溶解氧(DO)是水生生物赖以生存的必要条件之一，影响其生长存活、繁殖、发育等生理过程。水体中DO含量常随环境变化发生波动，近年来，随着全球环境变化和人类活动的影响，水体低氧现象频发，给水产养殖产业造成严重影响。研究表明，鱼类、甲壳类、贝类、棘皮类等许多水产养殖动物的暴发性死亡均与低氧环境相关(Wilhelm et al, 2005; 周作强等, 2013; 刘国山等, 2014; 孙盛明等, 2020)。当DO浓度＜2 mg/L时，水生生物即处于低氧环境，其活动行为、呼吸和能量代谢、生理生化等会因低氧胁迫发生一系列复杂的改变，甚至死亡(Wannamaker et al, 2000; 徐贺等, 2016; 宋银都等, 2021; 吴碧银等, 2022)。当虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)受到低氧环境刺激时，会紧闭双壳，适应一段时间后，双壳慢慢打开，在DO浓度≤2 mg/L时，随着胁迫时间的延长，会出现外套膜萎缩、鳃丝黏连等现象，导致死亡率显著升高(夏玉莹等, 2021)；当DO浓度＜2 mg/L时，厚壳贻贝(Mytilus coruscus)可能仅以蛋白质代谢提供能量，当DO浓度＜1 mg/L时，厚壳贻贝无法再维持正常的代谢水平，会通过关闭贝壳、降低滤水率来减少摄食活动的能量消耗，维持机体的基础能量代谢水平(江天棋等, 2021)。在低氧胁迫下，酶活力的研究多集中在呼吸代谢酶以及抗氧化酶。呼吸代谢酶包括琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(COX)、乳酸脱氢酶(LDH)等，其活性的变化是代谢能力变化的直接反映；抗氧化酶的研究多为能在保护细胞免受氧化应激中发挥重要作用的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等(王盼等, 2021)。

低氧预适应(hypoxic preconditioning)是指机体受到多次短暂、非致死性的低氧刺激后产生内源性保护机制，适度的低氧胁迫训练可以降低动物机体对低氧或缺氧的应激反应，对机体组织产生保护作用，进而提高机体耐受能力(张世纪等, 2021)。目前，低氧预适应的研究多集中在对小鼠(Mus musculus)等高等动物的研究，低氧预适应可有效提高小鼠有氧运动能力及心肌丙二醛(MDA)水平，而且对长期低氧暴露的小鼠心肌损伤有一定的保护作用(孔海军等, 2020)；还可以通过激活BDNF/TrkB信号通路对小鼠产生神经保护作用(吴晓东等, 2019)。低氧预适应在水产中的报道相对较少，主要集中于鱼类、虾类和蟹类的低氧–复氧对机体生理生化指标的影响方面。Volodymyr等(2001)研究发现，低氧胁迫能够使金鱼(Carassius auratus)通过抗氧化系统调节机体获得一定的适应性，进而构成一种生化保护机制，使得复氧后的金鱼低氧应激最小。在贝类中，除了头足类可以利用较强的游泳能力躲避低氧环境外，移动能力差的种类只能通过机体调节来适应低氧环境的胁迫(陈峰等, 2021)。因此，探讨低氧预适应对贝类机体生理生化特性、组织等方面的影响，对贝类耐低氧研究、耐低氧新品种培育等方面的工作均具有重要意义。

魁蚶(Scapharca broughtonii)俗称赤贝、血贝、大毛蛤，是具有较高经济价值的大型蚶科贝类，因个体大，富含蛋白质、维生素、血红素等物质，在中国、韩国、日本等市场上深受欢迎(吴彪等, 2010; 赵庆等, 2019; 周建聪等, 2021)。目前，魁蚶已成为我国北方贝类苗种繁育、池塘养殖的重要种类之一，但低氧仍是魁蚶面临的一个重要胁迫。当自然海水中DO浓度＜2.5 mg/L时，魁蚶即会出现大量死亡(Senbokuya et al, 2019)。赵庆等(2018)、张高伟等(2019)分别研究了低氧胁迫下魁蚶的存活、酶活变化以及HIF-1α基因的变化特征，发现魁蚶对于短暂的低氧胁迫具有较强的耐受能力。然而，经过低氧预适应的魁蚶再次受低氧胁迫后，其机体在生理生化指标的变化特征有待研究。本研究对低氧预适应魁蚶的摄食率(ingestion rate, IR)、耗氧率(oxygen rate, OR)、排氨率(ammonia excretion rate, NR)、酶活等生理生化指标进行比较分析，以期为魁蚶低氧适应机制研究提供资料，同时为产业中提高魁蚶耐低氧能力策略的制定提供参考。

实验魁蚶于2021年4月取自山东东营养殖池塘，选择壳形完整的健康个体用于实验，壳长为(38.13±1.13) mm。实验前，魁蚶于温度为(17.6±1.0)℃的充气过滤海水中暂养7 d，实验期间，每24 h换1/2体积海水，并投喂小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutissima)。

魁蚶低氧预适应模型建立：将纯度为99.9%的N₂通入养殖槽的海水中，通过调整充气量，将海水DO浓度维持在(2.5±0.3) mg/L。将魁蚶置于此环境中24 h后转移至常氧[DO浓度为(7.5±0.3) mg/L]海水中恢复48 h，此为低氧预适应1次的魁蚶模型。

实验共设置3组：未进行低氧预适应的为对照组(C组)，低氧预适应2次为H₂组，低氧预适应4次为H₄组，每组设置3个平行。魁蚶低氧预适应模型建立后，测定低氧胁迫(DO约为2.0 mg/L) C组、H₂组和H₄组3组魁蚶在0、8、16、24和48 h时的IR、OR、NR以及酶活力，分析其变化特征。

摄食实验在直径为10.5 cm、高为12.0 cm的养殖桶中进行。低氧预处理后，分别从C组、H₂组和H₄组中随机取3只魁蚶置于盛有海水(DO约为2.0 mg/L)的养殖桶中，10 min后向桶内投入球等鞭金藻(Isochrysis galbana)(终浓度为65×10⁴ cells/L)，最终海水体积为1 L，摄食时间为2 h。摄食结束后，利用血球计数板测定实验前后水体中球等鞭金藻的密度，同时，取魁蚶软体部于60℃烘干48 h至恒重，称重。每组设置3个平行，不加魁蚶的为空白组。参照薛素燕等(2020)的方法：

式中，V为实验海水体积，C₀和C_t分别为实验开始和结束时的饵料浓度，N为实验魁蚶数量，t为实验时间(h)，W为软组织干重(g)。

实验前停食24 h，从C组、H₂组和H₄组中随机取3只魁蚶放入盛有3 L海水的呼吸瓶中，放入魁蚶10 min后为实验起始时间，实验持续2 h。分别采用碘量法和次溴酸钠氧化法测定实验前后海水中的DO和氨氮(NH₄⁺-N)，计算OR和NR。每组设3个平行，不加魁蚶的为空白组。实验结束后，同1.3方法获取魁蚶软体部干重。OR、NR以及氧氮比(O/N)计算参照薛素燕等(2020)的方法。

式中，D₀和D_t为实验空白对照组和实验组水中DO的含量(mg/L)，V为呼吸瓶容积(L)，W为软组织干重(g)，t为实验持续时间(h)。

式中，N₀和N_t为实验空白对照组和实验组水中NH₄⁺-N的浓度(mg/L)，V为呼吸瓶容积(L)，W为软组织干重(g)，t为实验持续时间(h)。

式中，O/N为魁蚶OR和NR之间的比值；16为氧原子的摩尔质量(g/mol)；14为氮原子的摩尔质量(g/mol)。

分别于低氧胁迫0、8、16、24和48 h后各取C组、H₂组和H₄组的3个个体的鳃组织，液氮冻存后放入－80℃冰箱保存，用于后续酶活力的测定。按1∶9质量体积比混合鳃组织和0.9% NaCl溶液，于冰浴下匀浆，离心后取上清液，用于酶活力测定。酶活力单位以U/mg prot表示，代表每毫克蛋白含有的酶活力单位数。测定方法参照试剂盒使用说明书，蛋白质浓度测定试剂盒、微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒均购于南京建成生物公司；细胞色素C氧化酶(COX)试剂盒购于上海纪宁生物公司。

使用SPSS统计软件进行数据分析，结果使用平均值±标准差(Mean±SD)表示，使用GraphPad Prism软件作图，采用单因素方差分析(one-way, ANOVA)比较不同数据之间的差异性，P＜0.05为差异显著。

C组、H₂组、H₄组魁蚶受低氧胁迫不同时间的IR见图 1。从图 1可以看出，3组魁蚶受到低氧胁迫后，其IR的变化趋势基本一致，总体上呈先下降后恢复的变化过程。C组、H₂组、H₄组魁蚶的IR均在受低氧胁迫8 h最低，分别为0 h的39.51%、36.31%和45.96%；16和24 h时，3组魁蚶IR都逐渐提高；至48 h时，C组和H₂组与24 h相比有所回落，但未达到显著水平(P＞0.05)，而H₄组则继续升高；但在实验取样时间点内，3组魁蚶的IR都没有恢复到低氧胁迫处理前的水平。在多数的取样点，H₂组和H₄组的IR比C组更高，且其恢复程度也普遍高于C组，说明低氧预适应提高了魁蚶的IR。

图 1(Fig. 1)

图 1 低氧预适应对魁蚶IR的影响 Fig.1 Effects of hypoxic preconditioning on the IR of S. broughtonii 不同大写字母表示同一时间不同实验组间的差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一实验组不同时间的差异显著(P＜0.05)。下同。 Different uppercase letters represent significant differences between different groups at the same time (P < 0.05), and different lowercase letters represent significant differences of the same group at different time (P < 0.05). The same as below.

在低氧胁迫阶段，C组、H₂组、H₄组OR变化趋势见图 2a。从图 2a可以看出，C组和H₂组的魁蚶受低氧胁迫后，其OR均表现出逐渐升高的趋势，而H₄组受低氧胁迫8 h时呈先下降而后逐渐升高的趋势；3组魁蚶在低氧胁迫48 h时达到最大值，分别为(2.04±0.22)、(1.75±0.18)和(1.48±0.09) mg/(g∙h)。低氧胁迫0~16 h时，3组的OR相对平稳，未达到显著水平(P＞0.05)。48 h时，H₂组、H₄组的OR与C组相比升高趋势较小，与低氧胁迫0 h时相比分别提高了1.15、1.08、0.73倍。在低氧胁迫后的各时间点，3组魁蚶的OR呈相同的趋势，即C组＞H₂组＞H₄组。在8和48 h时，C组和H₂组OR相比差异显著(P＜0.05)，H₂组和H₄组OR相比无显著差异(P＞0.05)；16和24 h时，C组和H₂组OR相比差异不显著(P＞0.05)，而H₂组显著高于H₄组。结果表明，低氧预适应降低了魁蚶在受低氧胁迫时的OR。

图 1(Fig. 1)

图 2 低氧预适应对魁蚶OR、NR和O/N值的影响 Fig.2 Effects of hypoxic preconditioning on the OR, NR and O/N of S. broughtonii

3组魁蚶受低氧胁迫后，NR的变化特征见图 2b。从图 2b可以看出，C组受低氧胁迫后，其NR的变化规律呈逐步升高的趋势，至48 h时，其NR是0 h的1.67倍，而H₂组表现出先下降再升高的趋势，H₄组则呈先下降再升高再降低的趋势；至48 h时，H₂组和H₄组的NR分别为0 h的1.30倍和0.97倍；在各取样时间点，H₂组和H₄组魁蚶的NR均低于C组，其中，除24 h时，H₂组与C组差异未达到显著水平外，其余时间其差异均达到显著水平(P＜0.05)；与H₂组相比，H₄组在16和48 h均显著低于H₂组(P＜0.05)，8和24 h时也低于H₂组，但两组相比差异不显著(P＞0.05)。这说明经过低氧预适应后的魁蚶，再次受到低氧胁迫时其NR有所降低。

O/N值是体现生物对环境适应程度以及确定适宜条件的重要指标之一，与环境对机体的压力密切相关。低氧胁迫48 h内，C组、H₂组、H₄组的O/N值范围在27.61~51.28之间(图 2c)。C组的O/N值在低氧胁迫期间变化平稳，最小值为16 h的37.34，最大值为24 h的46.02，只有这2个时间点具有显著差异(P＜0.05)，其他时间点均无显著差异(P＞0.05)；与C组相比，H组的变化范围相对较大，基本表现出随胁迫时间延长而升高的趋势，H₂组和H₄组的O/N最小值分别在0和8 h，为28.17和27.61，最大值均在48 h，分别为51.28和51.30。

C组、H₂组、H₄组的COX、LDH酶活力和GSH含量变化趋势见图 3。从图 3可以看出，在低氧条件下，3组魁蚶的酶活力均随着胁迫时间的延长发生了变化，其中，COX活力呈逐渐降低的趋势，GSH含量逐渐升高；而LDH活力在胁迫初期极低，8 h时酶活力突增。

图 1(Fig. 1)

图 3 低氧预适应对低氧胁迫下魁蚶酶活力的影响 Fig.3 Effects of hypoxic preconditioning on activity of S. broughtonii under hypoxia stress

从图 3a可以看出，3组魁蚶的COX活力呈逐渐降低的趋势，最大值均出现在胁迫初期的0 h，至受低氧胁迫48 h时最低，分别为0 h的18.96%、26.52%和41.58%。在各取样点内，C组的COX活力均＜H组，且在16 h后，C组与H₄组COX活力相比差异显著(P＜0.05)。H₂组除0 h外，在其余取样点的COX活力均＜H₄组，且在16 h后，H₂组COX活力显著＜H₄组(P＜0.05)。48 h内，3组魁蚶的COX活力的变化趋势为C组＞H₂组＞H₄组。

LDH活力变化见图 3b。从图 3b可以看出，0 h时，3组魁蚶的LDH活力显著低于其他时间点(P＜0.05)，低氧胁迫8 h，3组LDH活力突然升高。C组LDH活力除24 h时略有下降，整体呈逐渐升高的趋势，且48 h时达到最大值，此时LDH活力为0 h的12.17倍。H组的最大值出现在16 h，其中，H₂组LDH活力在16 h后趋于稳定，变化范围极小；H₄组LDH活力在16 h后逐渐下降并低于H₂组，且在48 h时与H₂组相比差异显著(P＜0.05)。到48 h时，H₂组与H₄组的LDH活力分别为0 h的8.25倍和6.34倍。

3组魁蚶低氧胁迫后，GSH含量的变化趋势见图 3c。从图 3c可以看出，总体表现出逐渐升高的变化过程。H组的GSH含量在各取样点内均高于C组；H₄组的GSH含量在16 h和48 h时高于H₂组。低氧胁迫进行到48 h时，为各组的最大值。此时，C组、H₂组和H₄组的GSH含量分别为0 h的1.76、1.92和2.15倍。48 h内，3组魁蚶的GSH含量变化趋势为H₄组＞H₂组＞C组。

低氧是一种严重的环境胁迫(夏丹阳等, 2020)，水生生物的生存和生长发育均与水体中的DO息息相关。水体中DO含量只有空气的3%，相比之下，水生生物对O₂的利用率比陆地生物更重要(Rytkonen et al, 2007)。动物可以通过进行一系列训练来对自身机体进行调节，继而适应环境带来的胁迫。刘云(2009)通过对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)幼鱼进行14 d力竭性追赶训练，发现该训练能显著提高黄颡鱼幼鱼的游泳能力。适当强度的运动训练对紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)鱼体内的抗氧化能力和免疫水平有提高作用，其酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LZY)等在训练后与未训练组相比均差异显著(范雯等, 2020)。而关于低氧预适应相关的研究在水产动物的研究中较少见。本研究首次对魁蚶进行低氧预适应训练，训练过程中的DO浓度为(2.5±0.3) mg/L，预低氧次数分别为0、2和4次，结果表明，进行预低氧4次的魁蚶其耐低氧能力更强。

在胁迫初期，3组魁蚶的IR均显著下降，这可能是魁蚶对外界环境的骤变而做出的应激反应。随着低氧胁迫时间的延长，魁蚶对胁迫环境逐渐产生了一定的适应性，3组魁蚶的IR均有所回升；胁迫后期，随着对低氧的进一步适应，魁蚶壳口张开并主动摄食以获取食物来维持机体行使功能。另外，动物可以通过相关训练来调节自身摄食能力，马壮等(2019)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼进行游泳训练，发现适当训练可以一定程度上提高鱼体的摄食能力。本研究中，经过低氧预适应的魁蚶在低氧胁迫后期，其IR明显高于未进行预适应的魁蚶，且恢复能力更高，这说明低氧预适应对魁蚶在低氧胁迫下的摄食能力具有积极促进作用，增强了魁蚶对低氧胁迫的适应性，且预适应4次的魁蚶IR更高，适应性更强。

代谢活动反映的是贝类在一定生理水平下的特定状态，在胁迫条件下，因应激反应需要消耗更多的能量来维持内环境的稳态，从而影响贝类的摄食、代谢及免疫等功能(魏伟, 2016)。美洲牡蛎(Crassostrea virginica)长期固着于潮间带的礁石上，涨潮期与低潮期的交替造成美洲牡蛎间断性地暴露于空气中形成O₂差，类似于多次“训练”，这可能驯化出了牡蛎更强的低氧耐受能力(Greenway et al, 2000)。本研究中，3组魁蚶在低氧胁迫下，OR和NR都有显著变化。随着低氧胁迫时间的延长，各组魁蚶的OR逐渐升高，对O₂需求增大，其中，对照组OR升高趋势尤为明显。预适应组与对照组的NR也表现出显著差异(P＜0.05)，其变化趋势与OR一致。预适应组经过低氧训练后，呼吸代谢变化较为平稳，且低氧预适应4次比低氧预适应2次更为稳定，表现出对低氧胁迫更强的适应性。

O/N值是研究水产动物生长代谢的一个重要参数，其大小表示该生物体内蛋白质、脂肪和碳水化合物分解代谢的比率(周建聪等, 2021)。O/N值＜7时，生物体内的能量完全由蛋白质提供；O/N值约为7~24时，生物体所需要的能量由蛋白质和脂肪提供；当供能物质主要为碳水化合物或脂肪时，O/N值将会无穷大(Conover et al, 1968; Mayzalld et al, 1976; Ikeda, 1974)。本研究中，3组魁蚶在低氧胁迫下，O/N平均值为39.5，H₄组在8 h的O/N值最小，为27.61，此时的O/N值大于由蛋白质和脂肪提供生物体所需要能量的O/N值，说明本研究中的魁蚶耗能主要由碳水化合物和脂肪提供，48 h的低氧胁迫在魁蚶的承受范围之内，表明魁蚶的耐低氧能力较强。

当水生生物受到低氧胁迫后，机体会产生过量的活性氧(ROS)，并产生超氧自由基(O₂^–)，同时，机体也会启动抗氧化防御体系来清除O₂^–以减少氧化损伤，酶活力是体现机体生理状态的重要指标。其中，COX活性是评价不同组织有氧呼吸产生能量的重要指标(Hu et al, 2018)；LDH活力是生物体内参加无氧代谢的关键酶(杨明等, 2019)；GSH含量在维持细胞生理功能方面起到重要作用。本研究中，低氧胁迫使魁蚶的生理生化指标发生改变，整体趋势表现为COX活力逐渐降低，LDH活力逐渐升高，GSH含量逐渐升高，表明魁蚶的有氧呼吸能力逐渐降低，无氧呼吸能力逐渐升高。从COX与LDH活力实验可以看出，相对低氧预适应组，对照组的酶活力变化趋势明显，存在更强烈的应激反应；经过低氧预适应，机体酶活力变化趋势相对较小，同时，与呼吸代谢趋势一致，低氧预适应4次比预适应2次变化小，表明低氧预适应降低了机体内一些酶的应激反应。GSH含量作为维持细胞生理功能的重要酶，随着低氧胁迫时间延长，实验组GSH含量显著高于对照组(P＜0.05)，体现出更强的维持机体稳定的能力。王定康等(2021)研究表明，经过高盐预适应的鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)在高盐胁迫下的存活率、pH、酶活力及多种游离氨基酸含量显著提高，与本研究结果相似，表明生物机体抗性在预适应后可以得到提高。

本研究分析了低氧预适应对魁蚶的IR、呼吸代谢和酶活力等生理生化指标的影响，发现预适应可有效提高魁蚶在低氧胁迫时机体的反应能力，研究结果丰富了低氧适应相关的研究资料，为探讨魁蚶逆境适应机制提供了数据。