2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071
2. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Pilot National Laboratory for Marine Sciences and Technology(Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071
长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)，又名凸镜状蕨藻，属于绿藻门(Chlorophyta)、羽藻纲(Bryopsodophyceae)、羽藻目(Bryoposodales)、蕨藻科(Caulerpaceae)、蕨藻属(Caulerpa)。长茎葡萄蕨藻的外观为浑圆饱满的绿色球状小枝，犹如串串葡萄，俗称“海葡萄”(郭辉, 2014)。长茎葡萄蕨藻主要分布于太平洋的热带和亚热带(30°N~30°S)的潮间带海区，多生长在水流较缓的沙地或礁石区域(Titlyanov et al, 2012)。
长茎葡萄蕨藻具有极高的营养与保健价值：富含人体所需的多种氨基酸与维生素(Saito et al, 2010)，蛋白质含量为10.41%，总脂肪含量为1.6%~3.7% (Matanjun et al, 2009)，还含有ω-6多不饱和脂肪酸(Niwano et al, 2009)，其食用口感类似鲑鱼卵，却没有鱼腥味，被誉为“绿色鱼子酱”。目前，长茎葡萄蕨藻的市场售价约为200~250元/kg，养殖及相关产品的加工利用利润较高(张颖等, 2016)。在日本、越南和菲律宾等国家，长茎葡萄蕨藻的养殖技术较为成熟(梁洲瑞等, 2016)。近年来，我国的福建、海南、辽宁和山东等地开启了该藻的养殖热潮。海南地区可整年进行长茎葡萄蕨藻的养殖，福建沿海每年的长茎葡萄蕨藻养殖周期一般为9~10个月，而辽宁和山东等北方海区一般可在5~9月时开展长茎葡萄蕨藻室内养殖，养殖周期较短。虽然北方海区养殖周期短，但可以利用高温期时闲置的养殖车间，从而提高车间使用率。如海参行业下滑，大连沿海有大量闲置的海参育苗车间，对这些闲置车间进行屋顶改造(改为可透光的)，开展长茎葡萄蕨藻等名贵藻类的室内养殖是一个可提高渔民收入的有效途径。随着我国长茎葡萄蕨藻养殖业的快速发展，病害问题日益突出，成为制约其健康可持续发展的重要因素之一，如大连地区近2年进行的小规模长茎葡萄蕨藻养殖过程均受困于病害问题，产量及质量均受到严重的影响，导致该地区的长茎葡萄蕨藻养殖产业停滞不前。
目前，国内外大部分学者对长茎葡萄蕨藻的研究集中在其生物学特性和人工养殖技术方面，例如，在解析适宜的水温、光强、营养盐浓度及盐度等环境因子对长茎葡萄蕨藻生长的影响，确定长茎葡萄蕨藻养殖的适宜密度，比较不同类型附着基的养殖效果等方面取得了一定的进展(黄建辉, 2012)。然而，有关该藻的病害防治技术鲜有报道，仅Kudaka等(2008)关于副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起长茎葡萄蕨藻腐败变质的病例分析，并提出了可以在藻类培养过程中通过紫外杀菌来预防该病的方法。
我国是海藻养殖第一大国，但在藻类病害的研究方面相对薄弱，关于藻类病原菌的微观形态描述和致病机理研究较少。
本文对大连某养殖场2017年7月暴发的一种长茎葡萄蕨藻病害(病症为藻体表面由翠绿色变成黑褐色)进行了较为系统的研究。从发病率高达30%的长茎葡萄蕨藻发病藻体黑褐色病灶部位分离到一株优势菌，采用柯赫氏法则(Evans, 1976)对该菌进行了鉴定，并通过回接感染实验确定该菌为病原菌。同时，对处于不同感染阶段的病藻藻体进行了扫描电镜观察，解析在病原感染藻体过程中的微观病理特征。本研究结果为长茎葡萄蕨藻的健康养殖以及细菌性病害防控提供了有益参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 患病长茎葡萄蕨藻患病长茎葡萄蕨藻于2017年7月，采自大连某海藻养殖场，养殖场水温为26℃~27℃，常温保存运回实验室，在24 h内进行分析。
1.1.2 健康长茎葡萄蕨藻健康长茎葡萄蕨藻采自大连室内养殖水池，在实验室条件下进行培养，培养温度为28℃，盐度为30，光照为3000~5000 lx，光暗周期为L:D=12:12，充气培养，每隔3 d更换1次过滤海水，选取生长状态良好的长茎葡萄蕨藻用于实验。
1.1.3 长茎葡萄蕨藻培养液成分NO3-N浓度为15 mg/kg，PO4-P浓度为4 mg/kg。
1.1.4 试剂及固定液配方实验所用细菌TSA平板、TCBS琼脂平板和细菌生化反应微量鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色液试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。电镜固定液为2.5%戊二醛(体积比为25%的戊二醛溶液:20×PBS缓冲液:ddH2O=1:5:4)。
1.1.5 仪器设备YXQ-LS-SII电热压力蒸汽灭菌锅，SPX-250B-Z型生化培养箱，Centrifuge 5804R低温冷冻离心机，NanoDrop 1000紫外分光光度计，Nikon E800光学显微镜，JEM-1200EX型透射电子显微镜，VEGA3 TESCAN扫描电镜。
1.2 病原菌的分离和纯化选取患病症状明显的长茎葡萄蕨藻，现场剪切匍匐茎、直立枝组织，用无菌海水漂洗3次后，取患病藻体的典型病灶部位，并以健康藻体的组织为对照同步取样，进行常规水浸片，在光学显微镜下观察。同时，在无菌的条件下，用剪刀把病灶处藻体组织剪下，置于无菌的研钵中研磨匀浆，匀浆液用灭菌海水梯度稀释，每个稀释度吸取100 μl稀释液分别涂布于TSA平板和TCBS琼脂平板，在28℃生化培养箱中培养12~36 h。观察菌落生长和形态，挑取形态一致的优势菌落在新鲜培养基上重复划线纯化3次以上，直至分离到单菌落，分离纯化后的菌株置于-80℃保存。
1.3 人工回接感染实验将从患病长茎葡萄蕨藻病灶处分离得到的优势菌用于人工回接感染实验。刮取培养皿中分离纯化的优势菌置于500 ml TSB培养液，37℃培养24 h后，培养液6000 r/min离心10 min，收集菌体。用灭菌海水洗涤细菌，将菌株用灭菌海水配制成终浓度为108 CFU/ml的菌悬液(采用酶标仪和平板计数法结合计算)，10倍浓度梯度稀释后备用。设6个浓度组A1~ A6，对应浓度分别为103、104、105、106、107和108 CFU/ml，每个浓度各设3个平行组。采用浸浴的方式进行回接感染：500 ml菌悬液分装至1000 ml锥形瓶中，每个锥形瓶中放入1.5 g藻体。设置不加菌液的灭菌海水培养液为对照组，每组实验设置3个重复(B1、B2和B3)。放置于光照培养箱中养殖(温度为28℃，光强为3000~5000 lx，光周期为12 h/12 h；培养液中NO3-N浓度为15 mg/kg，PO4-P浓度为4 mg/kg。实验期内，每2 d更换1次菌悬液。每天观察并记录藻体健康情况，发现实验组藻体出现黑褐色典型发病特征时，切取病灶部位进行细菌分离和鉴定。
1.4 扫描电子显微镜切片的制备与观察选取藻体出现颜色变化的感染部位，剪取大小约为1 mm3的组织块，放入含2.5%戊二醛的电镜固定液中固定，用于扫描电子显微镜观察。
将用2.5%戊二醛的电镜固定液固定的组织块在4℃条件下固定24 h后，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min；1%的锇酸固定1.5 h；磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min；将固定好的材料用梯度浓度的乙醇脱水，再用醋酸戊酯作为中间介质，置换脱水剂，然后在临界点干燥器中用固体CO2等置换剂置换中间介质，进行临界干燥；将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50~300 Å厚的金属膜，样品用扫描电镜观察、拍照。
1.5 病原菌的形态学观察与生理生化特性测定将分离菌株在TSA和TCBS琼脂平板上接种划线，观察菌落形态、大小。挑取单一菌落，采用革兰氏染色液试剂盒对细菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察。同时挑取新鲜菌落，2.5%戊二醛固定，pH7.0的2%磷钨酸负染色液染色，进行透射电镜观察。并在无菌条件下挑取单一菌落，制备菌悬液，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》(Holt, 1994; 东秀珠等, 2001)，用生化鉴定管测定细菌生理生化指标。
1.6 细菌16S rDNA序列测定 1.6.1 PCR模板DNA的制备用灭菌枪头挑取单菌落悬浮于50 μl无菌去离子水中，100℃水浴10 min，12000 r/min离心2 min，取1 μl上清液作为PCR反应所用模板DNA(范文辉等, 2005)。
1.6.2 PCR扩增与测序利用扩增16S rDNA序列通用引物，正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGG-CCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-TACGGCTA-CCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系见表 1(许燕, 2017)。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃复性40 s，72℃延伸40 s，30个循环；最后72℃延伸20 min，4℃保存。将扩增得到的PCR产物送至上海生工生物科技有限公司进行测序。根据测序结果，在GenBank中使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源性比较，在网站(http://www.bacterio.net/vibrio.html)搜集下载与该菌株同属且相似度较高的其他菌株序列信息，采用MEGA 6软件进行序列同源性分析和系统发育树构建。
1.7 药敏实验将菌株在TSB固体培养基平板上培养24 h后，用1.5%无菌生理盐水冲洗稀释，制成108 CFU/ml的菌悬液，取100 μl均匀涂布于TSA固体培养基平板，将药敏纸片贴于该培养基上，每个培养基上贴5片，28℃培养16 h后，测定抑菌圈直径，记录其大小，根据美国临床实验室标准化协会CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)标准，判定细菌对该抗生素是高度敏感(Susceptible, S)、耐药(Resistant, R)、中度敏感(Intermediate, I) (苗鹏飞等, 2018)。
2 结果与分析 2.1 患病藻体临床症状患病长茎葡萄蕨藻病灶部位整体呈黑褐色，触感软、粘，严重感染的匍匐茎呈明显的深黑褐色，顶端藻体出现溃烂(图 1A)；在光学显微镜下观察发现，患病的长茎葡萄蕨藻表面黏附很多簇虫、线虫，且有许多杂藻附着在长茎葡萄蕨藻藻体上(图 1B)；正常藻体透明翠绿、表面光滑(图 1C, 图 1D)。
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图 1 患病的长茎葡萄蕨藻 Fig.1 The syndrome of infected C. lentillifera A：感染黑褐病的长茎葡萄蕨藻外观；B：簇虫、线虫和杂藻附着在病烂长茎葡萄蕨藻表面；C和D：对照组颜色翠绿，病烂组出现黑褐色病变(体式显微镜) A: Syndrome of C. lentillifera infected black-brown disease; B: Gregarina, Nematode and miscellaneous algae attached to the surface of diseased C. lentillifera; C and D: The color of the control group was green, and the infected group showed dark brown lesions (stereo microscope) |
从患病藻体的病灶组织分离到1种优势菌，在TSA和TCBS琼脂平板上培养18~24 h，观察TCBS琼脂平板，形成规则圆形、中间隆起、表面光滑且呈黄色的菌落(图 2A)。在TSB培养液上培养16 h后，菌液呈浑浊的淡黄色。经革兰氏染色后，光学显微镜下观察发现，细菌被染为红色，两端钝圆、菌体直或少弯曲、短杆状(图 2B)，确定为革兰氏阴性菌。透射电镜下可见该菌有一根细长的端生鞭毛，无荚膜，无芽孢(图 2C)。将分离到的菌株编号为CL2017070801002。
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图 2 患病长茎葡萄蕨藻分离出的优势菌CL2017070801002的形态 Fig.2 Morphological features of strain CL2017070801002 isolated from infected C. lentillifera A：TCBS琼脂平板上的菌落；B：革兰氏染色；C：透射电镜图 A: Colony on TCBS medium; B: Gram stain; C: Transmission electron microscope figure |
用不同浓度的CL2017070801002菌悬液感染健康的长茎葡萄蕨藻，除对照组外，每个感染实验组都出现不同程度的感染症状，其中，108 CFU/ml组2 d出现黑褐色典型症状，≤105 CFU/ml的实验组7 d后出现感染。另外，感染用的菌液浓度越高，患病藻体的感染面积越大(图 3)。
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图 3 感染菌株CL2017070801002后的长茎葡萄蕨藻发病症状(感染第7天后) Fig.3 Symptoms of the C. lentillifera infected with different dose of CL2017070801002 (infection group on 7th day) A. 103 CFU/ml; B: 104 CFU/ml; C: 105 CFU/ml; D: 106 CFU/ml; E: 107 CFU/ml; F: 108 CFU/ml |
以浓度为108 CFU/ml的CL2017070801002菌悬液感染长茎葡萄蕨藻，感染后的第2~3天，可肉眼观察到藻体顶端呈黄色；从第4天开始，养殖水体浊度明显增加，藻体颜色加深，由黄色逐渐变为红褐色，最后，整个藻体病变直至溃烂。实验期间，对照组没有出现病变，感染组出现明显的红褐色病变。从患病藻体分离得到的菌株编号为CL2017070801002A。CL2017070801002A的菌落形态与CL2017070801002相同，通过16S rRNA分析，与CL2017070801002为同一种细菌。
2.4 感染藻体扫描电镜观察图 4所示，对照组的直立枝球状体部分形态正常，表面光滑且无其他生物附着，结构完整(图 4A)；感染组在接种菌株CL2017070801002的前期，创伤处明显可见少量丝状物粘附，且附着少量细菌(图 4B)；感染后期，患病藻体的直立枝球状体表面有大量细菌，表面形态变得极不规则，组织结构被破坏(图 4C)；患病藻体中粘附大量丝状物，充斥整个藻体(图 4D)；同时，在患病藻体表面还发现许多异物附着(图 4E)；藻体感染后直至溃烂的过程中，均有大量的丝状物等附着(图 4F)。
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图 4 病烂长茎葡萄蕨藻扫描电子显微镜观察
Fig.4 Observation of diseased C. lentillifera by scanning electron microscopy
A：健康的长茎葡萄蕨藻；B：接种病原菌后，感染前期，少量的细菌附着在长茎葡萄蕨藻创伤口处；C：感染后期， 患病藻体表面聚集大量菌，组织结构被破坏；D：丝状物附着在病烂长茎葡萄蕨藻表面；E：未知物附着在 病烂长茎葡萄蕨藻表面；F：感染后溃烂的长茎葡萄蕨藻(包含众多丝状物和未知物) A: Healthy C. lentillifera; B: After inoculation, early infection, a small amount of bacteria attached to the C. lentillifera wound; C: Late infection, a large number of bacteria got around, and the tissue structure is destroyed; D: Filaments attached to the surface of diseased C. lentillifera; E: Unknown attached to the surface of diseased C. lentillifera; F: Late infection, fester C. lentillifera (Contains many filaments and unknowns) |
对分离菌株CL2017070801002进行革兰氏染色，光学显微镜观察显示，菌株为革兰氏阴性短杆菌。生理生化特征分析结果显示：氧化酶反应阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶反应阳性，精氨酸双水解酶和MR-VP反应阴性，能利用蔗糖、甘露醇，不能利用乳糖、山梨醇、肌醇、鼠李糖等，其余特征见表 2。
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表 2 病原菌CL2017070801002和CL2017070801002A形态特性及生理生化特征 Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain CL2017070801002 and CL2017070801002A |
PCR扩增病原菌CL2017070801002的16S rDNA，经琼脂糖电泳检测表明片段大小为1400 bp左右，将该序列在GenBank数据库进行BLAST同源比对分析，发现与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的同源性最高，相似度为99%，从NCBI数据库中下载与该菌株序列相似度较高的16S rDNA基因序列，利用MEGA6软件构建系统发育树(图 5)，结果显示，该菌与溶藻弧菌聚为一簇，确认菌株CL2017070801002为溶藻弧菌。
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图 5 基于16S rDNA基因序列构建的菌株CL2017070801002的系统发育树 Fig.5 Phylogenetic tree of CL2017070801002 and V. alginolyticus based on 16S rDNA sequence |
在实验的36种药物中，该菌对氯霉素、四环素、氟罗沙星、强力霉素和氟苯尼考等药物高度敏感，对庆大霉素、克拉霉素等药物中度敏感，对青霉素、头孢氨苄、头孢拉定等药物不敏感(表 3)。
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表 3 菌株CL2017070801002对抗菌药物的敏感性 Tab.3 Sensitivity of the strain CL2017070801002 to antibacterial drugs |
本研究从患黑褐病长茎葡萄蕨藻中分离得到1株优势菌CL2017070801002，在TCBS琼脂平板上为黄色，边缘透明，中间隆起，有黏性，革兰氏染色为阴性；经电镜负染，观察到菌株呈短杆状，端生单鞭毛；氧化酶反应阳性。经人工回接感染，藻体出现与自然患病相同的症状，证实该菌对长茎葡萄蕨藻具有较强的致病力。综合生理生化特征分析，16S rDNA基因序列比对分析等方法将该菌株鉴定为溶藻弧菌。
由弧菌引起的海洋生物疾病，流行面积广，发病率高，给养殖业造成了巨大危害，长期以来是水产领域研究的一大热点(杨少丽等, 2005)。溶藻弧菌具有较强的致病力，林业杰等(1998)报道了溶藻弧菌含有多种致病因子，近年来，在养殖大黄鱼(Larimichthys crocea)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等鱼类和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中发现有溶藻弧菌感染的病例(金珊等, 2003; 姜燕等, 2016; 苗鹏飞, 2018)，本研究首次报道了在长茎葡萄蕨藻养殖过程中溶藻弧菌作为潜在的致病菌感染藻体的案例，溶藻弧菌感染范围正不断扩大，应当引起重视。细菌粘附于宿主细胞表面是机体感染致病的先决条件(戴卓捷等, 2001)。利用扫描电镜观察溶藻弧菌对长茎葡萄蕨藻的侵染过程，发现感染初期，藻体的细胞壁表面出现少量的细菌；随着感染加重，藻体细胞壁表面聚集大量细菌，细胞壁逐渐被破坏，同时给线虫、簇虫和杂藻等附着物提供有利环境，使其快速生长繁殖，导致藻体细胞组织逐渐破裂，直至死亡。
细胞壁是抵抗病原菌入侵的第一道屏障，在养殖环境中，线虫、簇虫和杂藻等附着物对藻体造成的机械损伤可能是该菌株侵染的先决条件。韩宝芹等(1997)报道海带配子体的细胞壁中含有大量的褐藻胶及各种多糖类物质，褐藻酸降解菌会产生褐藻酸酶，可以分解利用作为细胞壁填充物质的褐藻胶，使细胞间质变得松弛，并导致藻体软化。彭艳婷(2012)研究发现，细菌首先侵染海带配子体细胞的细胞壁，破坏细胞壁后侵入原生质体，并利用其中的营养物质进行生长和繁殖，当配子体细胞内的营养物质不足以维持其生长繁殖时，便从细胞壁中涌出，寻找新的营养物质，最后导致配子体细胞的破碎、死亡。
Zanetti等(2000)研究发现，溶藻弧菌可粘附在上皮细胞(Hep-2和Caco-2)上。Baffone等(2001)研究了20株溶藻弧菌对Hep-2细胞的粘附情况，其中，有11株菌对其有较强的粘附作用。大多数革兰氏阴性菌在宿主细胞上的粘附受体是糖蛋白或糖脂，其受体特异性部位往往是其中的糖类残基(陈强等, 2006)，而长茎葡萄蕨藻中多糖含量较为丰富(姜芳燕等, 2014)，与其容易受到溶藻弧菌的感染密切相关。本研究结果证实，藻体受到创伤后，创伤部位先出现大量病原菌粘附和繁殖，进而造成藻体组织严重损害，最终导致整个藻体死亡溃烂。由此推断，藻体细胞壁的多糖含量较为丰富，容易遭受细菌粘附，随着感染时间的加长，细菌首先侵染藻体细胞壁，抵抗病原菌入侵的第一道屏障被破坏，细菌会继续寻找藻体中新的营养物质进行生长繁殖，最后导致藻体细胞的破碎、死亡。
综上所述，对于溶藻弧菌引起的长茎葡萄蕨藻黑褐病防控要重点从控制养殖系统中的病原菌数量入手。在实验室条件下，105 CFU/ml浓度溶藻弧菌感染长茎葡萄蕨藻，第10天即可导致出现明显病变，浓度越高，发病时间越短，发病程度越大。因此，可在长茎葡萄蕨藻养殖生产中监控溶藻弧菌等病原的数量在104 CFU/ml以下，如果监测到其病原的数量在104 CFU/ml以上，可采取紫外处理水体、使用一些安全的消毒剂等手段(刘志轩等, 2006)及时预防黑褐病的发生。对于藻体病害，正确选择和使用消毒剂尚待深入研究，以期得到最佳消毒效果。
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