POD比活力与SOD比活力呈极显著正相关关系，由此可推测，在极北海带幼苗的酶促抗氧化系统中，SOD和POD可对高光逆境产生积极响应，可协同作用清除细胞内由高光强诱发引起的过量活性氧。CAT主要定位于线粒体、过氧化物体与乙醛酸循环体中，而叶绿体中H₂O₂的清除主要是通过Halliwell-Asada途径进行的，该途径主要是由抗坏血酸过氧化物酶(APX)和GR等抗氧化酶发挥关键作用(阎成士等, 1999)。因此，本研究中，在高光强环境下幼苗却没有表现出最高的CAT比活力，这可能与CAT在细胞中的位置和其他抗氧化酶的作用有关，即高光强直接对极北海带幼苗叶绿体产生了光氧化损害，而APX和GR对高光强诱发引起的幼苗叶绿体中过量的H₂O₂进行了有效清除，该猜测有待于下一步进行研究验证。综合上述结果可推测，极北海带幼苗的酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统均可对高光逆境作出积极应答，它们可相互辅助以清除活性氧，降低光氧化伤害。

研究表明，极北海带成体的新生叶片光补偿点约为12 μmol photons/(m²·s)(Lüning, 1971)，而对于长度为1~15 cm的极北海带幼苗，在5℃~17℃范围内其光补偿点范围为4.6~15.4 μmol photons/(m²·s)(梁洲瑞等, 2018)。战吉宬等(2003)研究认为，环境光强持久低于或短时间显著低于植物光饱和点，但不低于限制其生存的最低光照强度时的光环境，可以称为弱光逆境。由此推测，极北海带幼苗在20 μmol photons/(m²·s)光强下可能已处于弱光逆境中。弱光逆境可影响植物的光合作用、光合产物的运输和分配、营养元素的吸收、内源激素水平和抗氧化酶活性等生理生化过程(王明等, 2007)。本研究中，在20~80 μmol photons/ (m²·s)光强范围内，极北海带幼苗的叶绿素a和类胡萝卜素含量随着光强的减弱均呈现出逐渐降低的趋势。许多大型海藻在一定光强范围内色素含量也会呈现出这种变化趋势(陈伟洲等, 2015; 姜宏波等, 2009; 林贞贤等, 2007; 刘静雯等, 2001)。研究认为，这是植物表现出的生长补偿效应，即植物可通过增加细胞色素含量来更有效地捕获光能，以适应弱光环境(Beale et al, 1971; 王艺等, 2010)。弱光逆境可导致植物体内MDA含量的升高，受不同弱光胁迫强度和胁迫时间的影响，不同抗氧化酶的活性会有所差异(王明等, 2007)。本研究中，在20 μmol photons/(m²·s)的弱光环境下，极北海带幼苗的SA含量和MDA含量均显著高于其他处理组，且SOD、POD和CAT的比活力均较低。综合上述结果可推测，在弱光逆境下，极北海带幼苗虽然能通过增加体内叶绿素a的含量以更有效地捕获有限的光能，但幼苗的可溶性蛋白合成效率及抗氧化酶比活力均显著下降，从而造成其活性氧代谢发生了较严重的失衡，进而造成较严重的细胞膜脂过氧化损害，该氧化损害是导致极北海带幼苗相对生长速率降低的原因之一。