刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方重要的海水养殖品种之一，具有较高的经济和营养价值(Roggatz et al, 2018; 曹荣等, 2020; 陈士国, 2010)。其营底栖生活并以沉积物为食，细菌在肠道中占有较大比例，刺参所需70%以上的能量均与细菌有关(Zhou et al, 2009; 廖玉麟, 1997)。肠道菌群与宿主健康生长息息相关，在机体消化代谢(Wu et al, 2012; 陈贞年等, 2021)、防御病原(Moran et al, 2005)和免疫功能(Chi et al, 2014)等方面均起着重要的作用。孙奕等(1989)研究表明，刺参肠道中的假单胞菌属(Pseudomonas)对多糖有较好的降解能力，可以为其提供能量促进生长。陆振等(2017)研究发现，刺参肠道中的芽孢杆菌属(Bacillus)具有降解蛋白质和琼脂的能力，有助于刺参对营养物质的分解利用，促进其健康生长。王伟等(2018)研究发现，刺参肠道中的乳酸片球菌属(Pediococcus)能够产生多肽类抗菌活性物质，这类活性物质对病原菌具有显著的抑制作用。宫魁等(2013)研究发现，刺参肠道中的乳酸菌(Lactobacillus)能够与有害菌竞争营养和空间，同时通过其产生的小分子代谢物，降低肠道内的pH值和氧化还原电位，从而拮抗病原性细菌。周慧慧等(2010)研究证实，刺参肠道菌群中肠球菌(Enterococcus sp.)通过提高肠道中的酶活力，进而增强刺参的免疫水平。

水产动物肠道中复杂的细菌群落主要来自于养殖环境，环境菌群与肠道菌群之间存在着密切的共生关系(陈孝煊等, 2005; 李靖等, 2019; 王轶南等, 2011; 宫晗等, 2023)。理清肠道菌群结构和功能特征及其养殖环境错综复杂的关系，阐明肠道菌群在机体生长中的重要作用，有助于丰富肠道菌群机理研究，探索提高养殖产量的生态调控途径，促进刺参养殖产业绿色健康发展。迄今为止，关于不同养殖模式下刺参肠道菌群结构特征相关方面的研究工作较为普遍。李彬等(2016)基于PCR-DGGE技术解析了池塘养殖刺参肠道内容物、附着基和底泥中菌群结构特征及其相关性。陆振等(2017)采用16S rDNA测序技术进行了池塘养殖和福建吊笼养殖刺参肠道菌群结构特征的对比分析。杨求华等(2016)利用16S rDNA技术研究了南移池塘养殖刺参肠道菌群结构特征。然而，目前关于综合效益最好和管理问题最少的健康高效北方吊笼养殖刺参肠道菌群特征及其与养殖环境菌群相关性方面的报道则较为匮乏。

因此，本研究采用同家系刺参作为研究对象，基于不投饵的吊笼养殖模式使养殖水体成为影响刺参肠道菌群结构的主要影响因素，全面解析北方吊笼养殖刺参肠道菌群结构和功能特征，并初步探讨刺参肠道及其养殖环境菌群相关性，以期为北方刺参吊笼健康养殖提供一定的理论依据。

实验用刺参取自辽宁大连(39°9′28″N；121°33′5″E)，规格为25 g/头，放养密度约为10头/m³，养殖周期为150 d。在无菌环境下，用灭菌解剖剪剪开刺参体壁，取出肠道，用无菌水冲洗干净肠壁组织，将采集到的肠壁组织置于无菌离心管中(每5只刺参肠壁样品混为1管)，分别标记为GDL-1、GDL-2、GDL-3、GDL-4和GDL-5。

利用玻璃采水器采集刺参养殖海域水体样品4 L，经0.22 μm无菌醋酸纤维素滤膜抽滤，用于细菌总DNA的提取。样品分别标记为WDL-1、WDL-2、WDL-3、WDL-4和WDL-5。所有样品均于–80 ℃超低温冰箱冷冻保存。

采用HiPure Soil DNA试剂盒，分别提取刺参肠道和养殖水体细菌总DNA。使用超微量分光光度计检测DNA浓度和纯度，浓度≥50 ng/μL，纯度OD_{260 nm}/ OD_{280 nm}=1.8~2.0。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA，条带清晰、带型完整、无尾迹，表明所提DNA质量合格。

将上述所提取的样本总DNA，以细菌16S rRNA基因V3~V4片段的扩增引物343F (5′-TACGGRAGGC A GCAG-3′)(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和798R (5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)进行PCR扩增。将扩增产物送至欧易生物股份有限公司，基于Illumina Novaseq测序平台和PE250测序策略进行高通量测序。

运用Trimmomatic (Version 0.35)软件，对原始序列进行扫描去杂，截掉质量低于20的序列，并去除长度小于50 bp的序列；使用Flash (Version 1.2.11)软件，对合格序列的reads进行拼接、过滤，得到完整序列；利用QIIME中的Split (Version 1.8.0)软件，去除单碱基重复大于8与长度小于200 bp的序列，质控后用UCHIME (Version 2.4.2)软件检验，去除嵌合体序列得到有效数据。采用Usearch软件将所得到的全部有效序列进行距离矩阵，默认在97%水平下进行OTUs操作分类单元聚类。使用PICRUSt软件，预测已知微生物基因功能。

使用VennDiagram软件(Roux et al, 2016)，绘制Venn图。使用Mothur软件包(Schloss et al, 2009)，分析菌群多样性。基于加权的Unifrac距离算法，计算样本间的相似性。采用RDPclassifier软件(Wang et al, 2007)，统计菌群相对丰度。基于T-test统计方法，检验样本差异显著性(P < 0.05)。

通过高通量测序，刺参肠道和养殖水体10个样品检测得到的原始序列为69 933~87 168条，通过序列优化去杂，过滤长度短、低质量及嵌合体后，得到的有效序列为62 391~78 243条，且有效序列百分比都达到了80.66%以上，覆盖率为98.71%以上(表 1)，表明测序结果可以真实反映样本信息。

表 1(Tab.1)

表 1 高通量测序结果 Tab.1 Analysis of the high-throughput sequencing results 样品 Sample 有效序列 Effective tag 有效序列百分比 Effective tag percent/% 覆盖 率Goods coverage/% OTU数目 OTU number WDL1 72 506 89.65 98.98 752 WDL2 62 391 89.22 99.14 630 WDL3 63 167 90.13 99.05 681 WDL4 72 408 90.77 99.04 679 WDL5 75 523 89.38 99.02 697 GDL1 76 609 88.04 98.80 1 476 GDL2 75 411 90.48 98.98 1 609 GDL3 78 243 89.76 98.71 1 591 GDL4 78 131 91.38 99.05 1 332 GDL5 68 113 80.66 99.12 998

表 1 高通量测序结果 Tab.1 Analysis of the high-throughput sequencing results

菌群丰度常以Chao1和ACE指数来表示，多样性常以Shannon和Simpson指数来衡量。如图 1所示，吊笼养殖刺参肠道与养殖水体菌群的丰度和多样性均呈现出显著性差异(P < 0.05)。具体表现为刺参肠道菌群丰度和多样性均显著高于水体菌群。

图 1(Fig. 1)

图 1 养殖水体和刺参肠道细菌群落丰富度和多样性 Fig.1 Richness and diversity of bacterial communities in the gut of A. japonicus and culture water **表示差异极显著(P < 0.01)；*表示差异显著(0.01 < P < 0.05)；无标注则为不显著(P > 0.05)。 ** indicates highly significant difference (P < 0.01); * indicates significant difference (0.01 < P < 0.05); no marks indicates no significant difference (P > 0.05).

等级分布曲线(rank abundance)用于同时解释样品中细菌多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。由图 2可知，刺参肠道细菌多样性高于水体样品，肠道中存在相对丰度明显占优的细菌种类。

图 1(Fig. 1)

图 2 各样品中细菌多样性的等级分布曲线 Fig.2 Rank-abundance curves based on the OTU species number in each sample

Beta多样性可以反映刺参肠道和水体样品在不同分组上细菌群落的相似性和差异性。在OTU水平上，基于加权Unifrac距离对10个样本进行三维主坐标分析。通过三维PCoA分析评估样本间菌群结构相似性(图 3)。第一主坐标(PCoA1)的贡献率为90.35%，第二主坐标(PCoA2)的贡献率为6.39%，合计总贡献率为96.74%。不同组别样品分散于不同象限，表明2个样品组间菌群结构具有显著性差异(P < 0.05)。组内样品大多聚集在一起，显示出较好的生物学重复性。

图 1(Fig. 1)

图 3 刺参肠道(GDL)及养殖水体(WDL)菌群Unifrac PCoA图 Fig.3 Unifrac PCoA map of the bacterial community about the gut of A. japonicus (GDL) and culture water (WDL)

根据OTUs聚类分析结果，选取样品中有效的OTUs，绘制得到韦恩图(图 4)，比较刺参肠道和养殖水体样品间的差异。结果显示，刺参肠道和养殖水体样本共有895个OTUs，刺参肠道组特有2 299个OTUs，而养殖水体中特有641个OTUs。刺参肠道和养殖水体样品细菌种类分别占总细菌种类的83.28%和40.05%，肠道和养殖水体特异菌群丰度在各样品中分别占比71.98%和41.73%。结果显示，刺参肠道所检测到的菌群种类更加丰富。

图 1(Fig. 1)

图 4 刺参肠道(GDL)及其养殖水体(WDL)菌群OTUs韦恩图 Fig.4 OTUs plot about bacterial community in the gut of A. japonicus (GDL) and culture water (WDL)

将核心菌群定义为刺参肠道和养殖水体所有样本都共有的菌群，任何一个样品不含有的菌属都需要排除(李淑贤等, 2022)。经过分析，相对丰度大于0.1%的共有核心菌群有13个属(表 2)。这些菌属主要分布在变形菌门(Proteobacteria)，也有一些分布在拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。

表 2(Tab.2)

表 2 相对丰度大于0.1%的共有核心菌属 Tab.2 The core bacterial genera shared by all samples with relative abundance above 0.1% 门Phylum 科Family 属Genus 水体WDL 肠道GDL 变形菌门Proteobacteria Clade_I Clade_Ia 46.45% 1.59% 变形菌门Proteobacteria Ambiguous_taxa Ambiguous_taxa 5.87% 7.09% 变形菌门Proteobacteria uncultured uncultured 2.20% 7.52% 变形菌门Proteobacteria uncultured_bacterium uncultured_bacterium 1.20% 3.32% 变形菌门Proteobacteria 红杆菌科Rhodobacteraceae 亚硫酸杆菌属Sulfitobacter 0.86% 2.09% 变形菌门Proteobacteria 红杆菌科Rhodobacteraceae 陆丹氏菌属Loktanella 0.38% 1.86% 变形菌门Proteobacteria Clade_Ⅲ OM60(NOR5) clade 0.44% 0.42% 拟杆菌门Bacteroidetes 拟杆菌科Bacteroidaceae 拟杆菌属Bacteroides 0.13% 8.80% 变形菌门Proteobacteria 红杆菌科Rhodobacteraceae Planktomarina 7.57% 0.15% 变形菌门Proteobacteria Halieacese 海泥海球菌属Halioglobus 0.19% 4.89% 放线菌门Actinobacteria Unknown_Family Candidatus_Aquiluna 1.43% 0.19% 拟杆菌门Bacteroidetes 黄杆菌科Flavobacteriaceae Ulvibacter 0.16% 0.22% 拟杆菌门Bacteroidetes 黄杆菌科Flavobacteriaceae Fluviicola 0.19% 0.14%

表 2 相对丰度大于0.1%的共有核心菌属 Tab.2 The core bacterial genera shared by all samples with relative abundance above 0.1%

在门水平上(图 5a)，刺参肠道和养殖水体的第一优势菌门均为变形菌门，相对丰度占比分别为47.91%和79.05%；次优势菌门为拟杆菌门，相对丰度占比分别为28.57%和12.09%。刺参肠道中变形菌门和拟杆菌门占优势地位，其相对丰度之和高达76.48%。此外，还检测出厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、芽单孢菌门(Gemmatimonadetes)和Epsilonbacteraeota等。

图 1(Fig. 1)

图 5 刺参肠道(GDL)和养殖水体(WDL)优势菌群在门(a)和属(b)水平上的相对丰度 Fig.5 Relative abundance of the dominant bacterial in the gut of A. japonicus (GDL) and culture water (WDL) at the phylum (a) and genus (b) levels

在属水平上(图 5b)，拟杆菌属(Bacteroides)和海泥海球菌属(Halioglobus)为刺参肠道的主要代表菌属，其相对丰度占比分别为8.80%和4.89%。此外，Lutimonas、Woeseia、亚硫酸杆菌属(Sulfitobacter)和陆丹氏菌属(Loktanella)，相对丰度占比分别为3.57%、2.21%、2.09%和1.86%。养殖水体优势菌属则以Clade_Ia、Planktomarina、NS3a_marine_group、NS5_marine_group、亚硫酸杆菌属和陆丹氏菌属为代表，其相对丰度占比分别为46.45%、7.57%、4.05%、2.26%、0.86%和0.38%。

刺参肠道及其养殖水体差异菌群分析结果如图 6所示，在门水平上，刺参肠道检测出的特异性菌门主要为拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)及芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)；养殖水体特异性菌门主要隶属于变形菌门。

图 1(Fig. 1)

图 6 刺参肠道(GDL)及养殖水体(WDL)差异菌群LEfSe分析 Fig.6 LEfSe analysis about the specific bacterial community of the A. japonicus gut (GDL) and culture water (WDL)

在属水平上(图 6)，刺参肠道的特异性菌属主要为芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、海泥海球菌属(Halioglobus)、Lutimonas、Woeseia和动性球菌属(Planococcus)等；养殖水体特异性菌属则主要隶属于Clade_Ⅱ、NS7_marine_group、NS9_marine_group、NS11_12-marine_group和Planktomarina等。

基于KEGG代谢通路数据库，共注释到300条三级代谢通路，2组样本在其中146条差异代谢通路存在极显著差异(P < 0.001)。对丰度排名前30的三级差异代谢通路进行分析(图 7)，其中，刺参肠道中特有的三级代谢通路主要表现为碳水化合物消化吸收(carbohydrate digestion and absorption)、蛋白酶体(proteasome)、RNA转运(RNA transport)、蛋白质消化吸收(protein digestion and absorption)、鞘脂类代谢(sphingolipid metabolism)和初级胆汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)等。养殖水体中的特异性三级代谢通路具体表现为四环素生物合成(tetracycline biosynthesis)、抗坏血酸和盐酸的代谢(ascorbate and aldarate metabolism)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol signaling system)、磷酸肌醇代谢(inositol phosphate metabolism)和安沙霉素类生物合成(biosynthesis of ansamycins)等。

图 1(Fig. 1)

图 7 KEGG三级代谢通路刺参肠道(GDL)和养殖水体(WDL)特异性代谢通路的分级聚类热图 Fig.7 Hierarchically clustered heatmap of the specific metabolic pathways of the A. japonicus gut (GDL) and culture water (WDL) at the KEGG C level 上面的聚类分支代表样本来自不同的分组，左侧聚类树代表功能的分类，红色表示菌群功能相对丰度较高，蓝色表示菌群功能相对丰度较低。 The cluster branches above represent samples from different groups, the cluster tree on the left represents the classification of functions, red indicates that the relative abundance of bacterial community function is relatively high, and blue indicates that the relative abundance of bacterial community function is relatively low.

微生物作为海洋生态系统中的主要分解者，推动着生态系统物质循环和能量流动，对于维持生态系统平衡及养殖生物健康等方面起着十分重要的作用(李革雷等, 2012)。开展刺参肠道及其养殖水体菌群特征研究，不仅可以为养殖过程中病害防治及污染治理提供一定的理论支撑，还可以为养殖环境微生态调控构建提供一定的实践基础。

本研究中，刺参肠道及其养殖水体样品中相对丰度占比前10位的优势细菌种类基本一致，且优势菌群均主要隶属于变形菌门和拟杆菌门。该结果与已报道的福建吊笼养殖刺参(陆振等, 2016)和池塘养殖刺参(丁斯予等, 2019)肠道优势菌门相一致，表明不同地域和不同养殖模式下，变形菌门和拟杆菌门均作为核心菌群存在于刺参肠道及养殖水体中。变形菌门作为细菌中最大和最具多样性的一个族群，具有较强的适应性和丰富的代谢多样性，在生物化学物质循环过程中起重要作用(白洁等, 2009; 刘思亮等, 2002; Gupta, 2000)，同时还可以产生多种消化酶分解各种纤维素和半纤维素，以帮助宿主从食物中消化吸收养分(Rimoldi et al, 2018; Morriso et al, 2009; 杨坤杰等, 2016)。拟杆菌门作为微生物群落中最大的革兰氏阴性菌，具有水解淀粉和几丁质的能力，可帮助宿主降解碳水化合物、蛋白质和大量宿主本身难以消化的植物多糖等其他物质，为宿主提供能量，促进生长，对生物体内肠道健康平衡具有积极作用(Gibiino et al, 2018; Cottrell et al, 2000; O'Sullivan et al, 2002; Sonnenburg et al, 2005)。变形菌门和拟杆菌门作为核心菌群大量存在于刺参肠道和养殖水体中，对维持养殖环境微生态平衡和刺参机体健康具有重要作用。

不同环境介质中所具有的不同生活条件，以及某些菌群特定的生物学功能限制会导致特异性菌群的产生，这些特异性菌群也会对宿主产生一定的影响(Zhou et al, 2022)。本研究中，刺参肠道中特异性菌属有158种，且多数为厌氧和需盐种类，以芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、海泥海球菌属、Lutimonas和Woeseia等为代表。

据报道，芽孢杆菌(Bacillus)属革兰氏阳性菌，含有较高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，对有机物质具有很强的降解能力，可以产生抗逆性的芽孢，促进蛋白质和脂肪在胃肠道的消化吸收，调节肠道菌群平衡，在维持动物肠道和促进机体健康生长中起重要作用(董春光等, 2015)。在动物肠道以及水体中增加芽孢杆菌的比例，可显著提高水产动物对饲料的利用率，改善生长性能和体成分，提高机体的抗氧化能力和免疫能力，抑制有害菌的生长，提高水产动物的产量(Gullian et al, 2004; Ziaeinejad et al, 2006; Kennedy et al, 1998; 张干等, 2019)。因此，芽孢杆菌现已作为益生菌在水产动物中得到普遍应用(Gomez-Gil et al, 2000; Hong et al, 2005; 姜燕等, 2022; 杜佗等, 2017)。乳酸杆菌属对病原菌具有较强的抑制作用，不仅可以分泌乳酸、过氧化氢和细菌素等抗菌化合物，改变细胞膜渗透性，抑制病原菌的生长(Xin et al, 2020)，还可以与肠道内的病原菌竞争营养物质或粘附位点，从而达到抑制病原菌的作用(Nikoskelainen et al, 2001)。Yan等(2007)研究发现，乳酸杆菌能保护肠道上皮细胞，鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分泌的2种蛋白p75和p40均能抑制细胞因子诱导的上皮细胞凋亡，并显著降低TNF-α引起的肠上皮细胞损伤。此外，乳酸杆菌还可以增强肠道上皮的屏障功能，调节黏膜免疫系统，从而发挥调节肠道微生态的作用。Martin等(2008)研究发现，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)可以产生结肠黏膜细胞的重要能量来源，从而维持结肠上皮细胞的健康，增强肠道上皮的屏障功能，为宿主营造一个健康的肠道微生态环境，有效防止有害微生物对宿主的侵染。刺参肠道中存在的大部分特异性菌群可通过自身生理活动影响宿主的营养、代谢、免疫等生理过程，对机体的生长健康尤为重要。

本研究基于KEGG差异代谢通路分析得出，刺参肠道菌群的功能主要表现在碳水化合物消化吸收、蛋白质消化吸收、鞘脂类代谢和初级胆汁酸生物合成等与新陈代谢相关通路的差异化表达。其中，值得注意的是三级代谢通路中碳水化合物消化吸收在刺参肠道内显著上调。曾晨爔等(2020)研究表明，菌群功能可以反映出细菌群落整体代谢水平。碳水化合物消化吸收通路的显著上调可能与刺参肠道内检测到较高相对丰度的拟杆菌门(相对丰度28.57%)和厚壁菌门(相对丰度8.09%)细菌相关。研究表明，拟杆菌门细菌可以刺激肠道内壁产生岩藻糖基化聚糖，通过碳水化合物分子水解获得碳和能量，在发酵碳水化合物的同时有效分解纤维壁的多糖，从而增强宿主对营养物质的消化吸收，提高营养利用率(刘荣瑜等, 2022; 黄媛媛等, 2022)。厚壁菌门细菌在碳水化合物的营养代谢过程中发挥着重要的作用，具有多种与淀粉降解酶有关的基因，通过分解纤维素产生挥发性脂肪酸，帮助刺参消化吸收营养物质(McDermott et al, 2014; Hooper, 2004; Sears, 2005; 杨求华等, 2016)。刺参生长过程对碳水化合物、蛋白质和脂类物质需求较高(Xia et al, 2015)，其肠道内含有大量微生物群落，能够产生和分泌多种酶类，具有消化和转化营养物质的功能。然而，引起刺参机体碳水化合物、蛋白质、鞘脂类等有机物的消化代谢不仅仅是由单一细菌产生的，而是多种细菌群落共同作用的结果，其相关机制还有待进一步研究。

综上所述，刺参肠道与环境优势菌群组成存在一定的相关关系，同时也表现出独特的结构和功能特征。本研究仅局限于考虑刺参养殖水体单一环境介质，后续将进一步结合投喂饵料情况开展吊笼养殖刺参肠道微生物群落动态变化研究，以期为北方刺参吊笼健康养殖提供一定的理论参考。