光(光周期、光强、光谱)作为重要的环境因子之一，对许多重要硬骨鱼类的胚胎发育、孵化和摄食有重要影响，包括奇努克三文鱼(Oncorhynchus tschawytscha)和比目鱼(Hippoglossus hippoglossus) (Dey et al, 1990; Helvik et al, 1993、2010; Mangor-Jensen et al, 1995)等。在自然海域中，光随海水的深度增加而快速衰减，光谱成分也发生了极大的改变，红色光谱在浅水域占优势，而蓝色光谱能量较高，在深水域占据主导地位(Tyler, 1968)。随着光电材料科技的发展，发光二极管(LED)在水产中逐步开始应用，相比于传统的灯具，LED灯具有发光效率高、耗电量少、安全环保无污染等优点。但LED的一些光特性(光强、光谱、光周期)对硬骨鱼类的生长、摄食、繁殖的影响还知之甚少(Villamizar et al, 2009)。已有一些研究表明，光影响水产鱼类受精卵孵化、存活和生长发育(Puvanendran et al, 2002; Yoseda et al, 2008)。另外，不适宜的光强或光谱对硬骨鱼类的早期发育产生影响，导致骨骼发育不全、游泳能力丧失(Battaglene et al, 1990; Trotter, 2003)。因此，研究光对硬骨鱼类的影响可为养殖业提供科学的参考依据。

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是亚洲地区(韩国、日本和中国)的重要养殖经济鱼种。目前，有关光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼生长影响的研究甚少，本研究探究LED光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状及生长相关基因表达量的影响，为养殖厂对红鳍东方鲀育苗提供科学的参考依据。

实验用卵取自河北天正实业有限公司人工饲养亲鱼的自然产卵，产卵当日，受精卵空运至大连海洋大学水产设施养殖与装备工程研究中心，放置于实验系统中立即进行光照实验。

实验于2018年3月16日开始，采用遮光布遮挡自然光，采用4种LED光谱灯(深圳市超频三科技股份有限公司)，分别为蓝(λ_{450 nm})、绿(λ_{525 nm})、黄(λ_{590 nm})、白(λ_{400~780 nm})，每种光谱设置2个平行，养殖桶采用圆型桶(直径为80 cm，水深为60 cm)，水体约250 L(10粒卵/L)，水温为(22±1)℃，光周期为16L:8D，光强为200 mW/m²，每天08:30采用SRI-2000-UV光谱照度计(尚泽股份有限公司)于水面5 cm处测定并校准。实验第6天，受精卵开始孵化，孵化后的仔鱼开口后，按生长期分别投喂轮虫(Rotifer)(约10个/ml)、卤虫(Artemia)(约5个/ml)，从受精卵孵化出仔鱼开始取样，在实验第6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、23天的09:00取样，每次随机取15~20尾，用戊二醛保存，采用9SMZ 745T/ SMZ1000高级体视显微镜[尼康映像仪器销售(中国)有限公司]测量全长、体长、躯干长、尾长、头长、眼径和体高。在实验第23天，每个处理组取30尾仔稚鱼保存于–80℃冰箱，用于测定生长相关基因的相对表达量。

将冻存样品取出后，按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(BBI, A606695)的操作说明书进行总RNA的提取。利用微量分光光度计(SMA4000, Merinton)测定RNA样品的OD₂₆₀及OD₂₈₀值，根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值判断总RNA纯度；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

根据RevertAid Premium Reverse Transcriptase试剂盒(Thermo Scientific^TM, EP0733)操作说明书，将提取的总RNA进行反转录扩增，获得cDNA。反转录产物于–20℃保存备用，使用LightCycler480Ⅱ(BBI, Roche, 德国)仪器和SG Fast qPCR Master Mix(2×) (BBI, Roche, 德国)试剂盒进行Real-time quantitative PCR实验。根据GenBank已有的红鳍东方鲀GHR1、IGF1、SS1、GH和β-actin基因的序列，采用Primer 5软件设计引物，引物序列见表 1。经多次测定，β-actin表达比较稳定，故选为内参基因。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性3 s，60℃退火/延伸30 s，共45个循环；实验结束后对熔解曲线进行分析。所有PCR过程中，生物学样品为3个平行，每个RNA样品均设有3个重复。采用RT-PCR(2^-∆∆C)相对荧光定量法对生长相关的基因进行计算。

表 1(Tab.1)

表 1 定量PCR引物序列 Tab.1 Primer sequence for real-time quantitative PCR 基因Gene 序列Sequence (5'~3') GenBank登录号GenBank accession No. GH F: CTCATCAAGGCCAGTCAGGAT XM_003968318 R: CTCCACCTTGTGCATGTCCT GHR1 F: TTGGGTCAACACGGACTTCT XM_011615550.1 R: CTTCAGGATCTTTTGCCTTCTT IGF1 F:GGCAAACAGCGTGAATGAG AB465576.1 R:TCAACACGGAAGCCAGGA β-actin F:AGAGGGAAATCGTGCGTGAC XM_003964421.2 R:GAGGAAGGAAGGCTGGAAAAG

表 1 定量PCR引物序列 Tab.1 Primer sequence for real-time quantitative PCR

所有数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示，使用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(One- way ANOVA)和LSD来检验不同处理组间基因表达量的差异，P < 0.05为差异显著，分析所得数据使用Origin 2017软件进行绘图。

从实验结果得知，在实验第6天，蓝、绿、黄光处理组的受精卵开始孵化，白光处理组的受精卵在第8天开始孵化(表 2)。白光处理组的受精卵与其他光色相比，孵化出仔鱼延缓了2 d。

表 2(Tab.2)

表 2 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼全长的影响 Tab.2 The effect of spectra on the total length of Takifugu rubripes 实验时间 Experimental time (d) 全长Total length 蓝Blue (λ450 nm) 绿Green (λ525 nm) 黄Yellow (λ590 nm) 白White (λ400~780 nm) 1~5 – – – – 6 2.801±0.026 2.725±0.037 2.729±0.025 – 7 2.750±0.020 2.814±0.022 2.780±0.023 – 8 2.960±0.020b 3.038±0.022a 2.859±0.037c 2.925±0.024bc 9 3.097±0.025a 3.097±0.025a 3.058±0.032ab 2.984±0.025b 10 3.081±0.028ab 3.001±0.035a 3.083±0.020ab 3.095±0.030a 11 3.123±0.026ab 3.094±0.045a 3.198±0.030b 3.150±0.036ab 12 3.258±0.039 3.232±0.039 3.253±0.034 3.203±0.028 13 3.320±0.030a 3.235±0.034ab 3.199±0.025b 3.119±0.052 c 14 3.340±0.044 3.337±0.040 3.335±0.036 3.306±0.037 17 3.195±0.033c 3.324±0.047ab 3.412±0.027a 3.266±0.040bc 20 3.373±0.047a 3.157±0.054b 3.363±0.048a 3.068±0.074b 23 3.542±0.055 3.399±0.068 3.469±0.165 3.189±0.196   注：数据均表示为平均值±标准误(Mean±SE) (n=15)；相同字母代表各处理组间无显著性差异(P > 0.05)，不同字母表示各处理间差异显著(P < 0.05)，下同   Note: Values are expressed as Mean±SE (n=15). The same letter indicates no significant difference between the treatment groups (P > 0.05), and different letters indicate significant differences between treatments (P < 0.05), the same as below

表 2 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼全长的影响 Tab.2 The effect of spectra on the total length of Takifugu rubripes

在孵化后第6、7天，不同光谱下初孵仔稚鱼全长未出现显著性差异，但蓝光组仔稚鱼全长平均值高于绿、黄光组。在随后的生长过程中，白光组仔稚鱼全长始终低于其他光照组。在第17天，黄光组仔稚鱼全长显著高于蓝、白光组(P < 0.05)，但蓝光组出现快速生长，在第20天，蓝、黄光处理组仔稚鱼的全长显著高于绿、白光组(P < 0.05)，在第23天，各处理组之间无显著性差异，但蓝光处理组仔稚鱼的全长最大。

第6天，不同光谱组体长未出现显著性差异，7 d时，绿光组的仔稚鱼体长与蓝光组出现显著性差异(P < 0.05)，7、8 d，黄光组体长显著高于绿光组(P < 0.05)。同样，17 d后，蓝光组体长生长较快，在22 d时显著高于绿光、白光组(P < 0.05)。23 d，蓝光组的体长平均值达到最高，但与其他光谱组相比，无显著差异，白光组仔稚鱼体长变化情况与全长相似。

第6天，蓝光组红鳍东方鲀仔鱼头长与绿、黄光组出现显著性差异(P < 0.05)，7 d时，不同光谱处理组的差异不显著，在第11天，黄光组与蓝、绿光组无显著性差异，但与白光组差异性显著(P < 0.05)。在第17天，蓝、绿、黄光组显著高于白光组(P < 0.05)。在第23天时，黄光组的头长最大。

在实验第6天时，绿光处理组仔稚鱼的躯干长与蓝、黄处理组出现显著性差异(P < 0.05)，第8~11天，仔鱼的躯干长逐渐减小，而黄光组仔稚鱼的躯干长从第7天开始逐渐增长，在第10天时，黄光组的躯干长显著高于绿光组(P < 0.05)；17 d后，白光组与绿光组无显著性差异，第23天，蓝光组下仔稚鱼的躯干长最大。

在6、7 d时，不同光谱下仔稚鱼的尾长无显著性差异，在第8天，蓝、白光谱下的尾长与绿光组出现显著性差异(P < 0.05)，8 d时，蓝、黄、白光组显著高于绿光组(P < 0.05)，20、23 d，蓝、绿、黄组之间无显著性差异，且平均值都高于白光组。

图 1(Fig. 1)

图 1 光谱对红鳍东方鲀仔稚鱼形态性状的影响 Fig.1 The effect of spectra on the morphological character of Takifugu rubripes

在不同光谱下初孵仔稚鱼眼径无显著性差异，在第7、8天，绿光组显著高于蓝光组(P < 0.05)。在第9、10天，各处理组无显著性差异。11 d后，不同光谱下的眼径呈现不规则的“M”型趋势，在第17天后，黄光组下的眼径一直高于其他处理组。

对于红鳍东方鲀仔稚鱼的体高，仅在8、14、23 d时，不同处理组之间出现显著性差异。在第8天，绿光组显著高于黄光组(P < 0.05)，与蓝、白光组无显著性差异。14 d，白光组显著高于蓝、绿光组(P < 0.05)，但与黄光组无显著性差异；第23天，黄光组与绿光组有显著性差异(P < 0.05)，与蓝、白光组无显著性差异。

不同光谱对GH基因相对表达量有显著影响，蓝光下，GH基因表达量显著高于黄、白光组(P < 0.05)，但与绿光组的表达量无显著性差异(图 2A)。对于GHR1基因，不同光谱下基因的表达量无显著性差异，但蓝光下GH基因的表达量最高，依次为黄、绿、白光(图 2B)。蓝、绿光下IGF1基因表达量较高，但与黄、白光组的表达量之间无显著性差异(图 2C)。

图 1(Fig. 1)

图 2 光谱对红鳍东方鲀生长相关基因表达的影响 Fig.2 The effect of spectra on the expression of growth-related gene in Takifugu rubripes

研究表明，鱼类受精卵的孵化受温度、盐度、pH、溶解氧等环境因子的影响(杨明秋等, 2012; 戈志强等, 2003)，而光作为重要的环境因子之一，对鱼类受精卵的孵化、仔鱼的生长也有着重要的影响(柳学周等, 2004; Villamizar et al, 2009; Blanco-Vives et al, 2010)。本文研究了不同光谱(蓝、绿、黄、白)对红鳍东方鲀受精卵孵化和仔稚鱼形态性状的影响。结果显示，蓝、绿、黄光处理下的第6天，受精卵开始孵化，且各组之间的全长、体长、尾长、眼径、体高均无显著差异，但蓝光下的头长显著高于绿、黄光组，绿光下的躯干长显著高于蓝、黄光组的躯干长。而白光组在第8天开始孵化出仔稚鱼。分析认为，在蓝、绿和黄处理组中，受精卵受到单色光刺激，促进了受精卵的孵化，导致蓝、绿和黄光组中受精卵比白光组提前2 d孵化。Downing等(2002)关于光谱(蓝、绿和白)对黑线雪鱼(Melanogrammus aeglefinus)受精卵影响研究中，并未发现光谱对黑线雪鱼的孵化有显著性差异，这可能是由于不同物种对不同光谱的敏感度不同，具有种属特异性(Boeuf et al, 1999)。在实验结束时，蓝光下仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长的平均值最大，黄光下仔稚鱼头长、眼径和体高的平均值最大。分析认为，这可能是由于仔稚鱼不同性状对不同光谱的敏感度不同。蓝色光谱对欧洲舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)仔鱼的生长有促进作用(Villamizar et al, 2009; Blanco-Vives et al, 2010; Sierra-Flores et al, 2016)，这与本研究结果相似。欧洲舌齿鲈受精卵在孵化后30 d，蓝光可以促进其仔鱼生长；同时，对于其器官发育，蓝光下仔稚鱼牙齿发育率为100%，白光、红光下的发育率分别为63%、40%，鱼鳔也是蓝光下发育的最好，体长、体重也一样(Villamizar et al, 2009)。本研究中，蓝光促进了仔稚鱼的生长(全长、体长、躯干长和尾长)。由此，可以推测，优势光谱对仔鱼生长和器官发育的影响相似。

环境因子如温度、光周期、光谱会影响生物体内激素的变化(Kim et al, 2016)，生长激素GH/IGF轴是脊椎动物生长的调节核心，GH可以通过刺激细胞分化直接影响生长，IGF1导致细胞增殖，从而促进生物的生长(Björnsson, 1997; Duan, 1997; Green et al, 2010)。本研究中，蓝光下GH基因的相对表达量显著高于黄、白光组，而GHR1、IGF1基因在不同光谱下的表达无显著性差异，但蓝光组GHR1、IGF1基因表达量均较其他光处理组高。从图 4、图 5可以看到，蓝、黄光组的尾长、头长发育较快，在前10 d，头长处于快速生长阶段。对于体高，各光谱处理组总体变化不大，分析认为，处理组中的仔稚鱼体内卵黄囊在不断消耗，体积逐渐变小，而仔稚鱼又在不断生长，故在实验前20 d，体高的变化幅度不大，待卵黄囊完全消耗时，体高的发育出现明显差异(图 7)。

综上所述，蓝、绿、黄光处理组的受精卵比白光处理组早2 d孵化；在实验结束时(第23天)，蓝光处理组仔稚鱼的全长、体长、躯干长和尾长生长最快，黄光处理组头长、眼径和体高生长较快。对于生长相关基因，蓝光下的生长相关基因GH相对表达量最高，对于GHR1、IGF1基因，不同光谱下基因的相对表达量无显著性差异，因此，建议在红鳍东方鲀受精卵孵化时，可采用蓝色光谱照射，以减少孵化时间，促进仔鱼生长，缩短养殖周期，节约成本。