饲料中添加酶解海带粉对刺参幼参生长、体组成、消化代谢和抗氧化能力的影响

引用本文

王美琪, 宋志东, 郭鹏, 李宝山, 王际英, 黄炳山, 孙永智, 李培玉. 饲料中添加酶解海带粉对刺参幼参生长、体组成、消化代谢和抗氧化能力的影响[J]. 渔业科学进展, 2023, 44(3): 176-187. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20211202002.

WANG Meiqi, SONG Zhidong, GUO Peng, LI Baoshan, WANG Jiying, HUANG Bingshan, SUN Yongzhi, LI Peiyu. Effects of Dietary Supplementation with Enzymatically Hydrolyzed Kelp Powder on Growth, Digestion, Metabolism, and Oxidation Resistance of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus)[J]. Progress in Fishery Sciences, 2023, 44(3): 176-187. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20211202002.

基金项目

山东省重点研发计划(重大科技创新工程)(2020CXGC011404)、烟台市科技计划(2021XDHZ055)和山东省现代农业产业技术体系-刺参创新团队(SDAIT-22-06)共同资助

作者简介

王美琪，E-mail: 18804661819@163.com

通讯作者

李培玉，副研究员，E-mail: lipeiyu-539@163.com

文章历史

收稿日期：2021-12-02
收修改稿日期：2022-01-22

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饲料中添加酶解海带粉对刺参幼参生长、体组成、消化代谢和抗氧化能力的影响

王美琪 ^1,2, 宋志东 ², 郭鹏 ^1,2, 李宝山 ², 王际英 ², 黄炳山 ², 孙永智 ², 李培玉 ²

1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海 201306;
2. 山东省海洋资源与环境研究院山东省海洋生态修复重点实验室山东烟台 264006

收稿日期：2021-12-02；收修改稿日期：2022-01-22

基金项目：山东省重点研发计划(重大科技创新工程)(2020CXGC011404)、烟台市科技计划(2021XDHZ055)和山东省现代农业产业技术体系-刺参创新团队(SDAIT-22-06)共同资助

作者简介：王美琪，E-mail: 18804661819@163.com.

通讯作者：李培玉，副研究员，E-mail: lipeiyu-539@163.com.

摘要：以海带粉饲料为对照(D1)，在刺参(Apostichopus japonicus)饲料中等梯度添加3% (D2)、6% (D3)、9% (D4)、12% (D5)和15% (D6)的酶解海带粉(EKP)，共配制6种等氮等能的实验饲料。实验幼参初重为(11.40±0.04) g，随机分为6组(每组3个重复)，每个重复30头幼参，每天投喂1次，养殖周期为56 d。结果显示，随着EKP添加量从0上升到15%，幼参增重率(WGR)和特定生长率(SGR)先升高后略有降低，添加6%以上EKP显著提高幼参WGR和SGR；添加12%和15% EKP显著降低了粗蛋白表观消化率，添加6%~9% EKP显著提高了总磷和总能表观消化率；添加3%~9% EKP显著提高了幼参肠道淀粉酶和蛋白酶活性，脂肪酶活性不受影响；随EKP添加水平的升高，肠道葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活性均呈先上升后下降的趋势，其中，GK和PK的活性在9%添加水平达到最大；PEPCK、ALT和AST的活性在12%添加水平达到最大。添加15% EKP显著提高了幼参肠道Na⁺-K⁺-ATPase活性，而添加6%~15% EKP显著提高了幼参肠道Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活性；添加6%~15% EKP增强了幼参肠道总抗氧化能力，SOD活性在9%~12%的添加水平下显著提高，但在15%水平下显著降低。12%~15%添加水平显著升高了丙二醛含量。综上所述，饲料中添加适量EKP可提高刺参幼参的生长性能、消化和代谢活力以及抗氧化能力。经一元二次回归分析得出，EKP在刺参幼参饲料中的最适添加量为10.36%。

关键词：刺参酶解海带粉生长消化代谢抗氧化性能

Effects of Dietary Supplementation with Enzymatically Hydrolyzed Kelp Powder on Growth, Digestion, Metabolism, and Oxidation Resistance of Juvenile Sea Cucumber (Apostichopus japonicus)

WANG Meiqi ^1,2, SONG Zhidong ², GUO Peng ^1,2, LI Baoshan ², WANG Jiying ², HUANG Bingshan ², SUN Yongzhi ², LI Peiyu ²

1. Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrion of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Key Laboratory of Marine Ecological Restoration, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China

Corresponding author: LI Peiyu, E-mail: lipeiyu-539@126.com.

Abstract: As a raw material for aquatic feed, kelp has a large output and is rich in sugars, minerals, vitamins, free amino acids, fatty acids, etc. It is not only a natural bait for sea cucumbers in natural seas but also often used as a main ingredient in compound feed for sea cucumbers. However, kelp contains non-starch polysaccharides (NSP) which are difficult to be digested by endogenous enzymes secreted by aquatic animals.Enzymatically hydrolyzed kelp (EKP) powder is made by hydrolyzing kelp powder with a compound enzyme preparation (NSP enzyme∶cellulase∶neutral protease∶flavor enzyme = 8∶12∶3∶1), and the compound enzyme is added at 3% (by weight). The ratio of material to liquid is 1∶6, and the conditions of enzymatic hydrolysis comprise a temperature of 50 ℃, pH 6, and reaction time 6 h.A feeding trial was conducted to investigate the effects of EKP on the growth, digestion, metabolism, and oxidation resistance of juvenile sea cucumbers Apostichopus japonicus (Selenka, 1867). In this experiment, fish meal, kelp meal and EKP were used as the main protein sources to prepare a basic feed with a crude protein content of 12.00%, a crude fat content of 0.40%, and an energy content of 6.20 KJ/g. A total of 540 healthy sea cucumbers with an initial average weight of (11.4±0.04) g were selected and randomly assigned to 18 cylindrical circulating buckets. They were divided into 6 experimental groups with 3 replicates in each group and 30 sea cucumbers in each replicate. Six experimental diets were formulated with the graded levels of EKP, 0% (D1, control group), 3% (D2), 6% (D3), 9% (D4), 12% (D5), and 15% (D6) dry diets. The feeding period was 56 days. Bait was fed once a day at a fixed time (16:00). The water was changed every 3 days, and a siphon was used to withdraw the residual bait and feces from the bottom of the bucket. The amount of water changed was 1/2 of the water level in the bucket. The breeding experiment was run for 1 month. During the breeding period, the water temperature was 13~17 ℃, pH was 7.5~8.2, dissolved oxygen was at least 6 mg/L, and salinity was maintained at 28~30.The results showed that: (1) The weight gain rate and specific growth rate of sea cucumbers in the D3, D4, D5 and D6 groups were significantly increased as compared to that in the control group, with the D4 group reporting the highest values. (2) The contents of water, crude protein, crude lipid, and ash in the body wall of sea cucumbers were not different among groups, but addition of EKP significantly increased the contents of methionine and cysteine. (3) The activities of intestinal amylase and protease increased first and then decreased with the EKP addition level increasing, but the lipase activity was not significantly affected. (4) Dietary incorporation of EKP significantly increased the apparent digestibility of crude protein, gross energy, total phosphorus and six amino acids. (5) The activities of intestinal glucokinase, pyruvate kinase, and phosphoenolpyruvate carboxykinase as well as the total antioxidant capacity increased first and then decreased; the activities of Na⁺-K⁺-ATPase or Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase showed an increasing trend with increasing EKP addition levels. The malondialdehyde content followed a trend opposite to the total antioxidant capacity. In conclusion, appropriate addition of EKP has positive effects on growth, digestion, metabolism, and oxidation resistance of A. japonicas, and it promote the growth of sea cucumbers. The predicted optimal supplemental level of EKP in the diet of A. japonicus was 10.36% (12% feed crude protein) according to the quadratic regression analysis on weight gain rate against the EKP addition levels. This research provides a theoretical basis for the use of EKP at compound feed for A. japonicus.

Key words: Apostichopus japonicus Enzymatically hydrolyzed kelp powder Growth Digestion and metabolism Oxidation resistance

海藻具有非常重要的经济、营养、药用和生态价值。全球可供人类使用的海藻共有291种(Balbas et al, 2015)，主要用于生产食品和水凝胶，提取药物、糖、有机材料，生产肥料和动物饲料等。海带是一种常见的海产品，属海藻中的褐藻，具有成本低、产量高、营养丰富等优点。海带由于产量大并富含糖类、矿物质、维生素、游离氨基酸、脂肪酸等(孙永泰, 2015)，不仅在自然海域中作为刺参的天然饵料，也常被用来作为刺参配合饲料中的主要原料。但海带中含有纤维素、半纤维素、β-葡聚糖、果胶等非淀粉多糖(non-starch polysaccharides, NSP)，难以被动物分泌的内源酶降解，并且其中可溶性非淀粉多糖(soluble non-starch polysaccharides, SNSP)具有较强的抗营养作用，溶于水后产生较强的粘性，导致食糜黏度增加、营养屏障作用和微生物菌群数量增加等不利影响，以至于降低养殖动物对饲料养分的消化利用率(Bedford et al, 1992)。因此，将海带的多糖成分进行降解处理是提高其利用率，减少不利影响的有效途径。目前，对海带多糖的降解方法研究较多，如物理降解法、化学降解法和生物降解法。与物理降解法和化学降解法相比，生物降解法具有反应条件温和，专一性强等优势(董学前等, 2017; 姚骏等, 2018)。生物降解法即酶解，是用专一性糖苷酶或非专一性酶通过特异性裂解多糖中的某一糖苷键对多糖进行酶解(郭娜等, 2019)，将其分解为更容易吸收的小分子营养物质，降低食糜黏度，提高饲料利用率，进而提高养殖动物的生长性能(曹新勇, 2013; 王亚妮, 2013; 关莹等, 2021)。

刺参(Apostichopus japonicus Selenka)又称仿刺参，被列为“海八珍”之一，具有较高的食用及药用价值，是我国黄渤海海域重要的海水养殖品种(张德瑞等, 2016)。刺参养殖业的大规模发展，为刺参饲料加工业创造了巨大的发展空间，同时也加大了对海藻的需求量。海带作为刺参饲料的主要原料，不仅提供丰富的碳水化合物，而且也是蛋白的主要来源，但海带中含有的非淀粉多糖等成分，在一定程度上限制了其应用效果。本研究在前期预实验和参考前人研究的基础上(王昌义等, 2012; 付燕红等, 2019)，采用NSP酶、纤维素酶、中性蛋白酶和风味酶对海带粉进行复合酶解，将海带降解为不同聚合程度的寡糖及肽类，并通过在刺参幼参饲料中添加酶解海带粉(enzymatically hydrolyzed kelp power, EKP)研究其对幼参的生长、体组成、消化和代谢酶活力以及抗氧化能力的影响，为EKP在刺参幼参配合饲料的应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 酶解海带粉制备

实验用酶制剂购于武汉新华扬生物科技有限公司，包括NSP酶(木聚糖酶，8 000 U/g；β-葡聚糖酶, 2 000 U/g；β-甘露聚糖酶，150 U/g)、纤维素酶(500 U/g)、中性蛋白酶(100 000 U/g)、风味酶(5 000 U/g)。酶解海带粉是由海带粉经复合酶制剂(NSP酶∶纤维素酶∶中性蛋白酶∶风味酶=8∶12∶3∶1)水解制成，复合酶添加量3% (占料重)，料液比为1∶6，酶解条件：温度50 ℃、pH 6、反应时间6 h。所用海带粉及其酶解产物营养组成见表 1。

表 1 海带粉和酶解海带粉营养组成及还原糖含量(干物质基础) Tab.1 Nutritional composition and reducing sugar content of kelp powder and enzymatic kelp powder (dry matter basis)

1.2 实验饲料

本研究以鱼粉、海带粉和EKP为主要蛋白源，配制粗蛋白含量为12.00%、粗脂肪含量为0.40%、能量为6.20 KJ/g的基础饲料，其配方及营养组成见表 2和表 3。在基础饲料中分别添加0、3%、6%、9%、12%和15% EKP，命名为D1(对照组)、D2、D3、D4、D5和D6组，各组均添加同等含量的0.6%牛磺酸以解决海带粉中牛磺酸不足的问题(Zhao et al, 2017)，配成6组等氮等能的实验饲料。D1~D6添加组中牛磺酸的实际含量分别为0.71%、0.72%、0.69%、0.70%、0.68%和0.69%，各组实验饲料添加0.1%氧化钇(Y₂O₃)作为外源指示剂。饲料原料经粉碎后过60目筛，混合，制成粒径为6 mm的颗粒。以上各组实验饲料经70 ℃烘干后于–20 ℃冰柜中保存备用。

表 2 饲料配方及营养组成(%风干物质基础) Tab.2 Proximate composition and ingredients of the experimental diets (% air-dry weight basis)

原料 Ingredients	组别 Group
原料 Ingredients	D1	D2	D3	D4	D5	D6
白鱼粉 White fishmeal	5.50	5.50	5.50	5.50	5.50	5.50
海带粉 Kelp power	25.00	22.00	19.00	16.00	13.00	10.00
酶解海带粉 Enzymatically hydrolyzed kelp power	0.00	3.00	6.00	9.00	12.00	15.00
牛磺酸 Taurine	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
虾粉 Shrimp meal	3.50	3.50	3.50	3.50	3.50	3.50
豆粕 Soybean meal	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
酵母粉 Yeast powder	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
贝壳粉 Shell powder	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
卡拉胶 Carrageenan	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
α-淀粉 α-starch	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
维生素预混料 Vitamin premix^a	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
矿物质预混料 Mineral premix^b	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
氧化钇 Y₂O₃	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
海泥 Sea mud	49.20	49.20	49.20	49.20	49.20	49.20
合计 Total	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
营养成分 Nutrient composition
粗蛋白 Crude protein	12.26	12.20	12.14	11.99	12.07	11.77
粗脂肪 Crude lipid	0.30	0.31	0.33	0.35	0.36	0.38
粗灰分 Crude ash	59.98	60.46	61.67	62.02	63.19	63.91
能量 Energy/(KJ/g)	6.25	6.20	6.20	6.18	6.17	6.14
注：a：维生素预混料(mg/kg or IU/kg饲料)：维生素A 7 500.00 IU；维生素D 1 500.00 IU；维生素E 60.00 mg；维生素K₃ 18.00 mg；维生素B₁ 12.00 mg；维生素B₂ 12.00 mg；维生素B₁₂ 0.10 mg；泛酸48.00 mg；烟酰胺90.00 mg；叶酸3.70 mg；D-生物素0.20 mg；吡哆醇60.00 mg；维生素C 310.00 mg；b：矿物质预混料(mg/kg饲料)：锌35.00 mg；锰21.00 mg；铜8.30 mg；铁23.00 mg；钴1.20 mg；碘1.00 mg；硒0.30 mg。 Note: a: Vitamin premix (mg/kg or IU/kg diet): Vitamin A 7 500.00 IU, Vitamin D 1 500.00 IU, Vitamin E 60.00 mg, Vitamin K₃ 18.00 mg, Vitamin B₁ 12.00 mg; Vitamin B₂ 12.00 mg, Vitamin B₁₂ 0.10 mg, Pantothenate acid 48.00 mg, Niacin 90.00 mg, Folic acid 3.70 mg, D-biotin 0.20 mg, Pyridoxine 60.00 mg, Vitamin C 310.00 mg; b: Mineral premix (mg/kg diet): Zn 35.00 mg, Mn 21.00 mg, Cu 8.30 mg, Fe 23.00 mg, Co 1.20 mg, I 1.00 mg, Se 0.30 mg.

表 2 饲料配方及营养组成(%风干物质基础) Tab.2 Proximate composition and ingredients of the experimental diets (% air-dry weight basis)

表 3 实验饲料氨基酸组成(%干物质) Tab.3 Amino acids composition of experimental diets (% dry matter)

1.3 实验刺参和饲养管理

实验用刺参购买于山东安源种业科技有限公司(蓬莱)。饲喂实验在山东省海洋资源与环境研究院东营实验基地循环水养殖系统中进行。所有刺参均饲喂基础饲料1周，以适应实验饲料和饲养条件。实验开始前禁食24 h。选择初始平均体重为(11.4±0.04) g的健康刺参540头，随机分配到18个圆柱形循环水桶(Φ 65 cm×60 cm)，分为6个实验组，每组3个重复，每个重复30头刺参，饲喂期56 d。每天固定时间(16:00)投饵1次，饱食投喂。每3 d换一次水，并采用虹吸法将残饵和粪便用虹吸软管从桶底吸出，换水量为桶内水位的1/2。养殖实验进行1个月时，彻底清洗水桶。养殖期间水温为13~17 ℃，pH为7.5~8.2，溶解氧不低于6 mg/L，盐度维持在28~30。

1.4 样品采集

养殖实验期间，每天投喂前将包膜完整的长条状粪便收集起来，–20 ℃保存，用于后续营养物质表观消化率测定。养殖实验结束时，禁食24 h后，分别对每个养殖桶中的刺参称重并计数。称重后，从每个桶中随机取14头刺参，进行解剖，称量体壁重、内脏重和肠重，将刺参的体壁和肠道，保存在–80 ℃，其中体壁用于后续体成分测定，肠道用于后续酶活测定。

1.5 指标测定 1.5.1 生长性能测定

成活率(survival rate, SR, %)=100×N_t/N₀

增重率(weight gain rate, WGR, %)=100×(W_t−W₀)/W₀

特定生长率(specific growth rate, SGR, %/d)= 100×(lnW_t−lnW₀)/t

脏壁比(viscera-body wall ratio, VBR, %)=100× Wv/Ww

肠壁比(intestine-body wall ratio, IBR, %)=100× Wi/Ww

式中，N_t为刺参终末头数，N₀为刺参初始头数，W_t为刺参终末体质量(final body weight, FBW)(g)，W₀为刺参初始体质量(initial body weight, IBW)(g)，t为养殖实验天数(d)，Wv为取样刺参内脏质量(g)，Wi为取样刺参肠道质量(g)，Ww为取样刺参体壁质量(g)。

饲料干物质、营养成分的表观消化率计算公式如下：

饲料干物质表观消化率(%)＝100×(1–饲料中Y₂O₃含量/粪便中Y₂O₃含量)

饲料营养成分表观消化率(%)＝100×[1–(饲料中Y₂O₃含量/粪便中Y₂O₃含量)×(粪便中营养成分含量/饲料中营养成分含量)]

1.5.2 饲料、粪便和体壁营养成分测定

实验饲料、粪便及刺参体壁水分含量采用105 ℃恒重法测定(GB/T 6435-2014)，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(GB/T 6432-2018)，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定(GB/T 6433-2006)，粗灰分含量采用50 ℃马弗炉灼烧法测定(GB/T6438-2007)，氨基酸含量采用酸水解法(GB/T18246-2019)使用全自动氨基酸测定仪(日立L-8900, 日本)测定。饲料和粪便中总磷含量采用分光光度法(GB/T 6437-2018)测定，钇含量采用高频电感耦合等离子体发射光谱法测定，能量采用燃烧法使用量热仪(IKA, C6000, 德国)测定。海带粉和EKP中还原糖的测定(王莉丽等, 2020; 程柳等, 2016)，通过3,5-二硝基水杨酸比色(DNS)法，以葡萄糖为标准品，DNS的用量为3 mL，取样品溶液2 mL于25 mL具塞刻度试管中，沸水浴加热6 min，冷却后，于540 nm波长条件下测定还原糖含量。

1.5.3 肠道消化和代谢酶测定

肠道中淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)、蛋白酶(protease)、ATP酶(adenosine triphosphate)、Na⁺-K⁺-ATP酶(Na⁺-K⁺-ATPase)、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶(Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase)、葡萄糖激酶(glucokinase, GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate, PEPCK)、谷草转氨酶(asparate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，各种酶活性单位参照试剂盒说明书表示。

1.5.4 肠道抗氧化指标测定

肠道中过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，各种酶活性单位参照试剂盒说明书表示。

1.6 数据统计分析

实验数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。当达到差异显著(P < 0.05)，应用Duncan′s检验进行多重比较分析。统计结果以平均值±标准差(Mean±SD, n=3)的形式表示。

2 结果 2.1 刺参幼参生长性能

如表 4所示，随着饲料中EKP含量的增加，FBW、WGR和SGR均呈现先升高后略有降低的趋势，D3、D4、D5和D6组显著高于对照组(P < 0.05)；各组间IBR、VBR和SR均无显著性差异(P > 0.05)。以WGR为评价指标，经一元二次回归分析(y=–0.198x²+ 4.102 9x+60.586)得出，EKP在初始质量为(11.40±0.04) g刺参幼参饲料中的最适添加量为10.36% (图 1)。

表 4 刺参生长性能 Tab.4 Growth performance of sea cucumber A. japonicus

图 1 刺参增重率与饲料中酶解海带粉添加量的回归分析 Fig.1 Regression analysis between dietary enzymatically hydrolyzed kelp power level and weight gain rate of A. japonicus

2.2 刺参对饲料干物质及营养成分的表观消化率

如表 5所示，刺参幼参对添加不同水平EKP饲料的干物质的表观消化率无显著差异(P > 0.05)；D5和D6组粗蛋白表观消化率显著低于对照组(P < 0.05)；总磷的表观消化率呈先上升后下降的趋势，在D3组达到最大值(P < 0.05)；所有的EKP添加组均提高了总能表观消化率(P < 0.05)；随着EKP含量的升高，饲料中异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸和酪氨酸的表观消化率呈先升高后下降的趋势，D6组中异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和酪氨酸的表观消化率显著低于对照组(P < 0.05)。

表 5 营养素的表观消化率 Tab.5 Apparent digestibility of nutrients

项目 Items	组别 Group
项目 Items	D1 (0 EKP)	D2 (3% EKP)	D3 (6% EKP)	D4 (9% EKP)	D5 (12% EKP)	D6 (15% EKP)
干物质 Dry matter/%	10.21±0.83	10.62±1.01	11.18±0.76	11.31±0.54	9.24±0.79	10.24±0.18
粗蛋白 Crude protein/%	53.43±0.24^b	55.39±1.71^b	53.34±2.03^b	52.45±1.42^b	48.10±1.33^a	48.31±1.62^a
总磷 Total phosphorus/%	21.78±1.06^a	25.87±0.87^b	29.75±2.03^c	26.59±2.99^bc	23.03±0.75^ab	21.91±2.68^a
总能 Gross energy/%	42.07±2.11^a	46.51±2.65^ab	51.55±2.62^cd	52.98±2.58^d	48.04±0.75^bc	52.22±2.71^cd
必需氨基酸 Essential amino acids
苏氨酸 Thr	49.92±3.19	53.59±3.92	51.16±3.74	48.94±3.86	44.88±2.56	43.18±1.68
缬氨酸 Val	57.74±2.07	58.32±2.87	58.41±3.16	56.22±2.45	54.30±1.44	51.04±1.70
蛋氨酸 Met	61.93±2.13^b	63.24±3.12^b	63.39±3.43^b	63.32±2.47^b	58.97±1.97^ab	57.03±1.93^a
异亮氨酸 Ile	61.44±2.76^bc	65.01±3.41^c	61.86±4.88^bc	55.76±3.68^ab	55.30±1.59^a	52.05±2.38^a
亮氨酸 Leu	61.85±3.74^c	64.21±2.45^c	61.77±4.30^c	60.47±2.20^bc	55.77±1.71^ab	54.70±1.85^a
苯丙氨酸 Phe	61.79±2.93	63.91±2.43	56.19±4.29	62.31±2.04	51.02±1.55	56.28±1.41
赖氨酸 Lys	62.49±3.78	65.94±1.89	61.56±4.21	61.51±2.70	58.06±1.73	57.47±1.42
组氨酸 His	60.16±3.39^bc	66.03±2.05^c	59.10±4.46^b	60.37±3.24^bc	61.80±2.46^bc	52.04±2.28^a
精氨酸 Arg	65.45±2.83^b	68.43±1.98^b	64.27±2.60^b	63.63±2.48^b	57.74±0.88^ab	55.96±2.40^a
非必需氨基酸 Non-essential amino acids
天冬氨酸 Asp	53.19±4.15	57.42±3.22	55.63±3.14	54.77±3.02	49.13±2.63	49.75±1.06
丝氨酸 Ser	52.95±2.50	56.07±3.98	53.32±3.07	52.53±3.29	47.31±2.65	49.13±1.10
谷氨酸 Glu	60.92±3.22	64.28±1.41	60.55±4.21	62.32±3.00	55.81±2.13	57.38±1.74
甘氨酸 Gly	51.28±3.54	54.77±3.68	52.08±2.65	50.42±2.57	46.46±2.30	45.36±1.36
丙氨酸 Ala	52.01±3.39	55.40±3.51	54.45±4.04	52.85±3.92	50.18±3.15	45.07±1.51
半胱氨酸 Cys	40.52±3.53	43.26±3.20	44.57±3.49	45.34±1.48	42.83±2.36	38.13±1.96
酪氨酸 Tyr	56.68±2.69^bc	60.90±2.52^bc	62.21±2.96^c	62.13±2.39^c	57.79±1.59^b	51.98±0.32^a
脯氨酸 Pro	53.75±2.87	55.85±3.29	55.75±2.40	51.68±2.49	50.11±3.51	47.82±2.14
总氨基酸 TAA	52.21±2.28^b	54.72±3.41^b	53.07±3.15^b	52.87±4.12^b	48.17±2.35^a	47.17±3.17^a

表 5 营养素的表观消化率 Tab.5 Apparent digestibility of nutrients

2.3 刺参体壁基本营养成分和氨基酸含量

如表 6所示，饲料中添加EKP并未改变刺参幼参体壁的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量(P > 0.05)。随着饲料中EKP含量的增加，幼参体壁蛋氨酸含量呈先上升后下降的趋势，D2、D3、D4和D5组显著高于对照组(P < 0.05)；半胱氨酸含量呈先上升后平稳趋势，各实验组均显著高于对照组(P < 0.05)。

表 6 刺参体壁营养组成及氨基酸组成(%干物质) Tab.6 Proximate composition and amino acid composition of body wall of sea cucumber A. japonicus (% dry matter)

项目 Items	组别 Group
项目 Items	D1 (0 EKP)	D2 (3% EKP)	D3 (6% EKP)	D4 (9% EKP)	D5 (12% EKP)	D6 (15% EKP)
水分 Moisture	91.31±0.46	91.46±0.42	92.03±0.57	91.61±0.19	91.44±0.25	91.74±0.59
粗蛋白 Crude protein	48.43±1.72	48.75±0.72	48.81±0.51	47.98±1.33	48.03±1.16	47.99±1.21
粗脂肪 Crude lipid	2.75±0.10	1.96±0.19	2.70±0.24	3.17±0.15	3.02±0.45	2.76±0.44
粗灰分 Crude ash	33.06±1.14	33.80±0.86	34.01±1.10	33.63±1.05	33.41±1.67	34.50±1.91
必需氨基酸 Essential amino acids
苏氨酸 Thr	2.63±0.11	2.54±0.17	2.63±0.01	2.50±0.07	2.55±0.08	2.51±0.11
缬氨酸 Val	2.23±0.05	2.09±0.22	2.27±0.02	2.27±0.05	2.06±0.12	2.17±0.08
蛋氨酸 Met	1.27±0.06^a	1.51±0.02^b	1.50±0.04^b	1.42±0.06^b	1.47±0.07^b	1.16±0.16^a
异亮氨酸 Ile	1.32±0.10	1.38±0.05	1.35±0.05	1.29±0.10	1.47±0.11	1.28±0.05
亮氨酸 Leu	2.57±0.13	2.62±0.11	2.59±0.02	2.50±0.09	2.60±0.06	2.48±0.08
苯丙氨酸 Phe	1.72±0.16	1.81±0.17	1.70±0.07	1.73±0.03	1.83±0.04	1.75±0.01
赖氨酸 Lys	2.03±0.01	2.07±0.04	2.05±0.03	2.05±0.01	2.13±0.06	2.04±0.01
组氨酸 His	0.62±0.01	0.65±0.02	0.63±0.01	0.65±0.01	0.66±0.02	0.64±0.02
精氨酸 Arg	3.07±0.01	3.10±0.07	3.02±0.01	3.06±0.14	3.26±0.14	3.15±0.01
非必需氨基酸 Non-essential amino acids
天冬氨酸 Asp	4.82±0.13	4.70±0.24	4.81±0.02	4.54±0.17	4.74±0.10	4.62±0.18
丝氨酸 Ser	2.60±0.15	2.42±0.14	2.53±0.02	2.39±0.07	2.42±0.05	2.44±0.09
谷氨酸 Glu	6.27±0.05	6.23±0.17	6.31±0.06	6.29±0.18	6.51±0.17	6.29±0.10
甘氨酸 Gly	6.13±0.24	5.68±0.33	6.10±0.16	5.32±0.30	5.85±0.40	5.81±0.63
丙氨酸 Ala	3.01±0.05	2.84±0.16	3.01±0.04	2.70±0.13	2.86±0.14	2.86±0.16
半胱氨酸 Cys	1.68±0.05^a	1.80±0.06^b	1.94±0.02^c	1.93±0.03^c	1.92±0.02^c	1.89±0.01^c
酪氨酸 Tyr	2.34±0.02	2.34±0.04	2.28±0.03	2.41±0.11	2.34±0.06	2.61±0.25
脯氨酸 Pro	3.34±0.11	3.18±0.17	3.30±0.10	3.01±0.13	3.24±0.15	3.12±0.24
总氨基酸 TAA	47.92±0.78	46.98±0.66	48.14±0.85	46.15±0.38	47.15±0.74	46.18±0.47

表 6 刺参体壁营养组成及氨基酸组成(%干物质) Tab.6 Proximate composition and amino acid composition of body wall of sea cucumber A. japonicus (% dry matter)

2.4 刺参肠道消化酶和代谢酶活性

如表 7所示，随着饲料中EKP含量的增加，刺参幼参肠道淀粉酶和蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势，且均在D5组达最大值；各组间肠道脂肪酶活性无显著性差异(P > 0.05)。

表 7 刺参肠道的消化与代谢酶活性 Tab.7 Activities of intestinal digestive and metabolic enzymes of sea cucumber A. japonicus

葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性均呈先上升后下降的趋势，GK和PEPCK活性D2、D3和D4组显著高于对照组(P < 0.05)；Na⁺-K⁺-ATPase活性D6组显著高于其他各组(P < 0.05)；Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活性随EKP添加水平的提高，呈上升趋势，D3、D4、D5和D6组显著高于对照组(P < 0.05)。随饲料EKP含量从0升高到15%，谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性呈先升高后下降的趋势，AST和ALT活性均在D5组达到最高值。

2.5 刺参抗氧化性能

如表 8所示，肠道总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性随着EKP含量的增加，均呈先升高后下降的趋势，其活性分别在D4组和D5组最高；肠道丙二醛(MDA)含量则呈现与SOD相反趋势，D5组和D6组MDA含量显著高于其他组(P < 0.05)；各组间过氧化氢酶(CAT)活性无明显差异(P > 0.05)。

表 8 刺参肠道抗氧化性能 Tab.8 Intestinal oxidation resistance of sea cucumber A.japonicus

3 讨论

本研究中，饲料中添加EKP影响幼参的生长性能。随EKP含量的逐渐升高，生长呈先升高后平稳的趋势，是因为海带经NSP酶、纤维素酶、中性蛋白酶和风味酶复合酶制剂酶解后还原糖和酸溶蛋白含量分别提高了96.88%和1.89% (表 1)。饲料中还原糖和可溶性蛋白含量的显著提高，有助于刺参幼参的消化和吸收，并且，其中的糖类和小肽能调节机体代谢，进而提高幼参的生长性能(江晓路等, 2009; Song et al, 2016)。有相关研究已经报道了藻类经酶解处理后能更好的促进海洋动物的生长。如秦搏等(2015)研究发现，用纤维素酶和蛋白酶对浒苔(Enteromorpha prolifera)进行酶解后干燥粉碎处理的饲料可以显著提高刺参的SGR；彭素晓(2017)研究表明，海带酶解产物可显著提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的SGR，并能显著降低饲料系数，提高非特异性免疫力。本研究结合表观消化率对生长进行分析发现，饲料的粗蛋白、磷和总能的表观消化率和增重率特定生长率呈一致的趋势，说明EKP提高了刺参对饲料营养素的整体利用效率，从而促进了刺参快速生长。但本研究也发现，幼参的生长性能并不随着EKP的添加而进一步提高。相反，EKP添加比例超过9%导致幼参生长率出现下降的趋势，说明添加9%的EKP可能已经超过幼参机体对其代谢处理能力范围，反而对幼参生长代谢产生抑制作用。李猛等(2015)研究表明，饲料中添加过高比例的发酵浒苔会降低刺参幼参的增重率和特定生长率，原因是过量的发酵浒苔释放的葡萄糖和氨基酸等小分子物质含量可能超过了刺参幼参正常的吸收值，从而导致其生长下降。本研究结果显示，当EKP添加量达到12%~15%时，粗蛋白的表观消化率与对照组相比显著降低，说明还原糖含量超过机体耐受极限，并影响肠道对营养物质的吸收，也导致了幼参摄入的总能量呈现降低的现象，导致幼参生长速度减慢，这也解释了过量添加EKP降低幼参生长性能的原因。氨基酸的组成和表观消化率是决定饲料中的蛋白质质量的重要因素(王建学等, 2021)。本研究中，Met、Ile、Leu、His、Arg和Tyr的表观消化率均有显著变化，其中，Ile、Leu、Arg和Tyr含量随着EKP含量的升高呈先升高后下降的趋势，Ile、Leu、Arg含量均在EKP添加量为3%组达到最大，说明低EKP添加提高了幼参对以上4种氨基酸的吸收效率，从而导致氨基酸之间消化的差异性。

本研究表明，随着饲料中EKP含量的增加，各组之间体壁水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量均无显著影响，说明添加EKP并不影响各营养素在幼参体壁的沉积保留。已知组织中氨基酸水平受到饲料中蛋白质质量的影响(Takeshi et al, 2000)，从氨基酸角度分析，与对照组相比，饲料中EKP的适量添加提高了幼参体壁中Met和Cys含量，原因是Met和Cys的表观消化率的变化，氨基酸消化吸收程度越高，对幼参体壁氨基酸沉积的影响也就越大。

在饲料中添加适量的EKP能显著提高幼参肠道蛋白酶和淀粉酶活性，有助于幼参对蛋白质和糖类的消化吸收，进而影响幼参生长。海带粉经酶解处理后释放了非淀粉多糖和大分子蛋白质，使还原糖和可溶性蛋白含量显著提高，幼参更容易吸收，从而诱导性的提高幼参肠道中蛋白酶和淀粉酶活性。但是幼参肠道脂肪酶并不受EKP添加的影响，其原因是酶解处理后的酶解海带粉脂肪的含量并没有发生明显的变化。

水产动物利用葡萄糖的方式与哺乳动物类似，都是糖酵解和糖异生协同发挥作用，以维持动物体内葡萄糖的稳态(Sergio et al, 2012)。GK和PK是糖酵解途径中两个关键性限制酶，由于GK的K_m值很低，只有在细胞内葡萄糖浓度足够高时才有效，因此，GK的活性可作为判断细胞对葡萄糖利用的指标。PEPCK是糖异生途径的催化酶，可以将乳酸和氨基酸等非糖类物质经糖异生途径转化为葡萄糖，维持机体内葡萄糖的稳态。本研究中，当EKP含量从0提高到9%时，GK和PK活性显著升高，当EKP含量从12%到15%时，GK和PK活性显著降低，这表明适量的EKP对刺参糖酵解有促进作用。PEPCK活性随着EKP含量的增加呈先升高后下降的趋势，在12%组达到最大值。这说明随着EKP添加量的提高，同时促进了糖酵解和糖异生代谢反应，但当添加量达到12%时，刺参肠道细胞的糖酵解减弱而糖异生过程增强，说明在9%~12%添加水平已经满足刺参对糖的需求，机体内过量的葡萄糖被转运出细胞外。ATP酶在葡萄糖和氨基酸等营养物质的吸收过程中，起着重要的作用。Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶是细胞膜上重要的酶蛋白(段树丽, 2021)，ATP酶活性的升高有助于细胞内能量代谢、离子转运和信息传递，对维持细胞的生理功能有重要的作用。本研究中，幼参肠道中的Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活力均呈现出随着EKP含量的升高而逐渐升高的趋势，这表明饲料中添加EKP提高了营养物质的水解供能。另外，本研究中发现，在中低添加水平下(3%~12%) ALT和AST活性显著升高，但高添加水平则抑制二者的活性。ALT和AST是动物体内蛋白质代谢过程中的2个关键代谢酶，其活力的高低一定程度上反映了机体对蛋白质的合成和分解能力(Yan et al, 2007)。因此，这种现象表明饲料中添加适量的EKP能在一定程度上提高幼参肠道对蛋白质的代谢处理能力，过量添加反而会给幼参肠道增加代谢负担，不利于蛋白的消化。

生物机体内关键性的抗氧化因子主要包括SOD、T-AOC和CAT等。SOD是动物体内关键的抗氧化酶之一，是超氧自由基的天然消除剂，使自由基的形成与消除处于一种动态平衡中，从而避免其对生物分子的损伤等(吴阳, 2012)。T-AOC的强弱与健康程度密切相关，该防御体系由酶促和非酶促2个体系组成，协同防护机体氧化。MDA是多不饱和脂肪酸受氧自由基攻击形成的脂质过氧化产物，反映了细胞的受损伤程度和脂质过氧化程度(Marcelo et al, 2000)。本研究表明，SOD活性随着EKP含量的升高呈先升高后下降的趋势。可能是随着EKP含量的增加，幼参肠道在代谢过程中增强了呼吸链传递通路所介导的能量代谢，从而提高了活性氧的产生，幼参机体为了消除活性氧维持稳态从而提高抗氧化酶的合成速度。当EKP含量过高时，打破了活性氧自由基的动态平衡，对细胞产生一定的毒害作用，从而抑制了SOD的产生。杜以帅(2010)将褐藻寡糖和海藻粉饲喂刺参40 d后，刺参体腔液和体壁中SOD活性有一定程度地提高，并呈先升高后下降的趋势，这与本研究结果一致。Hu等(2021)研究表明，在草鱼(Ctenopharyngodon idella)饲料中添加100~400 mg/kg褐藻酸寡糖，能显著提高SOD和CAT活性，并降低MDA水平，从而提高草鱼的抗氧化能力。本研究中，T-AOC活性随着EKP含量的升高呈先升高后下降的趋势，当EKP添加水平为9%时，T-AOC活性达到最大。与之相反的是，MDA含量随着EKP添加水平的提高呈下降趋势，当EKP含量达到12%时，MDA含量显著升高，MDA含量越高，表明细胞毒性越大，对细胞和机体造成损伤。这表明在幼参饲料中添加EKP不应超过12%，9%以下的添加量有助于提高刺参机体抗氧化能力，并降低脂质过氧化物对细胞的伤害，从而保护机体免受自由基的损伤。

4 结论

综上所述，本实验条件下，以增重率为评价指标，经一元二次回归分析(y=–0.198x²+4.102 9x+60.586)得出，体质量为(11.40±0.04) g的刺参饲料中EKP的最适添加量为10.36%。饲料中添加6%~12% EKP可以提高刺参幼参对营养物质的消化和代谢能力，增强幼参的抗氧化性能，进而促进幼参的生长。

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