准确地掌握目标物种的分布信息是生物多样性研究的必要前提之一，且对生物地理学、保护生物学和生态学等学科领域的研究也具有重要意义(Lodge et al, 2012, Ficetola et al, 2008)。与陆地环境不同，受到水深、温度、光照、压力等诸多因素限制，对水生生物进行直接观察和识别难度很大(Bogich et al, 2008)，特别是某些低密度或具有独特生活史的种群(Dejean et al, 2011)。目前，传统调查方法，例如拖网、影像和声学调查等，通常成本高昂且会对珍稀物种造成巨大威胁(Murphy et al, 2010)。随着分子生物学研究的不断发展，环境DNA (environmental DNA, eDNA)技术的出现使得“非侵入”式资源调查和物种跟踪成为可能(Taberlet et al, 2012)。该技术是通过采集并检测生物体向水环境中释放的DNA片段来判断生物是否存在于该水域，并进行生物量评估的一种新兴技术(Ficetola et al, 2008; Takahara et al, 2012)。eDNA的来源广泛，可以是生物的表皮、黏液、粪便、尿液和生殖细胞等(Turner et al, 2015; Klymus et al, 2015; Wilcox et al, 2015)，并且只需通过少量水样的采集分析即可满足调查目的(Thomsen et al, 2012a、b)，从而降低采样成本，减少采样工作对环境和生物体的干扰和破坏。eDNA技术很大程度地弥补了传统调查方法的不足，在物种保护和生物量评估等方面发挥重要作用。

已有学者对eDNA在河流中的扩散或降解进行研究(Deiner et al, 2014; Jane et al, 2015; Sansom et al, 2017)，发现水体中的eDNA在自然条件下易降解，且会在环境中扩散，以短片段的形式移动到远离释放源的位置。此外，仅依靠分析eDNA本身无法就其源头及释放时间进一步溯源。然而，对于在面积、水流及深度相比河流都更为复杂的海洋环境中，eDNA的分布规律及变化研究仍旧十分有限(Yamamoto et al, 2016; O’Donnell et al, 2017)。了解eDNA在水体中扩散和滞留的规律对于采样设计和空间推断(即样本所代表的可能出现的目标生物的位置)具有重要意义(Shogren et al, 2017)。对水体中eDNA变化规律的阐释是利用其进行目标物种追踪及生物量评估的前提。一般而言，利用eDNA技术对目标物种进行追踪是为获取其准确的分布位置和种群信息。而eDNA在水体中的分布受多种因素影响，包括物种分布、水流、沉降和沉积物再悬浮等(Deiner et al, 2014; Robison et al, 1981; Saba et al, 2012; Wotton et al, 2001; Maggi, 2013)。这些除物种分布以外的其他因素的影响所导致eDNA的杂乱分布是研究者不想看到的。如何避免这些因素影响，从而通过eDNA获取有效的目标物种信息是研究者一直以来想要解决的问题。而目前已有研究对eDNA的水平分布讨论较多(Thalinger et al, 2019)，很少涉及垂直分布的特点，或只涉及了单一介质(Turner et al, 2015)。本研究选用中国对虾( Fenneropenaeus chinensis)作为目标物种，选择平均水深较大的黄海作为研究水域，以eDNA垂直分布作为主要考察要素。鉴于沉积物也会对水体中eDNA浓度造成一定程度的影响(Turner et al, 2015; 魏楠等, 2020)。将水体与沉积物的相互效应也考虑在内，希望能更加科学合理地解释eDNA的分布特点。本研究分为两部分内容：(1) 在黄海中南部海域8个站位的不同水深(表、中、底)采水，研究水体中中国对虾eDNA的分布规律；(2) 采集表层沉积物并进行室内实验，分析沉积物对水体的影响方式。通过本研究希望能够了解中国对虾eDNA在水中的分布规律和影响因素，更合理地设计采样工作以及更有效地将eDNA技术推广到其他物种的研究中。

1 材料与方法 1.1 采样站位

样品来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所蓝海101号科研调查船于2019年12月21日在黄海的调查。根据邓景耀等(1990)对中国对虾的研究方法，在中国对虾越冬洄游路线上，选取8个站位，利用分层采水方法在各站位分别采集表、中、底3个水层水样。其中，表层水在距海面3 m深的位置取水，中层水在20 m左右水深采水，底层水在该站位水深于海底以上5 m左右位置取水(具体采样深度根据海况及作业难度有所变动)，具体采样位置见图 1，采样水深信息见表 1。

1.2 目的基因及特异性引物

选择中国对虾的线粒体细胞色素C氧化亚基Ⅰ基因(mtDNA COⅠ)进行研究。引物参照李苗等(2019)，其中，COI PF与COI PR作为普通PCR引物用来制备质粒标准品DNA。COI DF与COI DR作为定量PCR引物，扩增的目的片段为普通PCR引物所扩增片段的一部分。引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 中国对虾eDNA富集

使用滤膜法对海水中eDNA进行富集。选取直径为47 mm、孔径为0.45 μm的玻璃纤维滤膜对1 L所采水样过滤(李苗等, 2019)，每个水样取3个平行样本及3个阴性对照，共计75个样本。为避免样品相互污染，过滤完后每张滤膜用锡纸单独包裹再放入封口袋中并做好标记，–20℃保存直到进行DNA提取。

1.4 eDNA提取

使用试剂盒进行eDNA提取，具体提取方法参照Renshaw等(2015)并加以改进，其具体提取步骤为：

(1) 将滤膜从冰箱取出后，用剪刀去除滤膜边缘多余部分，再剪成条状，置于2 ml无菌离心管中；向离心管内加入570 μl的Buffer ATL和60 μl的蛋白酶K溶液(20 mg/ml)，涡旋震荡，将混合液混合均匀，在恒温水浴锅内65℃水浴3 h，水浴期间，每隔15 min轻轻颠倒混匀离心管，使其充分裂解，裂解完成后取出并挤干剩余滤膜；

(2) 向离心管内加入630 μl的Buffer AL和630 μl的无水乙醇，涡旋震荡15 s，使其混合均匀；将2 ml离心管中的混合液转移到DNeasy离心柱中，25℃ 8000 g离心1 min；

(3) 向离心柱内加入500 μl Buffer AW1，25℃ 8000 g离心1 min，再向离心柱内加入500 μl Buffer AW2，25℃ 8000 g离心3 min；

(4) 将离心柱放入1.5 ml的无菌离心管中，在离心柱中央加入100 μl Buffer TE，25℃孵育1 min。25℃ 8000 g离心1 min；

eDNA提取完成后，立即使用超微量紫外分光光度计检测其浓度及质量，若eDNA样品的浓度高于250 ng/μl (实时荧光定量PCR试剂盒要求待测样品的DNA浓度低于250 ng/μl)，则将其进行稀释。在每个eDNA样品内吸取10 μl DNA溶液，用作琼脂糖凝胶电泳检测及PCR定量分析，其余90 μl eDNA溶液–80 ℃保存备用。

1.5 中国对虾eDNA定量分析

所有提取的eDNA样品采用BBI生命科学有限公司的2×TaqMan Fast qPCR Master Mix (Low Rox)实时荧光定量PCR试剂盒进行定量分析。定量PCR (Quantitative PCR, qPCR)扩增的反应体系按照试剂盒说明书要求采用20 μl体系(表 3)。qPCR扩增反应程序：94℃ 3 min；94℃ 5 s，60℃ 35 s，40个循环。qPCR扩增仪器为ABI 7500型定量PCR仪，质粒标准品DNA与未知浓度eDNA样品在每个96孔板均设计3个qPCR重复，每个96孔板设置3个阴性对照(无模板)与3个阳性对照(中国对虾基因组DNA)，质粒标准品DNA依次从10⁷ copies/μl以10倍的浓度梯度稀释到10 copies/μl。实验获得的所有数据采用绝对定量法分析，每个eDNA样品最终的拷贝数以阳性扩增样品的平均值为准，应用系统软件SDS 1.4.0.25自动计算Ct值，并生成标准曲线与扩增曲线。

1.6 表层沉积物释放实验设置

选择黄海中南部的3个站位(8694、10594和13994)采集表层沉积物(采样站位根据该海域底质类型进行选择)。表层沉积物的采集工作在同一航次中完成，采样时，将采泥器垂直下放至海底抓取沉积物，待采泥器闭合后提出海面移至夹板，排出采泥器中残留海水以避免沉积物悬浮进入水体。采样前后，采泥设备用双蒸水冲洗2遍以避免样品交叉污染。样品放入无菌封口袋，于–20℃冷库中保存，运输过程用冰块保持温度在–10℃左右，避免样品反复冻融。2020年1月3日样品送达实验室后立即进行实验。3个站位的表层沉积物分为3个实验组。每个实验组为1个15 L的塑料整理箱(长×宽×高：35 cm × 24 cm × 20 cm)，内装1000 g沉积物样品和10 L人工海水。实验过程中，所用人工海水经实验室qPCR检测，无中国对虾eDNA存在。实验启动时，分别混匀3个实验组，待沉积物重新沉淀后，采集1 L上层水样(3个平行样品)进行中国对虾eDNA富集，滤膜用锡纸单独包装，–20℃保存待用。取样后向整理箱中重新加入3 L人工海水以保证下次取样浓度一致。每日15:00取样，连续进行1周。所有实验组均在室内进行，室温保持在10℃，水温保持在6℃并通过空气泵持续曝气。所有实验设备均在实验前用高锰酸钾消毒，并用双蒸水冲洗。实验结束后，对所有样品统一进行eDNA的提取和qPCR检测。室内实验中国对虾eDNA的富集、提取及qPCR分析方法同上(1.3、1.4和1.5)。

1.7 数据分析

所有数据经标准化处理后使用Excel 2016、R 3.6.3及其集成开发环境R Studio软件处理。

2 结果与分析 2.1 引物特异性验证

2%的琼脂糖凝胶电泳检测表明，引物COI DF/ DR成功扩增了中国对虾mtDNA COⅠ长度为106 bp的目的片段，电泳条带单一明亮、无杂带(图 2)，与预期结果一致，说明所选引物特异性良好。

2.2 中国对虾COⅠ基因qPCR扩增的标准曲线

从图 3可以看出，本实验稀释的质粒标准品DNA浓度在10~10⁷ copies/μl范围内具有良好的线性关系，说明本研究建立的标准曲线能够准确地反应中国对虾mtDNA COⅠ基因的扩增。

2.3 中国对虾eDNA分布规律

检测结果显示，在黄海8个站位的表、中、底水样中，底层eDNA拷贝数与表层和中层具有显著差异(P=0.003, P=0.0009)。除个别站位外，底层水体eDNA拷贝数均大于表、中层水体(表 5)。8894、12394和14194站位表层eDNA浓度大于中层，其中，14194站位表层eDNA浓度最高，呈现了中国对虾eDNA分布规律为表层少、底层多(图 4)。

2.4 表层沉积物释放实验

室内沉积物释放实验结果显示，表层沉积物在外力作用下会向水体中释放大量中国对虾eDNA，其中，8694与10594站位在实验第1天释放量最高，分别为1624.06和3453.34 copies/L，而13994站位在第2天释放量达到最高，为1143.24 copies/L。3个实验组沉积物释放的eDNA拷贝数与时间呈负相关关系。均在第7天(2020年1月9日)趋于稳定且保持在较低水平(表 6和图 5)。

3 讨论 3.1 生物习性对其eDNA分布的影响

本研究发现，中国对虾在垂直方向上具有显著的分布规律。结合目标物种在不同发育阶段的生活习性和实际环境条件，对eDNA浓度进行分析推测，能够分析得到更为准确的物种分布位置和生物量情况。以往研究表明，中国对虾在越冬场主要以底栖的甲壳类、瓣鳃类、多毛类、蛇尾类(Ophiuroidea)及小型鱼类为食，还会摄食寄居蟹皮海绵(Suberites domumeula) (邓景耀等, 1990)。根据中国对虾这一摄食习性，可以推测中国对虾在黄海越冬洄游过程中应该集中分布于底层水体。而检测结果与这一推测相符：越冬期中国对虾eDNA底层浓度相对较大。同时，粪便和外壳作为越冬期中国对虾的主要eDNA来源，由于涌浪和沉降作用，这些物质会变成细小碎屑沉至底层水体(Turner et al, 2015)，也会导致底层水体中国对虾eDNA浓度升高。此外，不同物种或同一物种在不同发育阶段，其eDNA的释放速率也存在一定差异(Minamoto et al, 2017; Maruyama et al, 2014)。将种群构成因素纳入到考量范围，也是提高eDNA技术准确性的有效途径。

3.2 水体浑浊度对eDNA分布的影响

结果显示，中国对虾的eDNA在自然水体中总体呈现底层浓度高、表层浓度低的特点，但8894、12394和14194的检测结果与其他站位存在差异。在采样过程中发现，这3站的水体较为浑浊，泥沙量大，可能是导致eDNA浓度反常变化的原因之一，怀疑该海域存在垂直流，导致底部泥沙悬浮，从而对eDNA浓度存在一定程度影响。具体影响方式需要开展更多实验来验证。

3.3 沉积物对eDNA分布的影响

本研究发现，eDNA会在水体与沉积物之间双向移动，粪便和外壳作为中国对虾越冬期的主要eDNA来源，不仅会在沉降作用下进入沉积物，并且沉积物会在外力(如垂直流、底栖生物扰动和人为干扰等)作用下，导致沉积物再悬浮(Turner et al, 2015)，向周围释放eDNA，使得底层水体eDNA浓度升高，从而使测量值高于真实值。研究表明，eDNA会在水体与沉积物之间转移，因此，将沉积物与水体结合进行分析更有意义(Leff et al, 1992)。相比水体，沉积物中含有更多的eDNA(Corinaldesi et al, 2005; Dell’Anno et al, 2004)。其原因是：(1) 生物的粪便、外壳和脱落的组织会在沉降作用下进入沉积物中，使沉积物中eDNA浓度升高(Turner et al, 2015)；(2) eDNA可被沉积物中的表面活性颗粒吸附，受保护而不被降解，并且这些颗粒还会吸附核酸酶，导致酶活性降低，从而延长eDNA降解时间(Pietramellara et al, 2009)，使沉积物中eDNA不断积累，浓度上升。以上两点说明了沉积物在eDNA研究中的重要性。但大多数研究只是单独对沉积物中的eDNA进行研究，鲜有研究者将沉积物与周围环境结合看待(魏楠等, 2020)，因而沉积物对周围环境的影响极易被忽视。本研究揭示了沉积物通过再悬浮释放eDNA的方式对周围水体造成巨大影响，如何屏蔽这一影响，减少测量误差，是接下来研究的重点。

3.4 再悬浮eDNA残留时间的区别

室内实验发现，表层沉积物中的中国对虾eDNA溶解进入水体7 d后近乎完全降解。而这与李苗等(2018)对中国对虾eDNA水中残留时间的研究结果存在差异，其研究发现，新鲜的eDNA可以在水体中残留27 d。同时还发现，eDNA降解时间受eDNA浓度影响。eDNA浓度较高，其降解时间较长(李苗等, 2020)。考虑到本研究的样本是在野外采集到的，其浓度远比养殖场中的样品浓度小。因此，本研究中沉积物释放的eDNA残留时间相对较短。另外，新鲜的eDNA被生物体释放进入水体时发生降解，致使片段长度缩短，并在沉降作用下保留在沉积物中，沉积物又在外力作用下再悬浮，导致所释放短片段eDNA环境改变，加速了降解过程，因此，沉积物释放的eDNA仅能残留较短时间。已有研究表明，不同片段长度的eDNA在残留时间上具有显著差异(Dejean et al, 2011)。在以后的研究中，可以根据eDNA片段长度的不同，对eDNA进行区分，选择合适的引物长度进行qPCR检测，以此降低沉积物释放的干扰。

在了解目标生物的生活习性的前提下，研究人员进行有针对性的采样设计，可以使检测结果更加可信。但需要对再悬浮的eDNA进行有效区分，以避免测量结果的误差，从而将eDNA技术更好地推广到其他水生物种的生态系统研究中。