背角无齿蚌(Anodonta woodiana)是起源于我国黑龙江和长江流域的一种淡水双壳贝类(Demayo et al, 2012)。其不仅具有食用、育珠等传统的水产经济价值，而且具有净水、监测水体污染等重要生态价值(Liu et al, 2008; Yang et al, 2008; Chen et al, 2012; 孙珊等, 2017)。特别是该蚌已被筛选为“淡水贝类观察”研究体系的专用指示生物和模式动物(杨健等, 2005; 杨健, 2015)，分别应用于水污染的被动监测(刘洪波等, 2009; Bian et al, 2009; Liu et al, 2010)、主动监测(陈修报等, 2014; Chen et al, 2019)和毒理学研究(陈修报等, 2017; Liu et al, 2018)。值得注意的是，由于人类活动对水域生态环境的破坏，野生背角无齿蚌的资源量正急剧减少(董志国等, 2004)，因此，迫切需要有效的人工繁养增殖和自然种群复壮。

稚蚌是指钩介幼虫从宿主鱼身上破囊脱落下来的幼体(常亚青, 2007)。背角无齿蚌稚蚌阶段的死亡率最高，是决定其人工繁养成败的关键时期(苏彦平等, 2014)。虽然，闻海波等(2006)报道了圆背角无齿蚌(Anodonta woodiana pacifica)刚脱落(第1天)和生长第6天的稚蚌形态特征。徐良等(2016)初步研究了背角无齿蚌30 d稚蚌的壳长等生长状况。刘士力等(2009a)对背角无齿蚌稚蚌形态进行了较为详细的记录，并对壳长的生长特征进行了研究。Chen等(2015)在人工繁养背角无齿蚌稚蚌的研究中取得突破。然而，以上报道都未对稚蚌的形态、器官及生长动态等进行连续性、系统性的研究。本研究通过连续采集背角无齿蚌稚蚌(1~30 d)的个体样本，探究和掌握其形态变化、器官发育和个体生长等方面的特征，以期为其人工繁养、种质资源保护、自然种群恢复及水污染监测指示生物群体的建立、开发和利用提供理论支撑和技术基础。

1 材料与方法 1.1 样本采集

背角无齿蚌的人工繁育在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地进行。2019年5月中旬，从成熟母蚌中人工获取钩介幼虫，并选用黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)作为寄生鱼(Chen et al, 2015)，在稚蚌脱落高峰时将其转移至自主研发的立体循环水淡水贝类繁育系统(LFER-FWMW-1901型，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心)进行培育。每天16:00~17:00进行稚蚌的采集，连续采集30 d，每次在同一培育池中随机采集30个稚蚌。

1.2 形态结构分析

应用光学显微镜(BX-51型, Olympus, 日本)和连续变倍体视显微镜(XTL-3400型, 上海精密仪器仪表有限公司)观察、记录其形态和器官发育情况。拍照并用测量软件(Olympus, 日本)测定壳长和壳高。利用tpsdig2软件(闫宝荣等, 2010; 姜涛等, 2011)对拍摄好并经过处理的稚蚌形态建立的地标点(图 1)，获取地标点的坐标值，建立地标点数据文件。随后，使用tpsRelw计算平均型，并用tpsRegr根据稚蚌的平均型对不同阶段稚蚌进行薄板样条分析并绘制网格图。

1.3 生长分析

利用绝对生长率(AGR)(Mohamed et al, 2006)和相对生长率(IGR)(Hopkins et al, 1992)比较稚蚌的生长速率：

$ {\rm{AGR}} = ({L_t} - {L_{\rm{i}}})/t $

式中，L_i为初始长度，L_t为在t时刻的最终长度。

$ {\rm{IGR}} = ({\rm{ln}}t - {\rm{ln}}i)/t $

式中，lni为初始长度的自然对数，lnt为在t时刻长度的自然对数。

通过对数据进行线性函数拟合来分析壳长和壳高之间的关系(Kovitvadhi et al, 2009)：

$ {\rm{Log}}Y = {\rm{Log}}b + a{\rm{Log}}X $

式中，LogY和LogX为指壳长、壳高的对数，Logb为截距，a为斜率。线性回归得到的a值显示生长是等速的(a=1)还是异速的(负异速：a < 1；正异速：a > 1)。变量之间的关联程度由相关系数(R²)计算得出。

1.4 统计分析

应用SPSS 23.0和Excel 2010进行数据分析。选定相关系数(R²)为最大值的函数关系式作为最佳回归曲线(姚建平等, 2018; 徐大凤等, 2019)；利用形态地标点法(闫宝荣等, 2010; 姜涛等, 2011)分析稚蚌的形态变化；应用独立样本t检验分析壳长和壳高的绝对生长率、相对生长率之间的差异。P < 0.05表示相关性或差异水平显著。

2 结果 2.1 形态变化

稚蚌的形态变化见图 2。第1天，稚蚌的外部形态类似于成熟的钩介幼虫(图 2A)，壳钩依然存在(图 2B)；第4天，稚蚌的内侧已长出1对新壳，壳钩完全退化，双壳可完全闭合(图 2C)；第10天，稚蚌分泌形成的新贝壳的生长轮清晰可见，前、后端分化明显(图 2D)；第15天，稚蚌的前后端增长显著，呈椭圆形，铰合部呈直线生长(图 2E)；第20天，稚蚌的铰合部前缘和后缘开始向上生长(图 2F)；第25天，稚蚌的背角开始形成(图 2G)；第30天，稚蚌的形态已趋于成体(图 2H)。

使用tpsRegr软件将不同日龄稚蚌的差异可视化，进行网格变形分析后获得网格变形图(变异扩大3倍)(图 3)。从图 3可以看出，在稚蚌1~30 d的生长过程中，铰合部的前缘和后缘(1、3地标点)向上突起，壳顶(2地标点)相对向内收缩，中轴线前端(4地标点)生长迅速、向外侧扩展，中轴线后端(5地标点)向腹缘方向生长，腹缘(6地标点)相对向后端生长。

2.2 器官发育

第1天，稚蚌最明显的特征是出现斧足，可自由爬行(图 2A)；第4天，稚蚌的内脏团较为明显(图 2C)；第10天，稚蚌内脏团和鳃均清晰可见，前、后闭壳肌已经形成(图 2D)；第15天，稚蚌的肠道和心脏清晰可见(图 2E)；第20天，稚蚌鳃的外端与外套膜逐渐愈合，形成进水管和出水管(图 2F)；第25天(图 2G)和第30天(图 2H)，稚蚌的器官已全部发育完成。

2.3 生长特征

表 1为背角无齿蚌第1~30天的形态测定结果。第1天，稚蚌的壳长为(0.257±0.007) mm，壳高为(0.291±0.011) mm；第15天，稚蚌的壳长为(1.399±0.128) mm，壳高为(0.933±0.115) mm；第30天，稚蚌的壳长为(5.746±1.191) mm，壳高为(3.288±0.657) mm。背角无齿蚌稚蚌壳长、壳高与日龄之间均呈指数型相关关系(图 4)。

第1、15和30天稚蚌的壳长与壳高比分别为0.883、1.499和1.748。壳长和壳高比在第26天达到最高值(1.779)(表 1)。稚蚌壳长的绝对生长率明显高于壳高的绝对生长率(P < 0.05；图 5a)。壳长绝对生长率的峰值(0.676)在第26天出现；壳高绝对生长率的峰值(0.351)出现在第29天。壳长的相对生长率也明显高于壳高的相对生长率(P < 0.05)，壳长相对生长率的峰值出现在第10天，达0.151；壳高相对生长率的峰值出现在第13天，达0.092(图 5b)。壳长和壳高之间呈正异速(a > 1)生长，即壳长比壳高增长得快(图 6)。

3 讨论 3.1 形态变化

一般来说，通过传统形态学方法来了解生物生长发育较为简便、直观、成本低，但其结果可能会受到不够客观或不够精确的限制。本研究采用的地标点法能较灵敏地把握水生动物(特别是甲壳类、软体动物和鱼类)的形态变化(陈新军等, 2013)。该法主要优点是可将研究对象的形状作为变量来进行比较，从而找出形态学观察中难以发现的形态变化特征(Urban, 2002)，并且以图形化的方式更加直观地再现形态差异，清晰展现稚蚌形态变化的趋势(Ponton, 2006)。在本研究中，选择稚蚌的壳顶、铰合部前缘后缘、中轴线前端后端等6个特征点作为地标点，1、2、3、5为Ⅰ型地标点，4、6为Ⅲ型地标点(图 1)。其中，壳顶(2地标点)、稚蚌前端(4地标点)和腹缘(6地标点)在形态变化中最明显(图 3)。壳顶是原钩介幼虫的双壳所在位置，是形成新贝壳的中心点。壳顶(2地标点)相对向内收缩，提示壳顶的形成可能是钩介幼虫双壳退化和稚蚌贝壳增长的双重作用引起的。稚蚌壳前端(4地标点)显示出明显的近乎水平向外侧生长的趋势，表明该部分是决定稚蚌形态生长方向的重要因素，且生长速率较快。腹缘(6地标点)相对向后端生长，值得注意的是，腹缘是稚蚌壳钩的所在位置，这可能与稚蚌生长过程中壳钩退化有关。壳钩是钩介幼虫附着寄生鱼类、完成寄生过程的主要器官(陈修报等, 2011)。传统观点认为，刚脱落的稚蚌壳钩就已经退化(陈修报等, 2010; 王宏等, 2007)。刘士力等(2009a)观察到刚脱落的稚蚌壳钩并没有退化，但对其具体退化时间没有详细记录。本研究首次发现虽然稚蚌壳钩的大小相对于钩介幼虫时期明显变小，但直到第4天才完全退化；且在第1~4天，双壳由于壳钩的存在而无法紧密闭合。另外，在第4天之前，稚蚌的鳃尚未发育完全(图 2)，还不能完全进行自主呼吸；故认为，稚蚌壳钩的“延迟”退化可能与维护蚌体的呼吸效率有关。

3.2 器官发育

本研究中，背角无齿蚌稚蚌的大部分器官出现的时间与先前的研究较一致(Chen et al, 2015)，即第1天观察到斧足，第4天观察到内脏团，第10天观察到鳃和闭壳肌，第15天观察到肠道和心脏，第20天观察到进水管和出水管。然而，与其他淡水贝类相比具有明显差异性。例如，淡水帆蚌属贝类Hyriopsis myersiana的鳃直到第13天才完全发育成熟，100 d后进水管和出水管才完全发育成熟(Kovitvadhi et al, 2009)；三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)的鳃直到第15天才完全发育成熟，27 d后才出现进水管和出水管(刘士力等, 2009b)。鳃是淡水贝类的呼吸器官，进水管和出水管则是促进摄食的重要器官(陈修报等, 2011)。背角无齿蚌稚蚌相关器官的出现时间均明显早于H. myersiana和三角帆蚌，提示前者呼吸和摄食的需求较早。

3.3 生长特征

刘士力等(2009a)研究显示，背角无齿蚌稚蚌壳长与日龄之间呈三次函数(L=370.11–32.66t+14.27t²– 0.15t³, R²=0.9526)生长，而本研究发现，背角无齿蚌1~30 d稚蚌的壳长与日龄之间呈指数型相关关系(L= 0.2577e^0.1245t, R²=0.9801)(图 4a)。前者是每5 d测定1次稚蚌规格，而本研究是每天采样进行连续测定，因此，本研究拟合的生长关系更精准地反映稚蚌的生长特征(R²更接近于1)。本研究首次阐明了稚蚌壳高与日龄的关系(图 4b)，壳长和壳高的绝对、相对生长率(图 5)及二者的关系(图 6)。刘士力等(2009b)研究发现，刚脱落的三角帆蚌稚蚌的平均壳长为0.221 mm，平均壳高为0.249 mm，其规格小于刚脱落的背角无齿蚌稚蚌(平均壳长为0.257 mm，平均壳高为0.291 mm)。此外，背角无齿蚌稚蚌生长速度比三角帆蚌快。需要关注的是，背角无齿蚌壳长、壳高的绝对生长率和相对生长率的峰值及达到峰值的时间是不同的，而相对生长率更加准确的反映出稚蚌生长发育的关键时期(如在峰值出现期，正是稚蚌鳃和心脏等关键器官的发育期)，因此，建议在背角无齿蚌人工繁养过程中根据相对生长率适时调整繁养对策。

背角无齿蚌稚蚌的壳长和壳高呈正异速生长关系(a > 1，即壳长比壳高增长得更快)(图 6)，这与壳长和壳高的比值相一致(表 1)。通过比较可发现，刚脱落的背角无齿蚌和三角帆蚌的壳长/壳高比值相近，均为0.9左右(刘士力等, 2009a、2009b)。随着日龄的增加，背角无齿蚌稚蚌前后两端的生长速度更快，30 d稚蚌的壳长/壳高比值为1.7 (表 1，图 6)，形状类似于椭圆形；而三角帆蚌30 d稚蚌的壳长约为2 mm，壳高约为1.5 mm，壳长/壳高比值为1.3 (刘士力等, 2009b)，形状向三角形演变(刘士力等, 2009b; 孙朝虎等, 2019)，表明背角无齿蚌稚蚌的生长(特别是壳长)速度相对更快。作者认为这是由二者的种间差异造成的。淡水贝类中，基于壳长和壳高间生长关系(包括壳长和壳高的比值)的差异是否具有种类鉴别的潜力尚待进一步确证。

4 结论

本研究较为连续而系统地研究和阐释了背角无齿蚌1~30 d稚蚌的形态变化、器官发育及生长速率的特征。稚蚌形态变化的总体特征为铰合部的前缘和后缘向上突起，壳顶相对向内收缩，前端生长迅速、向外侧扩展，后端向腹缘方向生长，而腹缘相对向后端生长。稚蚌器官发育形成的先后顺序可能是斧足、内脏团、鳃、闭壳肌、心脏、肠道、进水管和出水管，直至最后发育完全。稚蚌生长的特点表现在壳长、壳高与日龄之间均呈指数型相关关系，生长速率呈前期快、后期慢的生长特征，且壳长与壳高为正异速生长关系。上述结果将为破解人工繁育过程中稚蚌期死亡率高的“瓶颈”提供思路，也可为背角无齿蚌的种质资源保护、自然种群恢复及水污染监测指示生物群体的建立、开发和利用提供理论支撑和技术基础。